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专题06 基因工程类
1．（2024·山东泰安·二模）为获得转R—GFP 融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因（RFP）
插入含Gata3 基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一
只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP 转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限
制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R 为不同引物。
(1)在PCR 反应溶液中常添加 ，其作用是 。在利用PCR 扩增RFP 编码区序列的过程中，需要设计引
物F 和R，在两个引物的（填“3'”或“5'”） 端需分别插入 的限制酶识别序列，以使RFP 基因能正确
插入载体中。用于扩增RFP 编码区序列的引物需满足的条件是 。
(2)在RFP 基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有 。
(3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，选取1～5 五只小鼠，从中提取含
Gata3 基因的相关DNA 片段，设计了引物A 和C 用于PCR 扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则 小
鼠是Gata3—RFP 基因纯合子小鼠；若用引物A 和B 进行PCR 扩增， （填“能”或“不能”）区分
RFP 转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是 。
(4)为制备大量单链DNA 片段，研究人员常采用不对称PCR 技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，
经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引
物）的延伸产物，结果获得大量单链DNA（ss—DNA）。若反应体系中原有100 个模板DNA，最初10 个
循环后限制性引物耗尽，再进行20 个循环，理论上可制备ss—DNA 个（用科学计数法表示），在这30
个循环中ss—DNA 的产生量主要受 的影响。
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2．（2024·江苏南通·二模）人类y 基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合
BCL11A 蛋白后，y 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对y 基因表达的抑制，可对某
种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载
体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，
在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。PCR 缓冲
体系中除图示条件外还要加入 （至少2 个）。获得扩增产物后，应选择限制酶 切割载体。本实验
中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入 （选填“保留”、“除去”）BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6
与R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R 扩增产物的受体细胞无荧光。据图分析，
构建成功的基因表达载体上荧光蛋白基因和BCLIIA 基因转录时的模板链在 （选填“相同”、“不
同”）的DNA 链上，含F7与R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的 ，含F1～F4与R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R 扩增产物
的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点
序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 在调控序列上所对应序列之间的区段上，理
由是 。
3．（2024·黑龙江大庆·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，从而导致可溶
性糖含量高，汁多质脆，研究发现这与甜玉米G 蛋白含量较高有关。为提高甜玉米的商品价值，科研人员
培育出了超量表达G 蛋白的转基因甜玉米新品种。在超量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti
质粒的酶切位点如图1、2 所示。
