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专题06 基因工程类
1．（2024·山东泰安·二模）为获得转R—GFP 融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因（RFP）
插入含Gata3 基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一
只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP 转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限
制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R 为不同引物。
(1)在PCR 反应溶液中常添加 ，其作用是 。在利用PCR 扩增RFP 编码区序列的过程中，需要设计引
物F 和R，在两个引物的（填“3'”或“5'”） 端需分别插入 的限制酶识别序列，以使RFP 基因能正确
插入载体中。用于扩增RFP 编码区序列的引物需满足的条件是 。
(2)在RFP 基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有 。
(3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，选取1～5 五只小鼠，从中提取含
Gata3 基因的相关DNA 片段，设计了引物A 和C 用于PCR 扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则 小
鼠是Gata3—RFP 基因纯合子小鼠；若用引物A 和B 进行PCR 扩增， （填“能”或“不能”）区分
RFP 转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是 。
(4)为制备大量单链DNA 片段，研究人员常采用不对称PCR 技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，
经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引
物）的延伸产物，结果获得大量单链DNA（ss—DNA）。若反应体系中原有100 个模板DNA，最初10 个
循环后限制性引物耗尽，再进行20 个循环，理论上可制备ss—DNA 个（用科学计数法表示），在这30
个循环中ss—DNA 的产生量主要受 的影响。
【答案】(1) Mg2+ 激活DNA 聚合酶的活性 5' Sal Ⅰ、EcoR Ⅰ 分别与两条模板链
（RFP 编码区序列）3'端的碱基序列互补
(2)Taq DNA 聚合酶、DNA 连接酶、限制酶
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(3) 1 和5 不能 两种阳性小鼠提取的相关DNA 片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带
(4) 2.048×106 限制性引物和非限制性引物比例
【分析】选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的
抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向
连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
DNA 重组技术的基本工具包括 “分子手术刀”--限制酶、“分子缝合针”--DNA 连接酶、“分子运输
车”--基因进入受体细胞的载体。
【详解】（1）PCR 的全称是聚合酶链式反应，真核细胞和细菌细胞的DNA 聚合酶的活性需要Mg2+来激
活，所以PCR 反应溶液中添加Mg2+，其作用是激活DNA 聚合酶的活性。若要对RFP 基因进行扩增，需
在引物的5’端添加限制酶识别序列，因为引物对应区段也属于调控序列，若在3’端添加限制酶识别序列，
会导致限制酶的切割位点位于调控序列内部，进行相应酶切时，调控序列会被破坏。RFP 基因的终止子在
右侧（即转录方向为从左到右），故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计的时候：R 引物末端插入对
应下方载体的Xho Ⅰ酶切位点，F 引物末端插入对应下方载体的Mun Ⅰ酶切位点，又因为RFP 基因中含有
的Xho Ⅰ位点，因此不能用Xho Ⅰ酶来切，否则会破坏基因序列。结合题干当中所给的5 种限制酶的识别序
列，Xho Ⅰ和Sal Ⅰ互为同尾酶；Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ互为同尾酶（即切割不同的DNA 片段但产生相同的黏性末
端的一类限制性内切酶）。因此可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F 末端添加的序列所对
应的限制酶应选择Sal Ⅰ，这样可以与下方载体中Xho Ⅰ的酶切位点结合；同理R 末端应选用与Mun Ⅰ同尾
的EcoR Ⅰ剪切。这样利用产生相同黏性末端的同尾酶对扩增产物和载体进行酶切，可以保证既能得到有效
片段，又能使之正确转录。引物是能够与DNA 母链特定的碱基序列互补配对的单链核酸片段，由于扩增
目的基因时有两条模板链，设计引物时，两种引物要分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。
（2）在RFP 基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要限制酶，且载体构建过程中用到DNA 扩增技术，
所以还需要Taq DNA 聚合酶，载体构建完成还需要DNA 连接酶将DNA 片段连接起来。
（3）Gata3-RFP 基因为大片段，故结合图乙可知1 小鼠是Gata3-RFP 基因纯合子小鼠。由图乙可知，RFP
转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子两种阳性小鼠提取的相关DNA 片段扩增产物的电泳结果均只有一条
条带，故用引物A 和B 进行PCR 扩增，不能区分RFP 转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子。
（4）100 个模板DNA，最初10 个循环后限制性引物耗尽，再进行20 个循环，理论上可制备Ss-DNA：
100×20×210=2.048×106。根据题干“经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循
环只产生高浓度引物（非限制性引物）的延伸产物”可知，该过程中ss-DNA 的产生量主要受限制性引物
和非限制性引物比例的影响。
2．（2024·江苏南通·二模）人类y 基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合
BCL11A 蛋白后，y 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对y 基因表达的抑制，可对某
种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载
体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
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(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，
在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。PCR 缓冲
体系中除图示条件外还要加入 （至少2 个）。获得扩增产物后，应选择限制酶 切割载体。本实验
中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入 （选填“保留”、“除去”）BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6
与R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R 扩增产物的受体细胞无荧光。据图分析，
构建成功的基因表达载体上荧光蛋白基因和BCLIIA 基因转录时的模板链在 （选填“相同”、“不
同”）的DNA 链上，含F7与R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的 ，含F1～F4与R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R 扩增产物
的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点
序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 在调控序列上所对应序列之间的区段上，理
由是 。
【答案】(1) SalI EcoRI dNTP、耐高温的DNA 聚合酶、Mg2 XhoI、MunI 6
(2) 除去 不同 F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3) 雌激素 F4、F5 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位
点位于F4 所对应调控序列的下游 F5～F6 与R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5 所对
应调控序列的上游，所以结合位点位于引物F4 与F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7 以及R 位
置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1 和引物R 之间的序列，引物F2 和引物R 之间的序列，引物F3
和引物R 之间的序列，引物F4 和引物R 之间的序列，引物F5 和引物R 之间的序列，引物F6 和引物R 之
间的序列，引物F7 和引物R 之间的序列；
2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的
黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的
扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R 端与荧光蛋白基因中限制
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酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，
需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增
后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶
Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释
可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端
添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；PCR 缓冲体
系中除图示条件外还要加入dNTP、耐高温的DNA 聚合酶、Mg2+等；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ
的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切
割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA 连接酶的催化作用下，连接
形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个
过程共需要6 种酶，分别是Taq 酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA
连接酶；
（2）将构建的载体导入除去BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6 与R 扩增产物的载体表达
荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7 与R 扩增产物的受体细胞无荧光。据图分析，构建成功的基因表达载
体上荧光蛋白基因和BCLIIA 基因转录时的模板链在不同的DNA 链上；含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体
表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7 与R 扩增产物不
含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白，
BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的
受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4 与引物R 之间的序列上；含 F5～F6
与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5 的上游序列，故据此
结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
3．（2024·黑龙江大庆·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，从而导致可溶
性糖含量高，汁多质脆，研究发现这与甜玉米G 蛋白含量较高有关。为提高甜玉米的商品价值，科研人员
培育出了超量表达G 蛋白的转基因甜玉米新品种。在超量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti
质粒的酶切位点如图1、2 所示。
(1)图1 中，强启动子是一段在特殊序列结构的DNA 片段。位于基因的 驱动基因持续转录，该转录
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过程中模板链的5’端位于 （填“M”或“N”）端。
(2)图2 所示载体为农杆菌的Ti 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的 转移到被侵染
的细胞，并且将其整合到 。
(3)结合图1 和图2，为使DNA 片段能定向插入Ti 质粒中，可用PCR 技术在DNA 片段的两端添加限制酶识
别序列，M、N 端添加的序列分别是限制酶 的识别序列。
(4)外植体经脱分化过程形成的愈伤组织放入农杆菌液（含重组Ti 质粒）浸泡后，进行植物组织培养时培养
基中需加入 进行筛选，最终获得玉米植株Y1、Y2、Y3.通过对3 个植株的G 蛋白表达量和还原
糖的含量进行测定，发现Y3 植株的G 蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，原因可能是
。
(5)下图为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA 需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后
方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将
吗啉反义寡核苷酸（RNA 剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制
提出一种假说：吗啉反义寡核苷酸可能导致RNA 前体上内含子1 和外显子2 的对应序列同时被剪切，而不
是内含子1 对应序列被单独剪切。（外显子：基因中编码蛋白质氨基酸的片段。内含子：基因中不编码蛋
白质氨基酸的片段。）
为证明该假说，设置两组实验，一组玉米受精卵中导入吗啉反义寡核苷酸，另一组不导入。提取两组受精
卵中的RNA，逆转录合成DNA（即cDNA）：
①以cDNA 为模板，选择图示引物 进行PCR，产物进行电泳鉴定，根据是否有扩增产物及产物大
小判断该假说是否成立。
②若某次电泳结果发现实验组和对照组均没有出现任何条带，从PCR 反应成分的角度分析，
可能的原因是 （至少写出1 点）。
【答案】(1) 上游 M
(2) T-DNA 该细胞的染色体DNA 上
(3)NotⅠ和SacⅠ(顺序不能颠倒）
(4) 卡那霉素 Y3 植株玉米中G 蛋白活性较低（合理即可）
(5) 2 和5 漏加了PCR 反应成分（或反应成分用量不当；或引物设计不合理；合理即可）
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
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【详解】（1）强启动子是一段在特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游；在基因表达载体的构建时，