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(1)图1 中，强启动子是一段在特殊序列结构的DNA 片段。位于基因的 驱动基因持续转录，该转录
过程中模板链的5’端位于 （填“M”或“N”）端。
(2)图2 所示载体为农杆菌的Ti 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的 转移到被侵染
的细胞，并且将其整合到 。
(3)结合图1 和图2，为使DNA 片段能定向插入Ti 质粒中，可用PCR 技术在DNA 片段的两端添加限制酶识
别序列，M、N 端添加的序列分别是限制酶 的识别序列。
(4)外植体经脱分化过程形成的愈伤组织放入农杆菌液（含重组Ti 质粒）浸泡后，进行植物组织培养时培养
基中需加入 进行筛选，最终获得玉米植株Y1、Y2、Y3.通过对3 个植株的G 蛋白表达量和还原
糖的含量进行测定，发现Y3 植株的G 蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，原因可能是
。
(5)下图为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA 需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后
方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将
吗啉反义寡核苷酸（RNA 剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制
提出一种假说：吗啉反义寡核苷酸可能导致RNA 前体上内含子1 和外显子2 的对应序列同时被剪切，而不
是内含子1 对应序列被单独剪切。（外显子：基因中编码蛋白质氨基酸的片段。内含子：基因中不编码蛋
白质氨基酸的片段。）
为证明该假说，设置两组实验，一组玉米受精卵中导入吗啉反义寡核苷酸，另一组不导入。提取两组受精
卵中的RNA，逆转录合成DNA（即cDNA）：
①以cDNA 为模板，选择图示引物 进行PCR，产物进行电泳鉴定，根据是否有扩增产物及产物大
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小判断该假说是否成立。
②若某次电泳结果发现实验组和对照组均没有出现任何条带，从PCR 反应成分的角度分析，
可能的原因是 （至少写出1 点）。
4．（2024·浙江宁波·二模）草甘膦是一种除草剂，但会影响水稻产量。水稻产量与高产基因有关，研究人
员拟采用农杆菌转化法对水稻高产基因进行定位，并进一步培育能稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。
回答下列问题：
Ⅰ.水稻高产基因定位水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌 Ti 质粒的 T－DNA 可以转移并随机插入野生型
水稻基因组中（可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点），导致被插入的基因功能丧失，从而
得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体，并进行下列研究。
(1)提取 DNA。采集适量突变体和野生型水稻的幼嫩叶片，分别冷冻后研磨成粉末状，依次加入SDS、
RNA 酶等试剂，去除蛋白质和 等大分子杂质。提取过程中需加入 酶抑制剂并保持轻柔操作，以
避免 ，从而提高总 DNA 提取率。
(2)PCR 扩增。对提取获得的两组总DNA 分别进行PCR 扩增。为避免外源DNA 等因素的污染，微量离心
管、枪头和蒸馏水等在 PCR 前需进行 处理。可以通过在紫外灯下直接观察电泳结果中DNA 条带的
及粗细程度来评价扩增是否成功。
(3)结果鉴定。分别用EcoRI、Hind Ⅲ、BamHI 三种限制酶处理突变体总DNA 扩增产物，处理后进行电泳，
并与野生型 DNA 和 Ti 质粒对照。电泳后的 DNA 与含放射性同位素标记的 DNA 探针（T－DNA 的一
条单链） 进行杂交，得到突变体总 DNA 不同酶切处理后的放射性检测结果如图1 所示。
①不同酶切结果的杂交带位置不同的原因是：不同酶切后含 的片段长度不同，因此各组 DNA 片段在
凝胶中电泳时的 不同，最终导致分布于不同位置。
②若杂交结果显示突变体在不同限制酶处理时均出现杂交带，野生型组 （填“有”或“无”） 杂交
带， Ti 质粒组 （填“有”或“无”） 杂交带，则表明T－DNA 成功插入水稻染色体基因组中，且
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可判断突变体为T－DNA 位点插入，依据是 。（注：T－DNA 上没有 EcoRI、HindⅢ、BamHI
三种限制酶的酶切位点）。
(4)用某种限制酶处理突变体的DNA（如图2 所示），断开DNA 分子中的 个磷酸二酯键，再用 将
两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用下表中的引物①②进行 PCR，扩增出 序列，扩增产物
（填“不含”或“含”）T－DNA 完整序列。经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T－DNA 插入2
号染色体上的B 基因中。
T-DNA 序列
引物序列
5ˊ-AACTATGCGC…….CGTAGCCTAT-3ˊ
①5ˊ-
GCGCATAGTT-3ˊ
3ˊ-TTGATACGCG…….GCATCGGATA-5ˊ
②5ˊ-
CGTAGCCTAT-3ˊ
(5)研究发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测 B 基因可 （填“促进”或“抑制”） 水稻穗
粒的形成，可控制高产性状。
Ⅱ.抗草甘膦高产水稻培育，研究者构建如图3 所示的Ti 表达载体，采用农杆菌转化法将抗草甘膦基因R 和
基因B 转入野生型水稻中，培育稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。
(6)转基因技术的理论基础有：T－DNA 和水稻 DNA 均为 结构、生物界共用一套 等。
(7)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti 质粒中的CaMV35S 是 ，其功能是 酶的识别和结合部位。
Ti 表达载体中，B 基因和R 基因转录的模板链的方向 （填“相同”或“相反”）。
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(8)现需选出单一位点插入R 基因和B 基因且稳定遗传的水稻新品种，筛选方案如下：
①转基因后的水稻植株自交，收获种子（F₁） 并播种在含 的选择培养基上，若能够萌发并生长的个体
即为 的个体；
②F₁ 存活个体自交所得种子（F₂） 按单株收种并播种于选择培养基上，选择存活率约 的培养基中的
幼苗继续培养获得F₂ 植株；
③将F₂ 植株自交所得种子（F₃）按单株收种并播种于选择培养基上，选择种子全部存活的培养基中的幼苗
即为单一位点插入且 的抗草甘膦植株。
④为实现最终育种目标，研究人员还需检测 。
5．（2024·山东枣庄·二模）fat1 基因和fat2 基因控制的酶分别调控两种多不饱和脂肪酸的合成，两种酶的
共同表达对于细胞内多不饱和脂肪酸的合成具有协同效应。2A 肽是一种来源于病毒的短肽，受2A 基因序
列控制。2A 基因的转录产物可以通过“核糖体跳跃”断开位于2A 肽尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，将
2A 基因编码的蛋白分割成2 个独立蛋白。图甲表示科研人员利用重叠延伸PCR 技术成功构建融合基因fat1
—2A—fat2 的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1~F4、R1~R4 表示引物。
通过基因工程成功实现了fat1 基因和fat2 基因在小鼠体内的共同表达，大大提高了细胞内多不饱和脂肪酸
的含量。
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(1)利用PCR 技术可以实现在体外快速大量进行DNA 扩增，其与细胞内DNA 复制的共同点是 （答出2
点）。若图乙中融合基因的b 链为模板链，则图甲PCR1 中的引物甲与图乙中的引物 的绝大部分序列相
同。
(2)PCR1 和PCR2 需要分开单独进行，原因是 。PCR3 不需要引物，高温加热后fatl—2A 和2A—fat2 的
双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是 （填序号）形成的杂交链。
(3)为了确定fatl 基因连接到质粒中且插入2A 序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图
乙中的引物_ 。融合基因经下图中的过程表达产生fatl 和fat2 两种蛋白，经检测发现通过该技术表达的fat1
蛋白的分子量较正常fat1 蛋白的分子量大，依据该融合基因的结构和表达原理推测，原因是 。
6．（2024·浙江温州·二模）为分别建立具有红色荧光与绿色荧光的转基因模型小鼠，科学家进行了如下操
作将红色荧光基因R 插入表达载体A，构建重组表达载体A'，如图所示。其中含R 基因的DNA 片段内部
没有限制酶的酶切位点，R 基因以α 链为模板链。将绿色荧光基因G 插入表达载体B，构建重组表达载体
B'。
回答下列问题：
(1)表达载体上的启动子是 酶的结合位点，能决定基因转录方向，并确定其中的一条链为模板，
若图中表达载体A 和R 基因通过酶切和拼接后能使R 基因成功表达，则其启动子是 。
(2)图中标注相关DNA 片段的长度（kb：千碱基对）。据图分析， （填“可以”或“不可
以”）通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'，理由是 。
(3)在绿色荧光基因G 内部插入了一个DNA 片段P，会引起G 基因产生 ，但获得的上述转基因
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模型鼠依然能表现出绿色荧光的原因有 （回答2 点即可）。为确定导入的基因是否有片段P
的插入，可通过 或 方法进行分析。
(4)将一只红色荧光转基因（导入1 个R 基因）雌性小鼠与一只绿色荧光转基因（导入1 个G 基因）雄性小