G 基因位于启动子的下游，转录时RNA 聚合酶和启动子结合，N 端是DNA 链的3’端，子链延伸的方向是
5’端到3’端，因此模板链的5’端位于M 端。
（2）当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒的T-DNA 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染
色体DNA 上。
（3）为使G 基因在玉米植株中超量表达，应确保强启动子和G 基因不被破坏，故应优先选用EcoRⅠ和
BamH Ⅰ酶切割质粒，为保证强启动子和G 基因能连在质粒上，M、N 端添加的序列所对应的限制酶分别是
NotⅠ和SacⅠ酶，然后再用DNA 连接酶将强启动子和G 基因与质粒连接。
（4）由图2 可知，卡那霉素抗性基因位于T 质粒的T-DNA 中，随T-DNA 整合到该细胞的染色体DNA 上，
所以进行植物组织培养时培养基中需加入卡那霉素进行筛选。筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最
终获得多个转基因玉米株系。发现Y3 植株的G 蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，可能
Y3 植株玉米中G 蛋白活性较低。
（5）①若要证明假说成立，即RNA 前体上外显子2 的对应序列同时被剪切下去，则可以选择图示2 和5
进行PCR，观察是否有杂交带出现，如果RNA 前体上外显子2 的对应序列同时被剪切下去，PCR 后电泳
不会出现杂交带。
②从PCR 反应成分的角度分析，漏加了PCR 反应成分（或反应成分用量不当；或引物设计不合理）均会
导致电泳后的实验组和对照组没有任何条带出现。
4．（2024·浙江宁波·二模）草甘膦是一种除草剂，但会影响水稻产量。水稻产量与高产基因有关，研究人
员拟采用农杆菌转化法对水稻高产基因进行定位，并进一步培育能稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。
回答下列问题：
Ⅰ.水稻高产基因定位水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌 Ti 质粒的 T－DNA 可以转移并随机插入野生型
水稻基因组中（可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点），导致被插入的基因功能丧失，从而
得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体，并进行下列研究。
(1)提取 DNA。采集适量突变体和野生型水稻的幼嫩叶片，分别冷冻后研磨成粉末状，依次加入SDS、
RNA 酶等试剂，去除蛋白质和 等大分子杂质。提取过程中需加入 酶抑制剂并保持轻柔操作，以
避免 ，从而提高总 DNA 提取率。
(2)PCR 扩增。对提取获得的两组总DNA 分别进行PCR 扩增。为避免外源DNA 等因素的污染，微量离心
管、枪头和蒸馏水等在 PCR 前需进行 处理。可以通过在紫外灯下直接观察电泳结果中DNA 条带的
及粗细程度来评价扩增是否成功。
(3)结果鉴定。分别用EcoRI、Hind Ⅲ、BamHI 三种限制酶处理突变体总DNA 扩增产物，处理后进行电泳，
并与野生型 DNA 和 Ti 质粒对照。电泳后的 DNA 与含放射性同位素标记的 DNA 探针（T－DNA 的一
条单链） 进行杂交，得到突变体总 DNA 不同酶切处理后的放射性检测结果如图1 所示。
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①不同酶切结果的杂交带位置不同的原因是：不同酶切后含 的片段长度不同，因此各组 DNA 片段在
凝胶中电泳时的 不同，最终导致分布于不同位置。
②若杂交结果显示突变体在不同限制酶处理时均出现杂交带，野生型组 （填“有”或“无”） 杂交
带， Ti 质粒组 （填“有”或“无”） 杂交带，则表明T－DNA 成功插入水稻染色体基因组中，且
可判断突变体为T－DNA 位点插入，依据是 。（注：T－DNA 上没有 EcoRI、HindⅢ、BamHI
三种限制酶的酶切位点）。
(4)用某种限制酶处理突变体的DNA（如图2 所示），断开DNA 分子中的 个磷酸二酯键，再用 将
两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用下表中的引物①②进行 PCR，扩增出 序列，扩增产物
（填“不含”或“含”）T－DNA 完整序列。经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T－DNA 插入2
号染色体上的B 基因中。
T-DNA 序列
引物序列
5ˊ-AACTATGCGC…….CGTAGCCTAT-3ˊ
①5ˊ-
GCGCATAGTT-3ˊ
3ˊ-TTGATACGCG…….GCATCGGATA-5ˊ
②5ˊ-
CGTAGCCTAT-3ˊ
(5)研究发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测 B 基因可 （填“促进”或“抑制”） 水稻穗
粒的形成，可控制高产性状。
Ⅱ.抗草甘膦高产水稻培育，研究者构建如图3 所示的Ti 表达载体，采用农杆菌转化法将抗草甘膦基因R 和
基因B 转入野生型水稻中，培育稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。
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(6)转基因技术的理论基础有：T－DNA 和水稻 DNA 均为 结构、生物界共用一套 等。
(7)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti 质粒中的CaMV35S 是 ，其功能是 酶的识别和结合部位。
Ti 表达载体中，B 基因和R 基因转录的模板链的方向 （填“相同”或“相反”）。
(8)现需选出单一位点插入R 基因和B 基因且稳定遗传的水稻新品种，筛选方案如下：
①转基因后的水稻植株自交，收获种子（F₁） 并播种在含 的选择培养基上，若能够萌发并生长的个体
即为 的个体；
②F₁ 存活个体自交所得种子（F₂） 按单株收种并播种于选择培养基上，选择存活率约 的培养基中的
幼苗继续培养获得F₂ 植株；
③将F₂ 植株自交所得种子（F₃）按单株收种并播种于选择培养基上，选择种子全部存活的培养基中的幼苗
即为单一位点插入且 的抗草甘膦植株。
④为实现最终育种目标，研究人员还需检测 。
【答案】(1) RNA DNA DNA 被分解或断裂
(2) 高压蒸汽灭菌 位置
(3) T-DNA 迁移速率 无 有 单一 用三种不同限制酶处理都只得到一条杂交带，
而野生型无杂交带
(4) 4 DNA 连接酶 T-DNA 插入位点两侧的突变体DNA 未知序列 不含
(5)促进
(6) 双螺旋 遗传密码
(7) 启动子 RNA 聚合 相反
(8) 草甘膦 成功表达R 基因 75% 稳定遗传 转基因水稻植株的产量是否增加
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目
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的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）采集适量突变体和野生型水稻的幼嫩叶片，分别冷冻后研磨成粉末状，依次加入SDS、
RNA 酶等试剂，去除蛋白质和RNA 等大分子杂质。提取过程中需加入DNA 酶抑制剂并保持轻柔操作，以
避免DNA 被分解或断裂，从而提高总 DNA 提取率；
（2）PCR 是进行DNA 的扩增，为避免外源DNA 等的污染，PCR 实验中使用的相关器具如微量离心管、
枪头、缓冲液和蒸馏水等应提前进行高压蒸汽灭菌处理，可以通过在紫外灯下直接观察电泳结果中DNA
条带的位置及粗细程度来评价扩增是否成功；
（3）①不同酶切结果，杂交带的位置不同，这是由于不同酶切后含T-DNA 的片段长度不同，因此各组
DNA 片段在凝胶中电泳时的迁移速率不同，最终导致分布于不同位置；②若杂交结果显示突变体在不同限
制酶处理时均出现杂交带，野生型组无杂交带， Ti 质粒组有杂交带，则表明T－DNA 成功插入水稻染色
体基因组中，且可判断突变体为T－DNA 单一位点插入，依据是用三种不同限制酶处理都只得到一条杂交
带，而野生型无杂交带；
（4）用某种限制酶处理突变体的DNA，断开DNA 分子中的4 个磷酸二酯键，再用DNA 连接酶将两端的
黏性末端连接成环，以此为模板，利用引物①②进行 PCR，扩增出T-DNA 插入位点两侧的突变体DNA 未
知序列，扩增产物不含T－DNA 完整序列；
（5）由于该突变体产量明显低于野生型，而突变体内B 基因由于插入了T-DNA 导致功能丧失，据此推测
B 基因促进水稻穗粒的形成；
（6）转基因技术的理论基础有：T－DNA 和水稻 DNA 均为双螺旋结构、生物界共用一套密码子等；
（7）基因表达载体的结构应该包括启动子、 终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可
知CaMV35S 是启动子，功能是RNA 聚合酶识别和结合的位点。RNA 聚合酶的移动方向是从启动子移向
终止子，故两个基因编码链方向相反；
（8）①转基因后的水稻植株自交，收获种子（F₁） 并播种在含草甘膦的选择培养基上，若能够萌发并生
长的个体即为成功表达R 基因；②F₁ 存活个体自交所得种子（F₂） 按单株收种并播种于选择培养基上，
选择存活率约75%的培养基中的幼苗继续培养获得F₂ 植株；③将F₂ 植株自交所得种子（F₃）按单株收种并
播种于选择培养基上，选择种子全部存活的培养基中的幼苗即为单一位点插入且稳定遗传的抗草甘膦植株；
④为实现最终育种目标，研究人员还需检测转基因植株的产量。
5．（2024·山东枣庄·二模）fat1 基因和fat2 基因控制的酶分别调控两种多不饱和脂肪酸的合成，两种酶的
共同表达对于细胞内多不饱和脂肪酸的合成具有协同效应。2A 肽是一种来源于病毒的短肽，受2A 基因序
列控制。2A 基因的转录产物可以通过“核糖体跳跃”断开位于2A 肽尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，将
2A 基因编码的蛋白分割成2 个独立蛋白。图甲表示科研人员利用重叠延伸PCR 技术成功构建融合基因fat1
—2A—fat2 的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1~F4、R1~R4 表示引物。
通过基因工程成功实现了fat1 基因和fat2 基因在小鼠体内的共同表达，大大提高了细胞内多不饱和脂肪酸
的含量。
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(1)利用PCR 技术可以实现在体外快速大量进行DNA 扩增，其与细胞内DNA 复制的共同点是 （答出2
点）。若图乙中融合基因的b 链为模板链，则图甲PCR1 中的引物甲与图乙中的引物 的绝大部分序列相
同。
(2)PCR1 和PCR2 需要分开单独进行，原因是 。PCR3 不需要引物，高温加热后fatl—2A 和2A—fat2 的
双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是 （填序号）形成的杂交链。
(3)为了确定fatl 基因连接到质粒中且插入2A 序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图
乙中的引物_ 。融合基因经下图中的过程表达产生fatl 和fat2 两种蛋白，经检测发现通过该技术表达的fat1
蛋白的分子量较正常fat1 蛋白的分子量大，依据该融合基因的结构和表达原理推测，原因是 。
【答案】(1) 都需要模板、引物、DNA 聚合酶、原料都是脱氧核苷酸(答出2 点即可) R4
(2) 引物甲和引物丁部分碱基互补配对,影响子链的合成 ①、④
(3)F1、R3 fatl 基因后面连接了2A 序列,使fat1 蛋白后面连接了2A 肽的部分片段
【分析】基因工程技术的基本步骤：
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（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）PCR 技术与细胞内DNA 复制的共同点是都需要模板、引物、DNA 聚合酶、原料都是脱氧
核苷酸；若图乙中融合基因的b 链为模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左
向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链(也就是a 链)是5'-3';考虑到DNA 复制的方向是子链的
5’-3'，引物基础上延伸的 方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向 是3'-5'；图中fat1 片段中F1 是前
引物，在左侧，所以其配 对的单链是3’-5'的b 链，故图甲PCR1 中的引物甲与图乙中的R4 链相应部分的
序列相同；
（2）利用重叠延伸PCR 连接fat1 和fat2 基因过程中引物2 和引物3 的侧翼序列是互补配对的，若置于同
一反应体系，会发生结合而失去作用，不能扩增目的基因，因此PCR1 体系与PCR2 体系应分别独立进行；
高温加热后fatl—2A 和2A—fat2 的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是①、④形成的杂交链；
（3）为了确定fatl 基因连接到质粒中且插入2A 序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择
图乙中的引物F1、R3 ；由图可知， fatl 基因后面连接了2A 序列，使fat1 蛋白后面连接了2A 肽的部分片
段，因此该技术表达的fat1 蛋白的分子量较正常fat1 蛋白的分子量大。
6．（2024·浙江温州·二模）为分别建立具有红色荧光与绿色荧光的转基因模型小鼠，科学家进行了如下操
作将红色荧光基因R 插入表达载体A，构建重组表达载体A'，如图所示。其中含R 基因的DNA 片段内部
没有限制酶的酶切位点，R 基因以α 链为模板链。将绿色荧光基因G 插入表达载体B，构建重组表达载体
B'。
回答下列问题：
(1)表达载体上的启动子是 酶的结合位点，能决定基因转录方向，并确定其中的一条链为模板，
若图中表达载体A 和R 基因通过酶切和拼接后能使R 基因成功表达，则其启动子是 。
(2)图中标注相关DNA 片段的长度（kb：千碱基对）。据图分析， （填“可以”或“不可
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以”）通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'，理由是 。
(3)在绿色荧光基因G 内部插入了一个DNA 片段P，会引起G 基因产生 ，但获得的上述转基因
模型鼠依然能表现出绿色荧光的原因有 （回答2 点即可）。为确定导入的基因是否有片段P
的插入，可通过 或 方法进行分析。
(4)将一只红色荧光转基因（导入1 个R 基因）雌性小鼠与一只绿色荧光转基因（导入1 个G 基因）雄性小
鼠杂交获得F1，取F1中同时表现红绿荧光的雌、雄小鼠杂交得F2，统计其表型及比例为同时表现红绿荧光
雌性：红色荧光雌性：同时表现红绿荧光雄性：红色荧光雄性：绿色荧光雄性：无荧光雄性=6：2：3：
1：3：1，则推测导入的R、G 基因分别位于 染色体上。F2雌鼠中纯合子占比为 。
请写出F1中绿色荧光雌性与红色荧光雄性杂交遗传图解（染色体上不含R、G 基因的对应用r、g 表示）
。
【答案】(1) RNA 聚合（酶） （启动子）①
(2) 可以 重组表达载体与其他片段大小不同/重组质粒（质粒A'）分子量与质粒（A）（及目的基
因）的分子量差异较大/大小不同/排除目的基因与质粒切除的小片段连接
(3) 基因突变 片段P 插入G 基因的内含子/非编码序列/非编码区中；表达的蛋白质结构不同但功
能相同 基因测序；核酸杂交技术 PCR 结合电泳技术
(4) X、常 1/4
【分析】1、基因工程的操作步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细
胞、目的基因的检测与鉴定。其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
2、基因表达载体的构建：
(1)过程:一般用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA 连接酶将目的基因和运载体连接形成重组
DNA 分子；
(2)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用；
(3)基因表达载体的组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因；
①启动子在基因的首段，它是RNA 聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；
②终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；
③标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
【详解】（1）启动子在基因的首段，它是RNA 聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始;若图中表达载体
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A 和R 基因通过酶切和拼接后能使R 基因成功表达，则其启动子是①；
（2）据图分析可知，不同长度的DNA 片段的大小不同，因此可以通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'；
（3）在绿色荧光基因G 内部插入了一个DNA 片段P，会引起G 基因结构发生改变，产生基因突变;
如果片段P 插入G 基因的内含子或非编码序列或非编码区中就不会影响绿色荧光基因G 的表达，或者插入
片段P 的G 基因表达的蛋白质结构不同，但功能与原蛋白质相同，基因模型鼠依然能表现出绿色荧光；为
确定导入的基因是否有片段P 的插入，可通过基因测序或核酸杂交技术或PCR 结合电泳技术进行分析；
（4）由题意可知，F1 中同时表现红绿荧光的雌、雄小鼠杂交得F2，F2 中同时表现红绿荧光雌性：红色荧
光雌性：同时表现红绿荧光雄性：红色荧光雄性：绿色荧光雄性：无荧光雄性=6：2：3：1：3：1，比例
为9：3：3：1 的变形，因此红色荧光和绿色荧光基因遵循基因的自由组合定律，且F2 中红色荧光雌性占
2/16（1/8），红色荧光雄性占1/16，说明红色荧光在雌雄中的表现不同，说明红色荧光基因位于X 染色体
上，则绿色荧光基因位于常染色体上，F1 红绿荧光的雌、雄小鼠的基因型分别为GgXRXr、GgXRY，则
F2 雌鼠的基因型及比例分别为GGXRXR：GgXRXR：ggXRXR：GGXRXr：GgXRXr：ggXRXr=1：2：
1：1：2：1，故F2 雌鼠中纯合子（GGXRXR、ggXRXR）占1/4；F1 中绿色荧光雌性（GgXrXr)与红色荧
光雄性(ggXRY)杂交遗传图解如下：
7．（2024·黑龙江齐齐哈尔·二模）利用基因工程方法构建HPV-L1 重组微环DNA，即重组质粒（PP）。图
1 所示为HPV-L1 重组片段的PCR 及重组质粒（PP）的构建过程，HPV-L1 重组微环DNA 包含HPV（人乳
头瘤病毒）的L1 基因片段、编码信号肽的序列以及标签区，将其作为核酸抗原直接免疫产蛋鸡可获得卵
黄抗体，该卵黄抗体可用于HPV 的预防和治疗。利用重叠延伸PCR 技术进行定点突变可以实现对HPV-L1
基因进行合理性改造，引物b 和引物c 为互补重叠序列，其过程如图2 所示。回答下列问题：
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(1)组成质粒ZY781 载体的单体是 ，作为载体除了需要具备复制原点以及一至多个限制酶识别
和切割位点，还需具有 等结构。
(2)HPV-L1 重组片段的PCR 过程中，需要在引物A 和引物B 的5'端分别连接 ，若标签区序列
为
，引物B 的序列为，3'CAGCTGGTAGTAGTGGTAGTGGTA5'，
则引物B 的设计 （填“正确”或“不正确”），理由是 。
(3)图2 的PCR1 过程中，产物AB 是依赖引物对 扩增的结果，②过程首先使用热稳定性DNA
聚合酶进行延伸，再使用引物对 进行PCR 扩增。
(4)L1 基因片段编码HPV 的主要抗原蛋白，将编码信号肽的序列与L1 基因片段连接一起构建重组微环
DNA 的目的是 。
(5)利用质粒ZY781 构建重组质粒（PP）时，选用限制酶BglⅡ和SalI 切割质粒后，需借助电泳等技术回收
大片段。琼脂糖凝胶电泳结果中，若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是
（答出一点即可）。
【答案】(1) 脱氧(核糖)核苷酸 启动子、终止子和标记基因(答全给分)
(2) 限制酶BglⅡ和Sal I 的识别序列 不正确 Sal I 的识别序列未连接在引物的5’端
(3) a、b b、c
(4)利用信号肽将L1 基因片段表达的抗原蛋白引导到内质网进行加工
(5)引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高
等
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
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增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技
术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的
DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA 复制，需要热稳定DNA 聚合酶。
【详解】（1）质粒的本质是一种DNA 分子，所以组成质粒ZY781 载体的单体是4 种脱氧核糖核苷酸。载
体除了需要具备复制原点以及一至多个限制酶识别和切割位点，还需具有启动子、终止子和标记基因等结
构，基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
（2）HPV-L1 重组片段的PCR 过程中，需要在引物A 和引物B 的5'端分别连接限制酶BglⅡ和Sal I 的识别
序列 ，若标签区序列为5'CATCATCACCATCACCAT3'，3'GTAGTAGTGGTAGTGGTA5'，引物B 的序列为
3'CAGCTGGTAGTAGTGGTAGTGGTA5'，由于Sal I 的识别序列未连接在引物的5'端，所以引物B 的设计
不正确；
（3）利用重叠延伸PCR 技术进行定点突变对HPV-L1 基因进行合理性改造的过程中，据图可知，PCR1 过
程的产物AB，一条单链的一端是依赖引物a，另外一条单链的另外一端是依赖引物b，进而扩增出来的。
②过程是AB 上链和CD 下链延伸配对的结果，首先使用热稳定性DNA 聚合酶进行延伸，再根据突变位点
处引物b 和引物c 为互补重叠序列，使用引物对b、c 可以进行PCR 扩增；
（4）L1 基因片段编码HPV 的主要抗原蛋白，将编码信号肽的序列与L1 基因片段连接一起构建重组微环
DNA 的目的是利用信号肽将L1 基因片段表达的抗原蛋白引导到内质网进行进一步的加工，使抗原蛋白活
性更高一些；
（5）利用质粒ZY781 构建重组质粒(PP)时，选用限制酶BglⅡ和Sal I 切割质粒后，需借助电泳等技术回收
大片段，琼脂糖凝胶电泳结果中,若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，说明在PCR
过程中可能出现了异常，根据PCR 技术特点，可能是引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补
或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高等原因。
8．（23-24 高三上·北京丰台·期末）系统性红斑狼疮（SLE）发病机理复杂。研究发现，SLE 和外周血单个
核细胞（PBMC）的自噬有关。
(1)PBMC 细胞自噬异常时释放的染色体、核糖体等可以作为自身 ，刺激机体产生抗体，从而引起
病。
(2)科研人员对健康人和SLE 患者PBMC 细胞中的一种小RNA 分子含量进行检测，检测结果如下：
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实验结果表明： 。
研究发现该小RNA 分子能与某mRNA 的3’末端结合，阻止该mRNA 分子的翻译。为确定该mRNA 分子是
哪个基因转录的，科学家进行了以下的操作：
①找出SLE 患者表达量增加的预测基因
②找出SLE 患者表达量减小的预测基因
③构建预测靶基因的表达载体N
④构建该小RNA 分子的表达载体N
请完善确定该小RNA 分子的靶基因的技术路线：通过Targetscan 数据库找出预测的靶基因→比较健康人和
SLE 患者的PBMC 细胞中预测靶基因的表达量→ →构建融合基因：克隆出预测靶基因的3’末端区
段，将其连接在荧光素酶基因的编码区末端→将融合基因构建表达载体M→ →将表达载体M 和N
一起导入细胞，培养一段时间后提取重组细胞的蛋白质，加入荧光素溶液中→检测溶液的荧光强度。（注：
荧光素酶能催化荧光素的氧化作用并发出荧光）与对照组相比，若实验组的 ，表明该预测基因是该小
RNA 分子作用的靶基因。
(3)通过上述方法最终确定该靶基因是基因T，该基因的表达产物能够调控细胞自噬信号通路相关蛋白的表
达，导致细胞的自噬功能异常。请说明该项研究的意义 。
【答案】(1) 抗原 自身免疫
(2) 与健康人相比，SLE 患者该小RNA 分子的相对表达量明显下降 ① ④ 荧光强度减
弱
(3)为SLE 的治疗提供新的药物作用的靶位点
【分析】细胞自噬就是细胞吃掉自身的结构和物质，在一定条件下，细胞会将受损或功能退化的细胞结构
等，通过溶酶体降解后再利用，这就是细胞自噬，处于营养缺乏条件下的细胞, 通过细胞自噬可以获得维
持生存所需的物质和能量;在细胞受到损伤、微生物入侵或细胞衰老时，通过细胞自噬，可以清除受损或衰
老的细胞器，以及感染的微生物和毒素，从 而维持细胞内部环境的稳定。
【详解】（1）细胞自噬异常时释放的染色体、核糖体等可以作为自身抗原，抗原可以刺激机体产生抗体，
人体免疫系统攻击自身的正常的结构，属于自身免疫病。
（2）科研人员对健康人和SLE 患者PBMC 细胞中的一种小RNA 分子含量进行检测，图中可以看出与健康
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人相比，SLE 患者该小RNA 分子的相对表达量明显下降。研究发现该小RNA 分子能与某mRNA 的3’末端
结合，阻止该mRNA 分子的翻译。
为确定该mRNA 分子是哪个基因转录的，科学家进行了以下的操作：
通过Targetscan 数据库找出预测的靶基因→比较健康人和SLE 患者的PBMC 细胞中预测靶基因的表达量
→①找出SLE 患者表达量增加的预测基因→构建融合基因：克隆出预测靶基因的3’末端区段，将其连接在
荧光素酶基因的编码区末端→将融合基因构建表达载体M→④构建该小RNA 分子的表达载体N→将表达
载体M 和N 一起导入细胞，培养一段时间后提取重组细胞的蛋白质，加入荧光素溶液中→检测溶液的荧光
强度。（注：荧光素酶能催化荧光素的氧化作用并发出荧光）与对照组相比，若实验组的荧光强度减弱，
表明该预测基因是该小RNA 分子作用的靶基因。
（3）通过上述方法最终确定该靶基因是基因T，该基因的表达产物能够调控细胞自噬信号通路相关蛋白的
表达，导致细胞的自噬功能异常。该项研究的意义为SLE 的治疗提供新的药物作用的靶位点。
9．（2024·广东·一模）DNA 双链断裂（DSB）是真核生物中一种严重的DNA 损伤形式，哺乳动物体内存
在相关机制修复DSB。在修复过程中可能会发生改变遗传信息的情况，例如丢失DNA 上的甲基化信息
（表观遗传信息改变）或发生基因突变，从而对基因的表达产生影响。已知DSB 可以导致生物个体衰老，
但相关的分子机制尚未明确。回答下列问题：
(1)用I-PpoI 酶处理DNA 可导致DSB，作用机理见图1。I-PpoI 酶由I-PpoI 基因编码，能够识别主要存在于
非编码区（DNA 中不能编码蛋白质的区段）的序列5′-CTCTCTTAAGGTAGC-3′，使第9 位A 与第10 位G
之间的 键断开，据此可知该酶属于 酶。科学家选用该酶诱发DSB，可以尽量减少 带来的影响。
(2)为了探究DSB 是通过表观遗传信息改变还是基因突变导致衰老，科学家以小鼠作为研究材料进行相关
实验。该实验的流程大致如图2：
①在实验前，利用基因工程技术将I-PpoI 基因导入到小鼠细胞中，诱导表达后需通过 法检测细胞内是
否产生I-PpoI 酶。若产生I-PpoI 酶，则会导致实验组小鼠发生 信息的变化。表观年龄是根据整个基因组
有多少碱基失去了原有的甲基作为测量依据。实验前，对照组和实验组小鼠的表观年龄应 。
②若实验结果为：与对照组相比，实验组小鼠 ；且当实验组出现明显的衰老表型时，对照组依然保持
年轻的状态，则证明DSB 引起的表观遗传变化导致衰老。
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③若出现上述实验结果，科学家还需要对实验组小鼠进行基因治疗，使其恢复年轻时的表观遗传信息。若
，则能确立表观遗传变化与衰老之间的因果关系。
【答案】(1) 磷酸二酯键 限制性核酸内切酶 改变遗传信息
(2) 抗原-抗体杂交 表观遗传 保持相同 表观年龄增大 实验组小鼠进行基因治疗后
不再表现衰老状态
【分析】基因突变指DNA 中碱基对的增添、缺失、替换引起基因结构的改变。具有普遍性、不定向性、
随机性、低频性等特点。
【详解】（1）DNA 基本单位核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，因此I-PpoI 酶处理第9 位A 与第10 位G 之
间的磷酸二酯键断开，据此可知该酶属于限制性核酸内切酶。题干中，在修复过程中可能会发生改变遗传
信息的情况，科学家选用该酶诱发DSB，修复后，其碱基序列不变，可以尽量减少改变遗传信息带来的影
响。
（2）I-PpoI 酶的本质是蛋白质，因此可以通过抗原-抗体杂交检测细胞内是否产生I-PpoI 酶。若产生I-PpoI
酶，则会导致实验组小鼠发生表观遗传信息的变化。实验要遵循单一变量的原则，实验前，对照组和实验
组小鼠的表观年龄属于无关变量应保持相同。
若实验结果为：与对照组相比，实验组小鼠表观年龄增大；且当实验组出现明显的衰老表型时，对照组依
然保持年轻的状态，则证明DSB 引起的表观遗传变化导致衰老。
若出现上述实验结果，科学家还需要对实验组小鼠进行基因治疗，使其恢复年轻时的表观遗传信息。若实
验组小鼠进行基因治疗后不再表现衰老状态，则能确立表观遗传变化与衰老之间的因果关系。
10．（23-24 高三上·全国·阶段练习）荞麦中的胰蛋白酶抑制剂（BMI）可用于防治害虫，对肿瘤细胞的增
殖也有明显的抑制作用。下面是研究人员从荞麦中克隆胰蛋白酶抑制剂基因以及基因产物功能验证的部分
实验流程，按要求回答下列问题。
(1)根据文献中胰蛋白酶抑制剂基因的序列，利用PCR 法扩增获得了蛋白酶抑制剂基因（BMI 基因）。PCR
体外扩增目的基因与体内DNA 复制过程的主要区别有 （答出两点）。
(2)为使BMI 基因与所用的图示载体正确连接（该基因序列不含图示载体中限制酶的识别序列），在扩增
的BMI 基因的引物两端可分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的
BMI 基因和载体进行连接时，可选用 （填“E.coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
注：箭头表示切割位点
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.相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
EcoRⅤ
GAT↓ATC
BamHⅠ
G↓GATCC
PstⅠ
CTGC↓AG
KpnⅠ
G↓GTACC
(3)为验证BMI 基因表达产物对细胞增殖的抑制作用，将小鼠肝癌细胞H22（悬浮细胞）及正常人肝细胞
7702（贴壁细胞）分别加入一系列浓度的BMI 基因表达产物，在相同条件下进行原代和传代培养，一段时
间后检查对两种细胞的抑制情况如下图。（图中的“7702cell”是肝细胞培养24 小时后的结果）。
①如需要对正常人肝细胞7702（贴壁细胞）进行传代培养，所用的处理方法是 。
②据图分析该实验的结论是 （答出两点）。
【答案】(1)解旋方式不同，体内复制需要解旋酶，PCR 通过高温使DNA 解旋；所用的酶不同
(2) BamHⅠ EcoRⅤ T4DNA 连接酶
(3) 先用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，再用离心法收集，制成悬液分瓶培养 一定范围
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内，随浓度升高BMI 基因表达产物对小鼠肝癌细胞H22 抑制作用逐渐增强；在相同浓度的BMI 基因表达
产物下，随着时间的增加，小鼠肝癌细胞H22 抑制作用逐渐增强。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
4、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）PCR 体外扩增目的基因与体内DNA 复制过程的主要区别有解旋方式不同，体内复制需要解
旋酶，PCR 通过高温使DNA 解旋；所用的酶不同。
（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间
存在于三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择BamHⅠ和EcoRⅤ两种
不同限制酶的识别序列；根据DNA 复制时延伸方向可知，两种酶对应的识别序列应设计在引物的5 端；
根据EcoRⅤ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA 连接酶连接质粒和目
的基因。
（3）①如需要对正常人肝细胞7702（贴壁细胞）进行传代培养，所用的处理方法是先用胰蛋白酶等处理，
使之分散成单个细胞，再用离心法收集，制成悬液分瓶培养；
②据图分析该实验的结论一定范围内，随浓度升高BMI 基因表达产物对小鼠肝癌细胞H22 抑制作用逐渐增