鼠杂交获得F1，取F1中同时表现红绿荧光的雌、雄小鼠杂交得F2，统计其表型及比例为同时表现红绿荧光
雌性：红色荧光雌性：同时表现红绿荧光雄性：红色荧光雄性：绿色荧光雄性：无荧光雄性=6：2：3：
1：3：1，则推测导入的R、G 基因分别位于 染色体上。F2雌鼠中纯合子占比为 。
请写出F1中绿色荧光雌性与红色荧光雄性杂交遗传图解（染色体上不含R、G 基因的对应用r、g 表示）
。
7．（2024·黑龙江齐齐哈尔·二模）利用基因工程方法构建HPV-L1 重组微环DNA，即重组质粒（PP）。图
1 所示为HPV-L1 重组片段的PCR 及重组质粒（PP）的构建过程，HPV-L1 重组微环DNA 包含HPV（人乳
头瘤病毒）的L1 基因片段、编码信号肽的序列以及标签区，将其作为核酸抗原直接免疫产蛋鸡可获得卵
黄抗体，该卵黄抗体可用于HPV 的预防和治疗。利用重叠延伸PCR 技术进行定点突变可以实现对HPV-L1
基因进行合理性改造，引物b 和引物c 为互补重叠序列，其过程如图2 所示。回答下列问题：
(1)组成质粒ZY781 载体的单体是 ，作为载体除了需要具备复制原点以及一至多个限制酶识别
和切割位点，还需具有 等结构。
(2)HPV-L1 重组片段的PCR 过程中，需要在引物A 和引物B 的5'端分别连接 ，若标签区序列
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为
，引物B 的序列为，3'CAGCTGGTAGTAGTGGTAGTGGTA5'，
则引物B 的设计 （填“正确”或“不正确”），理由是 。
(3)图2 的PCR1 过程中，产物AB 是依赖引物对 扩增的结果，②过程首先使用热稳定性DNA
聚合酶进行延伸，再使用引物对 进行PCR 扩增。
(4)L1 基因片段编码HPV 的主要抗原蛋白，将编码信号肽的序列与L1 基因片段连接一起构建重组微环
DNA 的目的是 。
(5)利用质粒ZY781 构建重组质粒（PP）时，选用限制酶BglⅡ和SalI 切割质粒后，需借助电泳等技术回收
大片段。琼脂糖凝胶电泳结果中，若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是
（答出一点即可）。
8．（23-24 高三上·北京丰台·期末）系统性红斑狼疮（SLE）发病机理复杂。研究发现，SLE 和外周血单个
核细胞（PBMC）的自噬有关。
(1)PBMC 细胞自噬异常时释放的染色体、核糖体等可以作为自身 ，刺激机体产生抗体，从而引起
病。
(2)科研人员对健康人和SLE 患者PBMC 细胞中的一种小RNA 分子含量进行检测，检测结果如下：
实验结果表明： 。
研究发现该小RNA 分子能与某mRNA 的3’末端结合，阻止该mRNA 分子的翻译。为确定该mRNA 分子是
哪个基因转录的，科学家进行了以下的操作：
①找出SLE 患者表达量增加的预测基因
②找出SLE 患者表达量减小的预测基因
③构建预测靶基因的表达载体N
④构建该小RNA 分子的表达载体N
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请完善确定该小RNA 分子的靶基因的技术路线：通过Targetscan 数据库找出预测的靶基因→比较健康人和
SLE 患者的PBMC 细胞中预测靶基因的表达量→ →构建融合基因：克隆出预测靶基因的3’末端区
段，将其连接在荧光素酶基因的编码区末端→将融合基因构建表达载体M→ →将表达载体M 和N
一起导入细胞，培养一段时间后提取重组细胞的蛋白质，加入荧光素溶液中→检测溶液的荧光强度。（注：
荧光素酶能催化荧光素的氧化作用并发出荧光）与对照组相比，若实验组的 ，表明该预测基因是该小
RNA 分子作用的靶基因。
(3)通过上述方法最终确定该靶基因是基因T，该基因的表达产物能够调控细胞自噬信号通路相关蛋白的表
达，导致细胞的自噬功能异常。请说明该项研究的意义 。
9．（2024·广东·一模）DNA 双链断裂（DSB）是真核生物中一种严重的DNA 损伤形式，哺乳动物体内存
在相关机制修复DSB。在修复过程中可能会发生改变遗传信息的情况，例如丢失DNA 上的甲基化信息
（表观遗传信息改变）或发生基因突变，从而对基因的表达产生影响。已知DSB 可以导致生物个体衰老，
但相关的分子机制尚未明确。回答下列问题：
(1)用I-PpoI 酶处理DNA 可导致DSB，作用机理见图1。I-PpoI 酶由I-PpoI 基因编码，能够识别主要存在于
非编码区（DNA 中不能编码蛋白质的区段）的序列5′-CTCTCTTAAGGTAGC-3′，使第9 位A 与第10 位G
之间的 键断开，据此可知该酶属于 酶。科学家选用该酶诱发DSB，可以尽量减少 带来的影响。
(2)为了探究DSB 是通过表观遗传信息改变还是基因突变导致衰老，科学家以小鼠作为研究材料进行相关
实验。该实验的流程大致如图2：
①在实验前，利用基因工程技术将I-PpoI 基因导入到小鼠细胞中，诱导表达后需通过 法检测细胞内是
否产生I-PpoI 酶。若产生I-PpoI 酶，则会导致实验组小鼠发生 信息的变化。表观年龄是根据整个基因组
有多少碱基失去了原有的甲基作为测量依据。实验前，对照组和实验组小鼠的表观年龄应 。
②若实验结果为：与对照组相比，实验组小鼠 ；且当实验组出现明显的衰老表型时，对照组依然保持