强；在相同浓度的BMI 基因表达产物下，随着时间的增加，小鼠肝癌细胞H22 抑制作用逐渐增强。
11．（21-22 高三上·北京朝阳·期末）亚洲棉的光籽（无短绒）和毛籽（有短绒）是一对相对性状，为探究
棉绒的遗传规律并揭示其发育的分子机制，研究者进行了系列实验。
(1)利用表型为光籽的不同突变体与野生型毛籽棉进行杂交，统计F1自交结果如下表：
组
别
亲本
F2表型及比例
①
突变体甲×毛籽棉
光籽∶毛籽＝3∶1
②
突变体乙×毛籽棉
光籽∶毛籽＝13∶3
③
突变体丙×毛籽棉
光籽∶毛籽＝9∶7
据表可知，突变体甲光籽性状的遗传遵循 定律；②组F2光籽棉中的纯合子所占比例为
；推测③组F1测交后代表型及比例为 。综合三组杂交实验结果，表明 之间并非简单
的一一对应关系。
(2)研究发现，8 号染色体的～880kb 至～903kb 区间与突变体甲的光籽表型相关。根据野生型毛籽棉的该区
间设计连续的重叠引物，提取突变体甲和野生型的 进行PCR，产物扩增结果如下图。
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据图可知分子量较大的扩增产物与点样处的距离较 （选择“大”或“小”填写），推测8 号染
色体上第 对引物对应的区间（简称M） 是突变体甲光籽出现的根本原因。
(3)研究者对杂交组合①的F2进行扩增，证实甲的光籽表型与区间M 密切相关。得出此结论的扩增结果应
该是 。
(4)研究者从野生型和突变体甲中克隆出区间M 后，运用基因工程技术分别导入棉花原生质体，检测基因
表达水平，结果如下图。
内参基因REN 是为了排除转化效率不同对实验结果的干扰，因此图中LUC/REN 用来衡量 的表
达水平。实验结果说明突变体甲的区间M 促进下游基因的表达，且其作用的发挥与区间M 的 有关。
(5)基因GaFZ 的表达会影响棉花短绒的发育，检测发现突变体甲GaFZ 蛋白结构与野生型一致。综合上述
研究推测突变体甲光籽表型出现的原因是 。
【答案】(1) 基因的分离 3/13 光籽：毛籽=1:3 基因与性状
(2) 8 号染色体的DNA 小 6 基因突变
(3)毛籽性状的扩增结果与野生型相同，光籽性状的扩增结果与野生型有区别
(4) LUC 长度和方向
(5)突变体甲区间M 突变后，促进了下游基因，如GaFZ 基因的表达，进而影响了棉花短绒的发育，导致出
现了光籽性状
【分析】根据组①子二代的分离比为3:1 可知，该性状至少涉及一对等位基因；根据组②F2 的分离比为
13:3 可知，该性状至少涉及两对等位基因。
【详解】（1）根据组①子二代的分离比为3:1 可知，突变体甲光籽性状的遗传，遵循基因的分离定律。组
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②F2 的分离比为13:3，为9:3:3:1 的变式可知，光籽中纯合子有三份，一份为显性纯合子，其余两份为单
显纯合子，故其中纯合子的比例为3/13。根据组③子二代中光籽：毛籽=9:7 可知，除了双显性为光籽外，
其余单显的和双隐性均为毛籽，且F1 为双杂合，测交后代中，光籽：毛籽=1:3。根据三组杂交结果可知，
基因与性状之间并非简单的一一对应的关系。
（2）由于8 号染色体的～880kb 至～903kb 区间与突变体甲的光籽表型相关，故应该提取突变体甲和野生
型的8 号染色体上的DNA 进行扩增。由图可知，分子量较大的扩增产物迁移速率慢，与点样处的距离较
小。根据野生型和突变体甲经引物6 扩增的产物不同可知，8 号染色体上的第6 对引物对应的区间基因突
变是甲光籽性状出现的根本原因。
（3）若对杂交组合①的F2 进行扩增，其中的毛籽性状扩增产物有野生型相同，光籽性状的扩增产物的区
间M 与野生型有区别，则可以证实甲的光籽表型与区间M 密切相关。
（4）实验结果说明突变体甲的区间M 促进下游基因的表达，根据柱形图可知，空载体、野生型和突变体
甲的LUC/REN 不同，说明LUC/REN 可以用来衡量LUC 的表达水平。区间M 的长度和方向不同，LUC/
REN 的比值不同，说明M 可以促进下游基因的表达，其作用的发挥与区间M 的长度和方向有关。
（5）根据组①子二代的分离比为3:1 可知，光籽为显性性状，“基因GaFZ 的表达会影响棉花短绒的发育，
检测发现突变体甲GaFZ 蛋白结构与野生型一致”，说明GaFZ 蛋白基因可能不在区段M，突变体甲区间
M 突变后，促进了下游基因，如GaFZ 基因的表达，进而影响了棉花短绒的发育，导致出现了光籽性状。
【点睛】解答本题的关键是分析每组数据给出的信息，再进行分析和解答。
12．（2024·广东深圳·二模）利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口
服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），
诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD 和
3RBD，探究RBD 的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD 的天然构象并获得高效免疫原性。
重组质粒构建流程如图1 所示，Nco I 和Sac I 是pNZ8149 质粒上的限制酶识别位点，U-M 为信号肽-细胞
壁锚定蛋白序列。回答下列问题：
(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加 ，并在
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（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR 技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的
5'端应分别添加 序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1 为双酶切pNZ8149-
2RBD，泳道2 为双酶切pNZ8149-3RBD。泳道1 两个条带大小分别为2507bp 和2020bp，由此可知，融合
基因3RBD 的长度为 bp，泳道2 呈现一个条带的原因是 。
(4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，
pNZ8149-2RBD 菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD 菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明 。
【答案】(1) 维生素 无氧
(2)限制酶Nco I 和Sac I 的识别
(3) 2686bp 双酶切pNZ8149-3RBD 后产生的两个片段大小相近
(4)二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加
维生素，乳酸菌属于厌氧菌，需要在无氧的环境条件下培养。
（2）根据质粒上启动子、终止子与限制酶识别序列的位置关系可知，为保证融合基因定向插入，应选择
两种限制酶切割，所用两种引物的5'端应分别添加限制酶Nco I 和Sac I 的识别序列。
（3）由图可知pNZ8149-2RBD 和pNZ8149-3RBD 的碱基对分别为4527bp 和5193bp，所以RBD 长度为
5193-4527=666bp，泳道1 为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp 和2020bp，所以融合基
因3RBD 的长度为666+2020=2686bp，泳道2 呈现一个条带的原因是双酶切pNZ8149-3RBD 后产生的两个
片段大小相近。
（4）实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，
pNZ8149-2RBD 菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD 菌株表面三聚体蛋白多，由于抗原蛋白需穿
过细胞膜展示在细胞表面，因此该现象说明二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表
面。
13．（2024·北京顺义·一模）人在衰老过程中某些性状会发生改变，为寻找衰老的原因，科研人员对染色
质开展了相关研究。
(1)由图1 可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域 ，某些DNA 。
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(2)DNA 甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散会 （促进/抑
制）基因表达。
(3)科研人员推测：核内DNA 断裂后的修复会导致表观遗传信息紊乱或丢失，加速细胞衰老。为验证该推
测，科研人员基于图2 原理，利用以下实验材料构建ICE 模型鼠。
①Cre 酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于DNA 上的Lx 序列，导致两个Lx 间的DNA
片段丢失；
②I-E 核酸酶基因：编码的I-E 核酸酶位于细胞核，与诱导剂T、Cre 酶形成复合物，切割DNA；
③口服诱导剂T：小分子化合物，可诱导Cre 酶进细胞核。
请完善技术路线 ：
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(4)染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE 小鼠的检测，发现已修复的DNA 未发生碱基序
列的改变。通过检测 ，可知获得的ICE 鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结构，可知细胞衰老。
【答案】(1) 松散 低甲基化
(2)促进
(3)口服诱导剂T
(4)（细胞核发出的）绿色荧光
【分析】分析图1，年轻状态时，DNA 甲基化，染色质紧密，衰老状态时，DNA 低甲基化，染色质松散，
有利于基因表达。
【详解】（1）由图1 可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域松散，某些DNA 低甲基化。
（2）DNA 甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散，有利于DNA
解旋并进行转录，会促进基因表达。
（3）根据题图可知，无诱导剂T 时，Cre 酶会被降解，有诱导剂T 时，Cre 酶进入细胞核后作用于DNA 上
的Lx 序列，导致两个Lx 间的DNA 片段丢失，I-E 核酸酶基因会成功表达，并与ICE 识别序列结合导致
DNA 双链断裂。技术路线如下：先分别构建含有基因①Cre 酶基因和基因②I-E 核酸酶基因的小鼠1 和小
鼠2，利用两鼠杂交，筛选目标鼠后，口服诱导剂T，诱导Cre 酶进细胞核，然后在显微镜下观察细胞核是
否出现绿色荧光，有绿色荧光的即为ICE 鼠。
（4）染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE 小鼠的检测，发现已修复的DNA 未发生碱基
序列的改变。通过检测细胞核发出的绿色荧光，可知获得的ICE 鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结
构，可知细胞衰老。
14．（2024·贵州·模拟预测）某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图所示，
①～④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ酶切位点唯一。其中BamHⅠ与EcoRⅠ之间的距离为
20kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ识别序列和切割位点如图。请回答：
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BamHⅠ：—G↓GATCC— BglⅡ：—A↓GATCT— EcoRⅠ：—G↓AATTC—
(1)常用特异性地扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→ ”三步。
(2)启动子的功能是 。
(3)步骤①应选择限制酶 切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加 ，以便筛选出含
目的基因的甘蓝植株，原因是 。
(4)经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因存在
正向与反向两种连接方式。用 酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产物大
小，若出现 条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。
【答案】(1)复性→延伸
(2)RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
(3) BamHⅠ 潮霉素 Ti 质粒的T－DNA 中含有潮霉素抗性基因
(4) BamHⅠ和EcoRⅠ 四
【分析】分析题图：①为基因表达载体的构建，②为将重组质粒导入农杆菌，③为农杆菌侵染愈伤组织，
④为植物组织培养。
【详解】（1）利用PCR 扩增目的基因，每次循环一般分为“变性→复性→延伸” 三步。
（2）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
（3）由图可知：目的基因的一侧和质粒中都含有BamHⅠ的酶切位点，因此步骤①应选择限制酶BamHⅠ切
割农杆菌质粒。Ti 质粒的T－DNA 中含有潮霉素抗性基因，因此在步骤④的培养基中需要添加潮霉素，以
便筛选出含目的基因的甘蓝植株。
（4）由图可知：用BamHⅠ酶和BglⅡ酶切割得到的黏性末端相同，均为-GATC，因此剪切后的目的基因能
与质粒连接在一起。在构建的重组质粒中，不再有BglⅡ酶的识别位点，但含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，
酶切位点与目的基因正向和反向连接方式有关（见图）。
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若只选一种酶切割基因表达载体，无论目的基因正向连接还是反向连接，均只得到长度180＋25＋20＝
225kb 的DNA，无法区分目的基因正向连接还是反向连接。若选用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切割，目的基因正向
连接的重组质粒被切成180kb、45kb 的两种DNA 片段，目的基因反向连接的重组质粒被切成205kb、20kb
两种DNA 片段，所以电泳应出现四条条带。
15．（2024·重庆·模拟预测）如图为将高蛋白优良基因THP9 导入植物细胞获得新品种的过程，请回答下
列问题：
EcoRI
BamHI
KpnI
MfeI
HindIII
(1)为大量获得THP9 基因，科研人员利用了RT-PCR 技术（用mRNA 首先获得cDNA，再进行聚合酶链式
反应的技术）。RT-PCR 反应在含有Mg2+的缓冲液中进行，其中Mg2+的作用是 ，每次循环一般可以
分为 三步。若加入的mRNA 为a 个，要得到含目的基因的cDNA 片段，至少需要 个引物。
(2)已知图中THP9 基因转录方向为从左往右，应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图
中含 THP9 基因的DNA 片段，以获得能正确表达THP9 基因的重组质粒。
(3)若将上述含有THP9 基因的重组质粒导入动物细胞，常用的受体细胞是 ，进而培育转基因克隆动
物，若在个体水平检测转基因技术是否成功，其检测方法是 。
【答案】(1) 激活耐高温的DNA 聚合酶 变性、复性、延伸 2a
(2) MfeI、HindIII EcoRI、HindIII
(3) 受精卵 将转基因植物田间种植后收获其籽粒，检测其蛋白质含量
【分析】基因工程的基本步骤：①目的基因的获得；②重组DNA 分子构建；③将重组DNA 分子导入受体
细胞；④筛选含有目的基因的受体细胞；⑤检测目的基因及其表达产物。PCR 技术也叫聚合酶链式反应，
PCR 是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术，该技术的原理是DNA 双链复制，PCR 技术包
括变性、复性和延伸三个环节。
【详解】（1）RT-PCR 反应在含有Mg2+的缓冲液中进行，Mg2+的作用是激活耐高温的DNA 聚合酶。
PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术，PCR 每次循环一般可以
分为变性、复性和延伸三步。加入1 个mRNA 后，若要得到THP9 基因的cDNA 片段，至少需要2 个引物，
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若加入a 个mRNA，则至少需要2a 个引物。
（2）题图中THP9 基因转录方向为从左往右，即启动子位于左端，终止子位于右端，因为该基因右侧只有
一个酶切位点，故一定用HindIII 切割质粒和目的基因，对于质粒来说，不能用EcoRI 进行切割（含两个切
割位点，切割形成片段的启动子与终止子之间无法插入目的基因），不能用BamHI 切割（会切断启动子），
那么在HindIII 的左侧只有MfeI 序列，且MfeI 和EcoRI 能切割形成相同的黏性末端，故质粒用MfeI、
HindIII 切割，目的基因用EcoRI、HindIII 切割以获得能正确表达THP9 基因的重组质粒。
（3）若将上述含有THP9 基因的重组质粒导入动物细胞，常用受精卵作为受体细胞，选择受精卵作为受体
细胞的主要原因是受精卵的全能性最高。该实验是将高蛋白优良基因THP9 导入植物细胞获得新品种的过
程，为了检测转基因技术是否成功，可进行分子水平、个体水平的检测，个体水平上的检测方法是将转基
因植株田间种植后收获其籽粒，检测其蛋白质含量。
16．（2024·湖南永州·三模）大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构
建一种基因表达可控的工程菌，用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。科研人员利用温度敏感型转录调控
蛋白构建温控表达的质粒系统，部分结构如下图。在人体特定部位进行42℃处理后，p7 可在重组酶Bxb1
作用下翻转，免疫元件中的GFP 和aPD-L1 两种基因可以成功表达。据此回答下列问题：
(1)推测p7 应为 （填“启动子”或“终止子”），其功能是 。
(2)Tel42 为来自λ 噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子pLac 可以使Tel42
持续性表达，当温度 （填“低于”、“等于”或“大于”）42℃时，Tcl42 蛋白会抑制启动子pRL。
(3)质粒系统就像“基因电路”，其中的Tcl42 基因就像“开关”，能在加热时瞬时激活特定基因。其核心
基因包括重组酶Bxb1 基因、分泌型aPD-L1 蛋白基因（该蛋白可用于免疫治疗）等。请选择相关选项完善
该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA 连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件
及质粒，构建“基因电路”→ →重组酶Bxb1 基因不表达→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→
→解除Tcl42 蛋白对启动子pRL 的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量aPD-L1。将下列选项代
号填入上述横线，将“基因电路”补充完整。
A．受体菌37℃时
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B．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42 失去活性
C．荧光蛋白GFP 基因、aPD-L1 基因的转录
D．重组酶Bxb1 基因表达，进而引起p7 两侧发生重组
(4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是 。导入后的菌体用 方
法接种于含四环素的培养基上，由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌。
(5)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的
温度控制。为验证上述温控工程菌可被FUS 处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。请以成瘤建模后的小鼠
为材料，设计一个实验方案 。
【答案】(1) 启动子 RNA 聚合酶识别和结合位点，驱动基因的转录
(2)低于
(3) A B D C
(4) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 稀释涂布平板
(5)将成瘤建模后的小鼠随机均分为三组，甲组注射生理盐水，乙组、丙组注射温控工程菌。一段时间后甲、
乙两组用FUS 处理，丙组不做FUS 处理，检测小鼠体内（肿瘤组织是否发出绿色荥光），并记录肿瘤体
积变化
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根
据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花
粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是
钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）根据题意“p7 可在重组酶Bxb1 作用下翻转，免疫元件中的GFP 和aPD-L1 两种基因可以成
功表达”，说明p7 为启动子，启动子是RNA 聚合酶识别和结合位点，驱动基因的转录。
（2）已知在人体特定部位进行42℃处理后，p7 可在重组酶Bxb1 作用下翻转，免疫元件中的GFP 和aPD-
L1 两种基因可以成功表达，因此当温度低于42℃时，Tcl42 蛋白会抑制启动子pRL。
（3）“基因电路”的技术路线要起作用，第一步要构建“基因电路”，因此要先用不同的限制酶、DNA
连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，使这些元件能够连接成“基因电路”；依题
意，当温度不到42℃时具强活性的启动子pLac 可以使Tcl42 持续性表达，抑制启动子pRL，则与其构成一
个表达单位的重组酶Bxb1 基因不表达 。重组酶的作用位点在免疫元件中，重组酶Bxb1 基因不表达，则
αPD-L1 不表达，免疫元件无功能；当控温至42℃时解除蛋白Tcl42 对启动子pRL 的抑制，重组酶Bxb1 基
因表达，进而引起启动子p7 两侧发生重组，启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录。从
而使细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。综合以上分析，“基因电路”的技术路线是：用不同的限制酶、
DNA 连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路” → A、受体菌37℃
时，蛋白Tcl42 抑制启动子pRL →重组酶Bxb1 基因不表达→ 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） →B、
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菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42 失去活性→ 解除蛋白Tcl42 对启动子pRL 的抑制→D、重组酶Bxb1 基因
表达，进而引起启动子p7 两侧发生重组→C、启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录→细
菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。
（4）科研人员用Ca2+处理大肠杆菌是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后将
“基因电路”质粒导入菌体内。依题意，重组的质粒中带有抗四环素的抗性基因，因此，可用稀释涂布平
板法将导入后的菌体接种在含有四环素的培养基来筛选含重组质粒的受体细胞，能在该培养基上形成的菌
落就是成功构建用于免疫治疗的温控工程菌菌落。
（5）依题意，该实验的目的是验证上述温控工程菌可被FUS 处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。因此
可将成瘤建模后的小鼠随机均分为三组，甲组注射生理盐水，乙组、丙组注射温控工程菌。一段时间后甲、
乙两组用FUS 处理，丙组不做FUS 处理，检测小鼠体内（肿瘤组织是否发出绿色荥光），并记录肿瘤体
积变化。
17．（2024·北京东城·一模）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。
(1)研究发现，东方果蝇中dsx 基因 出的前体RNA 在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用
这一特性研发雌性特异性致死基因系统。
(2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1 所示的融合基因1，进而得到
转基因果蝇。
①根据图1，扩增dsx 内含子应选择的引物是 （选填字母）。
② 由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx 基因前体RNA 保留或剪切内含子和剪切识别序列
情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA 为
（填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。
(3)研究发现，RTA 蛋白第212 位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃
时，可抑制RTA 蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
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① 欲得到具有cs 效应的RTAcs 蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2 所
示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的5’端和3’端 。
② 对转入融合基因2 的果蝇进行以下操作：
ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）。
ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比
例，若 ，则说明G1具有cs 效应。
ⅳ：在 ℃继续培养具有cs 效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。
【答案】(1)转录
(2) ad C 在雄性个体中，融合基因1 的成熟mRNA 含有dsx 内含子的对应序列，无法表达完
整的RTA 蛋白，不会导致细胞死亡
(3)
18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生
物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA 分子水平上
进行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录
终止的位置；
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（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）转录是以DNA 的一条链为模板合成RNA 的过程，东方果蝇中dsx 基因（DNA）通过转录
形成前体RNA。
（2）①用于PCR 扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游
和下游，根据图1，扩增dsx 内含子应选择的引物是ad。
②RTA 基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的
原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA 基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇
中的成熟mRNA 为C。而在雄性个体中，融合基因1 的成熟mRNA 含有dsx 内含子的对应序列，无法表达
完整的RTA 蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。
（3）①图2 虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的
DNA 聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下：
。
②由题意可知：RTA 蛋白第212 位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为
18℃时，可抑制RTA 蛋白对细胞的致死作用。
对转入融合基因2 的果蝇进行以下操作：
ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。
ⅱ：G0 与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比
例，若G1 具有cs 效应，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。
ⅳ：在18℃时可抑制RTA 蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培
养具有cs 效应的G1 果蝇。
18．（2024·山东·二模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生
长和发育，决定作物的产量和品质。SUT 基因家族中的StSUT2 基因主要在花和老叶中表达，科学家借助
Gateway 克隆技术通过构建StSUT2 植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway 克隆技术包括
TOPO 反应和LR 反应（如图一、图二所示）。
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(1)获得大量StSUT2 基因：首先从植物的 细胞中提取总mRNA，经过 过程获得cDNA，根据StSUT2
基因两端的序列设计引物进行PCR 扩增，获得大量的StSUT2 基因。
(2)构建入门载体：利用图一中的TOPO 反应将目的基因PCR 产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被
拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，
并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保
StSUT2 基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2 基因时，可在引物中引入5'— —3'序列。
(3)构建StSUT2 基因超表达载体：LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和超表达载体上的attR 位点，将入
门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，得到所需载体。请结合图二中的LR 反应
过程，在下图三的方框中画出含StSUT2 基因的超表达载体 。
(4)StSUT2 基因超表达及检测：通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2 基因超表
达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定StSUT2 基因是否成功超量表达。
【答案】(1) 花或老叶 逆转录
(2) 限制酶和 DNA 连接酶 CACC
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(3)
(4)StSUT2 转运蛋白含量
【分析】PCR 过程：
①变性：当温度上升到90℃以上时，DNA 解旋为单链；
②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA 结合；
③延伸：再将温度上升到72℃左右，反应体系中的4 种脱氧核苷酸在耐高温的TaqDNA 聚合酶的作用下，
根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】（1）为获得大量StSUT2 基因，应首先从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA，通过逆转录过程
获得cDNA，然后根据StSUT2 基因两端的序列设计两种引物进行PCR 扩增，进而获得大量的StSUT2 基因。
（2）载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，
一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。因此拓扑异构酶与基因工
程的限制酶和 DNA 连接酶功能相似。由于目的基因左侧碱基序列为GTGG，因此在扩增StSUT2 基因时，
可在引物中引人5'—CACC—3'序列，以确保StSUT2 基因定向连接人门载体。
（3）因为LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和超表达载体上的attR 位点，将入门载体中的目的基因与
超表达载体中的相应片段实现同源重组，因此StSUT2 基因的超表达载体为：
（4）为确定StSUT2 基因是否成功超量表达，可通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含
StSUT2 基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的StSUT2 转运蛋白含量。
19．（2024·江苏盐城·模拟预测）Ⅰ、同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对基因进行敲除与回补，
研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ 基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr
是四环素抗性基因，sacB 基因是蔗糖致死基因，LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解成蓝色化合
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物。请回答下列问题：
限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
HindⅢ
XmaⅠ
识破序列和切割位
点
5'G↓AATTC3'
5'G↓GATCC3'
5'A↓AGCTT3'
5'C↓CCGGG3'
Ⅱ、咪唑喹啉衍生物（BEZ）和长春花碱（VLB）用于治疗卵巢癌、肝癌等癌症，为研究二者对肾癌的治
疗效果，研究人员进行了系列实验。
(1)过程①PCR 中影响退火温度的因素有引物的长度、 ，若温度过低会导致 。
(2)过程⑤中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加上 基因两端的同源序列。
(3)过程⑦中，在含有 的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ 基因菌株。过程⑧通过
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同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对LacZ 基因进行回补，筛选LacZ 基因回补菌株时应在培养基
中添加 。
(4)探究BEZ 和VLB 单独及联合使用对肾癌细胞凋亡的影响，结果如图1 所示。该实验的自变量是 ，
实验结果表明 对癌细胞凋亡无明显影响。
(5)Caspase—3 是细胞内促凋亡蛋白，Mcl—1 是Caspase—3 基因表达的调控因子。为研究BEZ 和VLB 治疗
肾癌的机制，研究人员对各组细胞进行实验处理24 小时后，检测Mcl—1 的mRNA 和蛋白质含量，结果如
图2.选用GAPDH 作为内参的原因是 。
(6)综合图1、图2 结果，在下列箭头上标明“+”或“-”（分别表示“促进”和“抑制”），图示药物发挥
作用的机理 、 。
【答案】(1) G、C 含量 非特异性扩增片段增多
(2)LacZ
(3) 四环素和X-gal 蔗糖和X-gal
(4) BEZ 的浓度、VLB 的浓度及不同浓度的组合 单独使用BEZ 和VLB
(5)GAPDH 基因在各组细胞中表达量基本相同，排除实验操作和检测方法的干扰
(6) （—） （—）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）影响退火温度的因素有引物的长度、G、C 含。若温度过低会导致引物与模板非特异性配对
增多，导致非特异性扩增片段增多。
（2）过程⑤中，设计两种引物时需在引物5＇端分别添加上LacZ 基因两端的同源序列，利用同源重组技
术将LacZ 基因与载体相连。
（3）由于LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解成蓝色化合物，若培养基中出现白色菌落，则说
明成功导入重组质粒，LacZ 基因成功敲除，由于重组质粒上有四环素标记基因，故含有四环素和X-gal 的
培养基中出现白色菌落。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对LacZ 基因进行回补，
由于sacB 基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解
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成蓝色化合物，则添加X-gal 起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X-gal 可筛选LacZ 基因回补菌株。
（4）由图可知，该实验的自变量是BEZ 的浓度、VLB 的浓度及不同浓度的组合，单独使用BEZ 和VLB
是细胞的凋亡数与对照组相比几乎无差别，故单独使用BEZ 和VLB 对癌细胞凋亡无明显影响。
（5）根据对图2 的分析可知，图2 中左图中GAPDH 内参的是mRNA，右图中GAPDH 内参的是蛋白质，
由于GAPDH 基因在各组细胞中表达量基本相同，选用GAPDH 作为内参的原因是排除实验操作和检测方
法的干扰。
（6）综合图1、图2 结果可知，BEZ 和VLB 共同使用抑制了Mcl-1 蛋白质的合成，Mcl-1 蛋白质含量的减
少对Caspase-3 基因表达的抑制作用减弱，从而Caspase-3 基因表达增强，Caspase-3 蛋白的含量增加，在
Caspase-3 蛋白的作用下促进细胞凋亡，从而达到减小肿瘤的体积的作用，故：
20．（2024·山东·二模）某研究所为研究水稻叶肉细胞中miR5810（一种小分子RNA）和MRLP6 蛋白之
间的关系，分别探究了两者对水稻光合色素含量和净光合速率的影响，结果如图一所示。同时，研究人员
利用双荧光素酶技术探究了转录因子NFYB7 与miR5810 基因表达的关系。该项研究揭示了一种调节光合
作用的分子机制，为水稻高光合育种提供了新思路。
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(1)水稻中的光合色素分布在 ，可用 提取。矿质元素是指除C、H、O 以外，植物根系从土壤中吸收
的元素，合成叶绿素分子所需要的矿质元素是 。
(2)miR5810 会 （填“促进”或“抑制”）MRLP6 蛋白合成， （填“升高”或“降低”）光合色素
的含量，进而调节光合作用速率。
(3)双荧光素酶技术可通过测定荧光强度的比值（LUC/REN），实现对目标基因表达水平的定量分析。LUC
和REN 是两种催化不同底物的荧光素酶，通过分别添加不同的荧光素测其荧光强度，计算荧光强度之比。
相比较NFYB7 基因表达载体（如图二）与双荧光素酶基因表达载体（如图三）共转化细胞，只转化双荧
光素酶基因表达载体的细胞中，荧光强度LUC/REN 比值降低，原因是 。
(4)综上所述，NFYB7—miR5810—MRLP6 调节水稻光合作用速率的可能分子机制是 。
【答案】(1) 叶绿体类囊体薄膜上 无水乙醇 N、Mg
(2) 抑制 降低
(3)转录因子NFYB7 与miR5810 基因启动子结合，增强了LUC 基因的表达，而REN 基因表达量相同。
(4)NFYB7 与miR5810 基因的启动子结合增强其表达，miR5810 含量升高抑制了MRLP6 蛋白质的合成，导
致光合色素含量降低，从而抑制了光合作用。
【分析】光合色素主要分布在叶绿体的类囊体膜上，包括叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素。由于光
合色素是脂溶性的，故用有机溶剂无水乙醇进行提取。光合色素的作用是吸收、传递和转化光能。
【详解】（1）水稻中的光合色素分布在叶绿体类囊体薄膜上，由于光合色素是脂溶性物质，所以可用无
水乙醇提取。叶绿素含有C、H、O、N、Mg，因此矿质元素是指除C、H、O 以外，植物根系从土壤中吸
收的元素，合成叶绿素分子所需要的矿质元素是N、Mg。
（2）据图1 分析，miR5810 过表达总光合色素含量低、净光合速率低；MRLP6 低表达总光合色素含量低、
净光合速率也低，两者的影响一致，说明miR5810 过表达抑制MRLP6 蛋白合成，从而降低光合色素的含
量，进而调节光合作用速率。
（3）据图分析，由于转录因子NFYB7 与miR5810 基因启动子结合，增强了LUC 基因的表达，即LUC 荧
光强度增加，而REN 基因表达量相同，即REN 荧光强度不变，所以荧光强度LUC/REN 比值降低。
（4）NFYB7—miR5810—MRLP6 调节水稻光合作用速率的可能分子机制是NFYB7 与miR5810 基因的启
动子结合增强其表达，miR5810 含量升高抑制了MRLP6 蛋白质的合成，导致光合色素含量降低，从而抑
制了光合作用。
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21．（2024·河南·二模）糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能
直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115（对氨苄青
霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1 所示。三种限
制酶的识别序列及切割位点见表，请回答下列问题。
限制酶
BamHI
PstI
XbaI
识别序列和切割位点（5’→3’）
G↓GATCC
C↓TGCAG
T↓CTAGA
(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到 含量高的培养基上，恒温
培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈（不产生蓝色）直径 （填“较大”或“较小”）的菌株。
再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶切割质粒pPIC9K，图2 是高产糖化酶基因示意图（仅示部
分碱基），为使其能定向插入表达载体并成功表达，应在引物的 （5'或3'）端添加
酶识别序列，则PCR 扩增时引物的碱基序列应为下列①-⑥中的 。若扩增4 次，不同时含两种引
物的DNA 分子有 个。
(3)将筛选出的菌株接种至发酵罐内进行扩增，在接种环节要对培养基和发酵设备进行严格灭菌以防止杂菌
污染的原因是 （答出一点即可）。培养过程中可定期取样并常用 （仪器名称）对菌体进
行直接计数，以评估增殖情况。如发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后采用 （答出1 项即
可）等方法获得所需的发酵产品。
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【答案】(1) 淀粉 较大
(2) 5' 限制酶BamHI 和限制酶XbaI ①④ 2
(3) 防止杂菌对实验的干扰，以免影响实验结果 细菌计数板 过滤、沉淀、离心、静置
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）分析题意可知，糖化酶高产菌株能利用淀粉，故需要将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到淀
粉含量高的培养基上；高产菌株分解淀粉快，恒温培养适宜时间后滴加碘液，高产菌株形成的透明圈直径
较大。
（2）为使高产糖化酶基因能定向插入表达载体并成功表达，需要两种不同的限制酶切割，同时需要在高
产糖化酶基因两端加入这两种限制酶的识别序列，结合图1 可知，限制酶PstI 在质粒上有2 个切割位点，
因此应该选择限制酶BamHI 和限制酶XbaI 来切割目的基因和质粒；PCR 过程需要两种引物，能分别与目
的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，结合需要在高产糖化酶基因5’端加入限制酶BamHI 和限制酶
XbaI 的识别序列，PCR 扩增时引物的碱基序列为①5′-TCTAGATCTGTTGAAT-3′和④5′-
GGATCCCTTGGATGAT-3′；若扩增4 次，含有两种引物的DNA 分子有24-2=14 个，不同时含有两种引物
的DNA 分子数为2 个。
（3）在接种环节要对培养基和发酵设备进行严格灭菌以防止杂菌污染的原因是；防止杂菌对实验的干扰，
以免影响实验结果；培养过程中可定期取样并常用细菌计数板对菌体进行直接计数，以评估增殖情况。如
发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后采用过滤、沉淀、离心、静置等方法获得所需的发酵产品。
22．（2024·江西景德镇·模拟预测）热原是由微生物产生的、能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
注射类药物或医疗器材的热原含量检测是评价药物安全的重要指标。
(1)热原能刺激免疫细胞分泌与发热相关的细胞因子（如IL-6）。ELISA 利用IL-6 抗体和IL-6 特异性结合，
可以实现对IL-6 的定量检测（图1）。下列说法正确的有____________（多选）。
A．固相抗体和酶标抗体竞争性结合IL-6 的相同活性位点
B．酶标抗体具有免疫学活性和酶活性，具有多个活性位点
C．实验需设置仅有酶标抗体或仅有上清液的两组对照实验
D．需给予足够长的时间使无色底物充分反应后检测光信号
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E．反应体系中光信号越强则细胞上清液中IL-6 含量越高
(2)现有检测方法中，免疫细胞存在来源少、稳定性差、灵敏度低等问题。因此，科研人员通过基因工程，
将免疫细胞中参与热原反应信号通路的关键基因（TLR4、MD2、CD14）转入HEK293T 细胞系，构建热原
敏感的细胞系解决该问题。原理如图2，回答下列问题。
①从免疫细胞中提取总RNA，经逆转录和PCR 获得TLR4基因，构建真核表达载体，完成上述过程需要用
到的酶有 。
②将基因表达载体通过显微注射技术导入HEK293T 细胞，目的基因有机会整合到HEK293T 的染色体，这
种变异类型属于 。
③提取表达绿色荧光蛋白的细胞DNA，利用引物组合 扩增（图3），如果出现目的基因片段，
初步证明TLR4已整合到染色体上。
④利用同样的方式将MD2-CD14-红色荧光蛋白基因导入HEK293T 的染色体。
(3)经检测，细胞传代培养后导入的基因能够稳定遗传，欲证明热原敏感细胞系可替代免疫细胞实现热原检
测，还需设计哪些实验? 。
【答案】(1)BCE
(2) 逆转录酶、耐高温的DNA 聚合酶、限制酶、DNA 连接酶 基因重组 1 和4
(3)以免疫细胞为对照组，热原敏感细胞系为实验组，利用热原刺激两组细胞，检测实验组灵敏度、稳定性
是否优于对照组
【分析】医学上常用双抗体夹心法定量检测S 蛋白，基本原理为：两种抗体与检测的抗原均能结合，但结
合部位是不同的，而酶标抗体的作用是与待测抗原结合，另外通过酶催化检测底物反应，可通过测定酶反
应产物量来判断待测抗原量。
【详解】（1）A、由图可知，固相抗体和酶标抗体没有竞争性结合IL-6 的相同活性位点，而是结合不同的
位点，A 错误；
B、酶标抗体既能与抗原结合，具有免疫学活性，又能与酶结合，具有酶的活性，B 正确；
C、本实验是根据颜色变化来，可以实现对IL-6 的定量检测，为保证结果的准确性，实验需设置仅有酶标
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抗体或仅有上清液的两组对照实验，C 正确；
D、实验组只要和对照组时间相同，就可以检测光信号，可以不给予足够长的时间，D 错误；
E、ELISA 流程中，光信号的强度与酶标抗体的含量呈正相关，间接反映了-6 的含量，光信号越强，L-6 越
多，E 正确。
故选BCE。
（2）①逆转录和PCR，需要逆转录酶、耐高温的DNA 聚合酶，构建真核表达载体需要限制酶、DNA 连
接酶。
②将基因表达载体通过显微注射技术导入HEK293T 细胞，目的基因有机会整合到HEK293T 的染色体，这
种变异类型属于基因重组。
③利用PCR 进行DNA 扩增时，需要将引物连接到母链的3，端，因此选择引物1 和4。
（3）实验的目的是证明热原敏感细胞系可替代免疫细胞实现热原检测，实验的自变量是细胞的种类，因
变量为热源的敏感性，因此可以以免疫细胞为对照组，热原敏感细胞系为实验组，利用热原刺激两组细胞，
检测实验组灵敏度、稳定性是否优于对照组。
23．（2024·湖北·三模）“杂交水稻之父”袁隆平利用雄性不育野生稻改写了世界水稻育种史，杂交水稻
研究团队不断刷新我国水稻产量和品质，举世瞩目。请分析回答：
(1)水稻（2n=24）是禾本科植物，在我国有野生种、引进种：杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，
这主要体现了生物多样性的 价值。在育种研究中，对水稻进行基因组测序要测
条染色体中DNA 的碱基序列。
(2)安农S-1 是我国发现的第一个籼稻（水稻的一个品种）光温敏雄性不育系。该光温敏雄性不育系与9 种
常规雄性可育系进行正反交，得到的F1均为雄性可育。据此可推出有关该雄性不育基因的两个结论是：
。
(3)另有一个水稻品系，其雄性的育性由一对等位基因M、m 控制，基因型为mm 的个体表现为雄性不育，
能产生正常的雌配子，M 基因可使雄性不育个体恢复育性产生可育雄配子。通过转基因技术将M 基因与雄
配子致死基因A、蓝色素生成基因D 一起导入基因型为mm 的个体中，并使其插入一条不含m 基因的染色
体上（D 基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D 基因的种子呈现白色）。如图：
①图中基因型为mmADM 的个体自交时（不考虑突变和互换），子代种子的表型及比例为 ，
这种转基因改良品系的显著优点是 。
②要成功得到转基因个体（mmADM），先要构建基因表达载体。研究人员准备在已插入M 基因的运载体
（如下图）中再插入A、D 融合基因。他们分析发现A、D 融合基因拼接处存在XbaI 的识别序列，为使基
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因表达载体中A、D 融合基因和M 基因都正确表达，应
在A、D 融合基因两端添加 两种限制酶的识别序列，并用 两种限制酶对运载
体进行酶切。
【答案】(1) 直接 12
(2)①雄性不育基因位于细胞核中②雄性不育基因是隐性基因
(3) 蓝色和白色≈1：1 根据种子的颜色即可判断育性（或答蓝色用于留种制备新的品系，白色用
作制备杂交种时做母本） SpeI、EcoRI XbaI、EcoRI
【分析】题图分析：雄性不育个体mm 通过转基因技术，得到基因型为mmADM 个体，其中含有A 基因的
可使雄配子致死，含M 可使雄性不育个体恢复育性，基因D 的表达可使种子呈现蓝色，无基因D 的种子
呈现白色。
【详解】（1）杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，体现了生物多样性的直接价值，水稻属于二
倍体生物，不含性染色体，所以基因组测序需测定其一个染色体组即12 条染色体上的DNA 分子上的碱基
序列。
（2）依据题干信息，光温敏雄性不育系与9 种常规雄性可育系进行正反交，所得的F1 均为雄性可育，说
明了①雄性不育基因位于细胞核中；②雄性不育基因是隐性基因，雄性可育基因为显性基因。
（3）①依据题干信息可知，A 基因为雄配子致死基因，所以当基因型为mmADM 的个体自交时，可以产
生mADM、m 的雌配子，而只能产生m 的雄配子，雌雄配子随机结合，就可以产生mmADM 和mm 的基
因型，对应的育性表现为雄性可育、雄性不育。由于D 基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D 基因的种
子呈现白色，所以，子代种子的表型及比例为蓝色和白色≈1：1，这种改良品系的优点是：可以根据种子
的颜色来判断育性。
②依据题干要求，需在已插入M 基因的运载体中再插入A、D 融合基因，而且使基因表达载体中A、D 融
合基因和M 基因都正确表达。已知A、D 融合基因拼接处存在XbaI 的识别序列，D 基因和M 基因的拼接
处含有EcoRI 的识别序列，且限制酶XbaI 和SpeI 所产生的的黏性末端相同，所以在切割运载体时，运载
体是应用限制酶XbaI、EcoRI 进行酶切，不可使用限制酶SpeI，因为若使用该酶会破坏M 基因。但在A、
D 融合基因两端应添加SpeI、EcoRI 两种限制酶的识别序列，确保其正向连接。
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24．（2024·重庆九龙坡·二模）葡萄酒中的氨基甲酸乙酯（EthylCarbamate，EC）是一种潜在致癌物，主要
由尿素和乙醇反应生成。通过在亲本酿酒酵母菌株中，敲除一个拷贝的精氨酸酶基因CAR1，同时选用强
启动子PGK1 过表达脲基酰胺酶基因DUR1、2，来获得低产EC 的重组酿酒酵母菌株。与亲本菌株相比，
重组酿酒酵母菌株发酵性能及风味物质不受影响，尿素和EC 的含量分别降低了40.38%和34.45%。满足葡
萄酒相关领域对酵母的较高要求，有广泛的应用前景。
(1)下图为目的基因脲基酰胺酶基因DUR1、2 的部分序列：
模板链3'-TACTGTCAATCA……ATGACGGCCACT-5'
编码链5'-ATGACAGTTAGT……TACTGCCGGTGA-3'
利用PCR 扩增目的基因应选择的一对引物是____
A．5'-TACTGCCGGTGA-3'
B．5'-ATGACAGTTAGT-3'
C．5'-TCACCGGCAGTA-3'
D．5'-ACTAACTGTCAT-3'
(2)如图所示，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择 （填写酶的具体名称）识别并切割质粒，再
用DNA 连接酶连接。氨苄青霉素抗性基因的作用是 。
(3)已知目的基因上无相关酶切位点，应在引物的 （填5'或3'）端设计酶切序列，目的基因上游设计的
酶切序列+引物序列为5'- -3'。
(4)已知DUR1、2 基因的转录模板链为A 链，如果采用一定方法将目的基因与质粒进行反向连接，构建出
反义DUR1、2 基因，则其转录模板链为 链。将其导入之前的转基因工程菌中，其结果无法获得低EC
产品，推测其原因可能是 。
【答案】(1)BC
(2) EcoR I 和BamH I 筛选含有目的基因的受体细胞
(3) 5’ 5’-GAATTCATG ACAGTTAGT-3’
(4) B 以B 链为模板转录出的RNA 与以A 链为模板转录出的RNA 配对形成双链，抑制了
DUR1、2 基因的表达
【分析】基因工程技术的基本步骤：
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（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——DNA 分子杂交技术；②检测
目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技
术；
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，BC 正确，
AD 错误。
故选BC。
（2）由图可知，在强启动子和终止子中间含有限制酶EcoRI 和BamHI 的识别位点，因此构建基因表达载
体时为避免反向拼接应选择EcoRI 和BamHI 识别切割质粒，再用DNA 连接酶进行连接；氨苄青霉素抗性
基因的作用是筛选含有目的基因的受体细胞；
（3）引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故应在引物的5’端设计酶切序列，扩增
目的基因时其右边需要添加EcoRI 识别序列5'-GAATTC-3'，且引物需要与模板链碱基序列3'端进行互补配
对，故扩增目的基因时所用引物的碱基序列是5’-GAATTCATG ACAGTTAGT-3’；
（4）已知DUR1，2 基因的转录模板链为A 链，反义DUR1，2 基因其转录模板链为B 链。以B 链为模板
转录出的RNA 与以A 链为模板转录出的RNA 配对形成双链，抑制了DUR1，2 基因的表达，因此转反义
DUR1，2 基因酵母工程菌中内源的DUR1、2 基因表达受阻。
25．（2024·海南儋州·一模）In—Fusion 是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与
线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序列），经In—Fusion 酶（能从线性DNA 分子链的末端按
3'→5'的方向顺次水解若干个磷酸二酯键）处理后可实现无缝连接，基本过程如图所示，其中Amp'表示氨
苄青霉素抗性基因。回答下列问题：
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(1)过程①中引物1、2 设计的依据是 ，除引物外，反应体系中还需添加的物质有 。
(2)过程①和②通常不能在同一反应体系中进行，主要原因是两对引物之间会发生 。过程②所获得的
线性化质粒含有 个游离磷酸基团。
(3)过程③中，DNA 片段先经In—Fusion 酶处理形成 ，降温后通过碱基互补配对而形成“结合体”。
过程④需用 处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。导入后的重组质粒利用大肠杆菌细胞中的
酶，实现完全环化。
(4)转化后，利用含 的选择培养基初筛获得目标大肠杆菌，提取细胞内的DNA，经 （方法）进
一步鉴定与验证重组质粒。
(5)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 技术的优势主要有 。
【答案】(1) 目的基因两端碱基序列 DNA 模板、TaqDNA 聚合酶、dNTP（脱氧核苷三磷酸）、
含Mg2+的磷酸缓冲液
(2) 碱基互补配对 2
(3) 黏性末端 Ca2+ DNA 连接酶
(4) 氨苄青霉素 DNA 分子杂交技术
(5)不受限制酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法
是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水
平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了
mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴
定、活性鉴定等。
2、分析题图：①利用PCR 技术将质粒线性化；②PCR 扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③
目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion 酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。
【详解】（1）引物是根据目的基因的核苷酸序列人工合成的两段短的单链DNA，能与目的基因两端的碱
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基序列互补配对的，因此过程①中引物1、2 设计的依据是目的基因两端碱基序列。PCR 扩增时需要引物、
DNA 模板、aqDNA 聚合酶、dNTP（脱氧核苷三磷酸）、含Mg2+的磷酸缓冲液。
（2）过程①和②通常不能在同一反应体系中进行，主要原因是两对引物之间会发生碱基互补配对，从而
缺少PCR 扩增的引物，无法进行正常的扩增。过程②所获得的线性化质粒含有2 个游离磷酸基团。
（3）Fusion 酶能从线性DNA 分子链的末端按3'→5'的方向顺次水解若干个磷酸二酯键，从而获得黏性末
端，然后降温后通过碱基互补配对而形成“结合体”。为了便于重组质粒导入受体细胞大肠杆菌，过程④
需用Ca2+处理大肠杆菌，增大其细胞膜通透性。导入后的重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA 连接酶，
实现完全环化。
（4）由于重组DNA 分子上含有氨苄青霉素抗性基因，因此转化后，利用含氨苄青霉素的选择培养基初筛
获得目标大肠杆菌，提取细胞内的DNA，经DNA 分子杂交技术进一步鉴定与验证重组质粒。
（5）与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 技术的优势主要有不受限制酶切位点的限制；可以把目
的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏。
26．（2024·山西晋中·模拟预测）镰刀菌会造成小麦赤霉病，受感染的麦穗出现红色霉层，不仅造成减产，
还会产生霉素，造成食品安全方面的问题。我国科学家从小麦近缘属植物长穗偃麦草中首次克隆出主效抗
赤霉病基因Fhb7（编码一种谷胱甘肽S 一转移酶），为解决小麦赤霉病的世界性难题提供了“金钥匙”。
研究发现，用光诱导型启动子（PrbcS）能够使Fhb7 基因表达，其结合T 基因后能使Fhb7 基因更高水平表
达。
(1)Fhb7 基因可在不同种的禾谷类作物细胞中转录并翻译出相同的谷胱甘肽转移酶，这说明 （答出
2 点即可）。
(2)PrbcS 是一段有特殊结构的DNA 片段，能被 识别并结合，驱动基因的持续 过程。
(3)通过PCR 技术可从长穗偃草中获得Fhb7 基因并大量扩增，首先要根据已知的核酸序列，设计具有特异
性的 ，使 酶能够从其 端开始连接脱氧核苷酸。
(4)如图，甲、乙均为Fhb7 基因表达载体构建过程中的中间载体。区别含有中间载体甲与含有重组载体丙
的微生物的方法是 。经酶切后凝胶电泳，测得含2B 基因片段长度为0.3kb，经图示信息分析，含光
诱导型启动子一T 基因的片段长度约为 。据图分析，形成重组载体丙，需要使用 限制酶切
割中间载体甲和乙，图中重组载体丙问号处有 种限制酶的酶切位点。
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【答案】(1)生物共用一套遗传密码，还可以说明它们有共同的祖先
(2) RNA 聚合酶 转录
(3) 引物 DNA 聚合酶 3’
(4) 用含有卡那霉素的培养基培养 1.8kb HindIII+NotI 或HindIII+EcoRI 2
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。前提条件：要
有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成-对引物。过程：①高温变性：DNA 解旋过程(PCR 扩增中双链
DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温
延伸：合成子链。
【详解】（1）Fhb7 基因可在不同种的禾谷类作物细胞中转录并翻译出相同的谷胱甘肽转移酶，这说明生
物共用一套遗传密码，还可以说明它们有共同的祖先。
（2）分析题意可知，PrbcS 属于启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，能被
RNA 聚合酶识别并结合，用于驱动基因的持续转录。
（3）通过PCR 技术可从长穗偃草中获得Fhb7 基因并大量扩增，首先要根据已知的核酸序列，设计具有特
异性的引物，使DNA 聚合酶能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸。
（4）由图可知，中间载体甲上不含卡那霉素抗性基因，而含有重组载体丙含有卡那霉素抗性基因，故含
有重组载体丙的微生物能在含有卡那霉素的培养基中生长，而含有中间载体甲不能在含有卡那霉素的培养
基中生长；由图可知，载体乙的长度为3.6kb，经酶切后凝胶电泳，测得2B 片段为0.3kb，设光诱导型启
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动子+T 基因的长度为y，则3.6-0.3+y=5.1kb，解得y=1.8kb；故据图分析，甲的启动子-T 基因的左侧为
HindШ，右侧和乙2B 右侧相同的是NotⅠ、EcoRI 的酶切位点，因此形成重组载体丙，需要使用
HindIII+NotI 或HindIII+EcoRI 切割目的基因和载体，图中重组载体丙问号处限制酶的酶切位点可为
EcoRl、NotI 的酶切位点，有2 种酶切位点。
27．（2024·全国·模拟预测）科学家从紫苏中提取DGATI 基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四
尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产的四尾栅藻的部分流程如图。
质粒pCAMBIA 与PCR 扩增出的DGAT1 含有的酶切位点如图所示。现有BamHI、BgIII 、EcoRI 三种限制
酶，它们识别并切割的碱基序列如表。
BamHI
BgIII
EcoRI
(1)过程②所需的技术是 ，②的产物的鉴定方法是 。
(2)将表达载体导入大肠杆菌时需要在培养液中加入
，目的是使大肠杆菌处于 的生理状态，将
目的基因导入大肠杆菌的目的是 。
(3)将DGAT1 与pCAMBIA 分别用限制酶切割后进行连接可形成重组质粒，重组质粒将不会被BamHI 或
BgIII 切割，原因是 。
(4)若只考虑DNA 片段的两两连接，构建重组质粒时可得到3 种大小不同的连接产物，长度分别为 。
(5)配制大肠杆菌的培养基由于加入了 ，因此从作用上来看属于 长出的菌落不一定都是含有
重组质粒的大肠杆菌，也可能是含有 的大肠杆菌，因此需要进一步筛选。
【答案】(1) PCR 琼脂糖凝胶电泳
(2) 感受态 对目的基因进行保存和扩增
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(3) BamHI 识别序列为5'−GGATCC−3'， BglⅡ识别序列为5'−AGATCT−3'，而重组质粒在切割位点的序列
为5'−GGATCT−3'，不能被BamHI 和BglⅡ识别切割
(4)4800bp、1600bp、3200bp
(5) 卡那霉素 选择培养基 空质粒（或未插入目的基因的质粒）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因—DNA 分子杂交技术；②检测目
的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原抗体杂交技术；
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等。
【详解】（1）过程②为PCR 技术，在两个引物的5'端，加上限制酶识别序列，就可以得到②的产物；常
用琼脂糖凝胶电泳的方法来鉴定PCR 产物；
（2）将表达载体导入大肠杆菌时，在培养液中加入Ca2+可以使大肠杆菌处于感受态，使重组的表达载体
更容易进入大肠杆菌；将目的基因导入大肠杆菌的目的是使目的基因随大肠杆菌的增殖而保存和扩增；
（3）将DGAT1 与pCAMBIA 分别用限制酶切割后进行连接可形成重组质粒，重组质粒将不会被BamHI 或
BgIⅡ切割，原因是BamHI 识别序列为5'−GGATCC−3'， BglⅡ识别序列为5'−AGATCT−3'，而重组质粒在
切割位点的序列为5'−GGATCT−3'，不能被BamHI 和BglⅡ识别切割，
（4）因为质粒与目的基因的两侧都有相同的黏性末端，若只考虑DNA 片段的两两连接，此处可以有质粒
自连、目的基因自连、以及质粒与目的基因相连3 种情况，由于质粒大小为2400bp，目的基因大小为
800bp，因此构建重组质粒时可得到3 种大小不同的连接产物，长度分别为4800bp、1600bp、3200bp；
（5）导入的重组质粒中的标记基因为卡那霉素抗性基因，因此培养基中要添加卡那霉素，以筛选出导入
重组质粒的大肠杆菌，因此培养基按作用来看，属于选择培养基。但是由于空质粒（未插入目的基因的质
粒）也含有卡那霉素抗性基因，因此得到的大肠杆菌，不一定是含有重组质粒的大肠杆菌，也可能是含有
空质粒（未导入目的基因的质粒）的大肠杆菌，因此需要进一步筛选。
28．（2024·山西吕梁·二模）中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）是可以无限增殖的细胞。科研人员利用CHO
细胞系生产乙肝疫苗的过程是：①将得到的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因与信号肽基因连接形成融合
基因，信号肽可以引导HBsAg 进入内质网内进行合成和加工，进而以分泌蛋白的形式分泌到胞外，融合基
因的结构如图1 所示；②将融合基因插入图2 所示的质粒，将重组质粒与带有小鼠二氢叶酸还原酶
（dhfr）基因的质粒共转染缺乏二氢叶酸还原酶的CHO 细胞；③从CHO 细胞系的培养液中分离提取
HBsAg，用以生产乙肝疫苗。图1 中的F1~F4分别为扩增信号肽基因和HBsAg 基因时所需的引物。请回答
下列问题：
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(1)需要通过 技术扩增融合基因，该技术的原理是 。
(2)为了将信号肽基因和HBsAg 基因连接在一起，在分别扩增两种基因时，应在引物F2和引物F3的5′端引
入 。通过PCR 检测融合基因是否形成，可选用图1 中引物 对连接产物进行扩增。
(3)为了将融合基因正确地插入图2 所示的质粒，应选择限制酶 切割质粒。与单独将HBsAg 基因转
入CHO 细胞相比，导入融合基因的好处是 。
(4)缺乏dhfr 的CHO 细胞在培养基上不能正常生长，因此在筛选表达HBsAg 的细胞株时，dhfr 基因起
的作用。
(5)在生物反应器中大规模连续培养目标细胞株时，通过 的措施，为培养的细胞株营造无毒的环境。
同时要通入 和5%CO2的混合气体，其中CO2的主要作用是 。
【答案】(1) PCR DNA 半保留复制
(2) 一段互补序列 F1 和F4
(3) MunⅠ和SalⅠ 信号肽可以引导HBsAg 以分泌蛋白的形式分泌到细胞外，便于从CHO 细胞培养
液中提取HBsAg
(4)标记基因（或筛选）
(5) 定期更换培养液 95%空气 维持培养液的PH
【分析】PCR 技术全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。原理：
DNA 半保留复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。条件：模板DNA、
四种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA 聚合酶。过程：变性：DNA 解旋，高温条件下氢键解开；复性：
引物结合到互补链DNA 上；延伸：在耐高温的DNA 聚合酶催化作用下合成子链。
【详解】（1）扩增目的基因可采用PCR 技术，该技术原理是DNA 半保留复制。
（2）①为了将信号肽基因和HBsAg 基因连接在一起，在分别扩增两种基因时，应在引物F2 和引物F3 的
5′端引入一段互补序列，第一次扩增后，可得到带有互补序列的子链，在进行第二次扩增时，互补序列可
与另一个基因上的互补序列配对结合，形成新的杂交基因，再进行扩增即可获得连接在一起的融合基因；
②据图1 可知，形成融合基因后可选用引物F1 和F4 对融合基因进行PCR 扩增。
（3）①据图2 可知，限制酶XhoⅠ会破环终止子，限制酶NheⅠ会将质粒上的终止子切掉，因此应选择限制
酶MunⅠ和SalⅠ切割质粒；
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②根据题干信息可知，信号肽可以引导HBsAg 进入内质网内进行合成和加工，进而以分泌蛋白的形式分泌
到胞外，因此与单独将HBsAg 基因转入CHO 细胞相比，融合基因信号肽基因表达信号肽可以引导HBsAg
以分泌蛋白的形式分泌到细胞外，便于从CHO 细胞培养液中提取HBsAg。
（4）根据题干信息可知，融合基因需要插入带有dhfr 基因的质粒共转染缺乏二氢叶酸还原酶的CHO 细胞，
只有带有重组质粒的CHO 细胞可以在培养基上生长，因此在筛选表达HBsAg 的细胞株时dhfr 基因起标记
基因的作用，便于快速筛选获得转基因成功的CHO 细胞。
（5）①在生物反应器中大规模连续培养目标细胞株时，为了防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，
需要通过定期更换培养液的方法，为培养的细胞株营造无毒的环境；
②③在生物反应器中要通入95%空气和5%CO2 的混合气体，其中CO2 的主要作用是维持培养液的PH。
29．（2024·山东泰安·二模）研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用
于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT 是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性
降解区域ODD（多肽）的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人
员以RTA 作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT 的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用
ODD 的作用减轻RTA 对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融
合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。
(1)可采用PCR 的方法获取融合基因TAT-RTA，需要根据TAT 和RTA 基因设计引物，引物的作用是
。已知RTA 基因和欲得到的TAT-RTA 融合基因的结构如图1 所示，TAT 基因编码链序列
5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1 的5′端
加入 酶切位点，引物2 的5′端加入 酶切位点，利用TAT 和RTA 核酸序列设计引
物时，要求在RTA 蛋白的前端引入TAT 短肽，请根据要求写出引物1 （写出引物5′端的12 个
碱基即可）。
(2)载体的部分结构如图2 所示，His 标签由连续的6 个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，
将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但是在研究时，发现融合
蛋白中没有His 标签蛋白，据图分析原因是 。可通过引物2 的特殊设计使His 标签正常表达，
请结合图1 和图2 写出引物2 （引物中如需添加碱基补足对应的密码子，可以添加任意碱
基）。
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【答案】(1) 与模板DNA 单链互补配对实现连接，并且使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱
氧核苷酸 BamH Ⅰ Xbo Ⅰ 5'GGATCCATGAGC3'
(2) DNA 连接酶 限制酶2 识别序列后面的一个碱基A 与His 标签基因编码链的前两个碱基CA 编
码一个氨基酸，导致His 标签基因对应的mRNA 的密码子被错位读取
5'CTCGAGTAGAACTGGCTGCTCGGCGG3'
【分析】多聚酶链式反应扩增DNA 片段：
（1）PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 中游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链
的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原
因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
（2）PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）PCR 中，引物的作用是与模板DNA 单链互补配对实现连接，并且使DNA 聚合酶能够从引
物的3'端开始连接脱氧核苷酸。据图1 可知，TAT-RTA 融合基因TAT 靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的位点，
RTA 靠近终止子一侧有Xbo Ⅰ的位点，则引物1 的 5′端加入BamH Ⅰ，引物2 的5′端加入Xbo Ⅰ。TAT 基因
编码链序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5'端需插入BamH Ⅰ的识
别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5'端应包含BamH Ⅰ的识别序列，故设计为
5'GGATCCATGAGC3'，以便BamH Ⅰ切出相应的黏性末端。
（2）切割后的DNA 片段需要用DNA 连接酶连接成完整DNA 分子。由图2 可知， 限制酶2 识别序列与
His 标签序之间多出一个碱基A，这一个碱基A 与His 标签基因编码链的前两个碱基CA 编码一个氨基酸，
导致His 标签基因对应的mRNA 的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His 标签蛋白，所以可在A 碱
基左右侧再（随意）插入两个碱基，方可不打乱His 标签基因，结合图1 引物2 的方向、Xbo Ⅰ的识别序列
及碱基互补配对原则可知，引物2 为5'CTCGAGTA（TA 为补充碱基）G（与模版链配对的）
AACTGGCTGCTCGGCGG3'。
30．（2024·江苏·模拟预测）人体内的t-PA 蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心
梗患者注射大剂量的基因工程t-PA 会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA 第84 位的半胱氨酸换成丝氨酸，
能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA 基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达
该突变基因，可制造出性能优异的t-PA 突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR 技术获取t-PA 改良基因和利
用质粒pCLY11 构建含t-PA 改良基因的重组质粒示意图（图中重叠延伸PCR 过程中引物a、b 用来扩增突
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变位点的上游DNA 序列，引物c、d 用来扩增突变位点的下游DNA 序列）。请回答下列问题。
(1)科学家将t-PA 第84 位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA 突变蛋白的生物技术手段属于
范畴。
(2)获得性能优良的t-PA 突变蛋白的正确顺序是 （选择正确编号并排序）。
①t-PA 蛋白功能分析和结构设计②借助定点突变改造t-PA 基因序列③检验t-PA 蛋白的结构和功能④设计t-
PA 蛋白氨基酸序列和基因序列⑤利用工程菌发酵合成t-PA 蛋白
(3)已知t-PA 蛋白第84 位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA 基因的上链）上的碱基序列是ACA，
丝氨酸的密码子是UCU。重叠延申PCR 示意图中的黑点便是突变部位的碱基，引物b 中该突变位点的碱
基是 ，引物c 中该突变位点的碱基是 。
(4)据图可知，重叠延伸时，需要的引物是 ，引物的作用是 。若扩增图中序列时引物选择正确，
PCR 操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现
此情况的原因 。
(5)若获得的t-PA 突变基因如图所示，那么质粒pCLY11 需用限制酶 切开，才能与t-PA 突变基因高效
连接。
【答案】(1)蛋白质工程
(2)①④②⑤③
(3) G C
(4) 引物a 和引物d 使DNA 聚合酶从引物的
端开始连接脱氧核苷酸 退火（复性）温度过
低、引物特异性不高
(5)Xmal、BglⅡ
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细
胞、目的基因的检测与鉴定。
2、蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合
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成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，蛋白质工程是在基因工程
的基础上延伸出来的第二代基因工程。
【详解】（1）由题干信息可知，上述生产改良t-PA 蛋白的技术是先对天然的t-PA 基因进行序列改造，然
后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良t-PA 蛋白，因此属于蛋白质工程。
（2）蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→
合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，获得性能优良的t-PA 突
变蛋白的正确顺序是① t-PA 蛋白功能分析和结构设计→④设计t-PA 蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助
定点突变改造t-PA 基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t-PA 蛋白→③检验t-PA 蛋白的结构和功能。
（3）已知t-PA 蛋白第84 位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA 基因的上链）上的碱基序列是
ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA 蛋白第84 位的半
胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA 基因上链第84 位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b 与t-PA 基因的
下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c 与t-PA 基因的上链互补，故
其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C。
（4）由于DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA 链，因此PCR 中需要加入合适的
引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3'端结合，故据图可知，重叠延伸时，需要的引物是引物a 和
引物b；DNA 聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA 链，因此引物的作用是使DNA
聚合酶从引物的 3 ′ 端开始连接脱氧核苷酸；出现非目的序列产物的原因有：引物设计太短（或引物
特异性不强，即与非目的序列有同源性）、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、
Mg2+浓度过高、DNA 模板出现污染等。
（5）根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制
酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t-PA 改良基因高效连接。
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