年轻的状态，则证明DSB 引起的表观遗传变化导致衰老。
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③若出现上述实验结果，科学家还需要对实验组小鼠进行基因治疗，使其恢复年轻时的表观遗传信息。若
，则能确立表观遗传变化与衰老之间的因果关系。
10．（23-24 高三上·全国·阶段练习）荞麦中的胰蛋白酶抑制剂（BMI）可用于防治害虫，对肿瘤细胞的增
殖也有明显的抑制作用。下面是研究人员从荞麦中克隆胰蛋白酶抑制剂基因以及基因产物功能验证的部分
实验流程，按要求回答下列问题。
(1)根据文献中胰蛋白酶抑制剂基因的序列，利用PCR 法扩增获得了蛋白酶抑制剂基因（BMI 基因）。PCR
体外扩增目的基因与体内DNA 复制过程的主要区别有 （答出两点）。
(2)为使BMI 基因与所用的图示载体正确连接（该基因序列不含图示载体中限制酶的识别序列），在扩增
的BMI 基因的引物两端可分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的
BMI 基因和载体进行连接时，可选用 （填“E.coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
注：箭头表示切割位点
.相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
EcoRⅤ
GAT↓ATC
BamHⅠ
G↓GATCC
PstⅠ
CTGC↓AG
KpnⅠ
G↓GTACC
(3)为验证BMI 基因表达产物对细胞增殖的抑制作用，将小鼠肝癌细胞H22（悬浮细胞）及正常人肝细胞
7702（贴壁细胞）分别加入一系列浓度的BMI 基因表达产物，在相同条件下进行原代和传代培养，一段时
间后检查对两种细胞的抑制情况如下图。（图中的“7702cell”是肝细胞培养24 小时后的结果）。
①如需要对正常人肝细胞7702（贴壁细胞）进行传代培养，所用的处理方法是 。
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②据图分析该实验的结论是 （答出两点）。
11．（21-22 高三上·北京朝阳·期末）亚洲棉的光籽（无短绒）和毛籽（有短绒）是一对相对性状，为探究
棉绒的遗传规律并揭示其发育的分子机制，研究者进行了系列实验。
(1)利用表型为光籽的不同突变体与野生型毛籽棉进行杂交，统计F1自交结果如下表：
组
别
亲本
F2表型及比例
①
突变体甲×毛籽棉
光籽∶毛籽＝3∶1
②
突变体乙×毛籽棉
光籽∶毛籽＝13∶3
③
突变体丙×毛籽棉
光籽∶毛籽＝9∶7
据表可知，突变体甲光籽性状的遗传遵循 定律；②组F2光籽棉中的纯合子所占比例为
；推测③组F1测交后代表型及比例为 。综合三组杂交实验结果，表明 之间并非简单
的一一对应关系。
(2)研究发现，8 号染色体的～880kb 至～903kb 区间与突变体甲的光籽表型相关。根据野生型毛籽棉的该区
间设计连续的重叠引物，提取突变体甲和野生型的 进行PCR，产物扩增结果如下图。
据图可知分子量较大的扩增产物与点样处的距离较 （选择“大”或“小”填写），推测8 号染
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色体上第 对引物对应的区间（简称M） 是突变体甲光籽出现的根本原因。
(3)研究者对杂交组合①的F2进行扩增，证实甲的光籽表型与区间M 密切相关。得出此结论的扩增结果应
该是 。
(4)研究者从野生型和突变体甲中克隆出区间M 后，运用基因工程技术分别导入棉花原生质体，检测基因
表达水平，结果如下图。
内参基因REN 是为了排除转化效率不同对实验结果的干扰，因此图中LUC/REN 用来衡量 的表
达水平。实验结果说明突变体甲的区间M 促进下游基因的表达，且其作用的发挥与区间M 的 有关。
(5)基因GaFZ 的表达会影响棉花短绒的发育，检测发现突变体甲GaFZ 蛋白结构与野生型一致。综合上述
研究推测突变体甲光籽表型出现的原因是 。
12．（2024·广东深圳·二模）利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口
服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），
诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD 和
3RBD，探究RBD 的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD 的天然构象并获得高效免疫原性。
重组质粒构建流程如图1 所示，Nco I 和Sac I 是pNZ8149 质粒上的限制酶识别位点，U-M 为信号肽-细胞
壁锚定蛋白序列。回答下列问题：
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(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加 ，并在
（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR 技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的
5'端应分别添加 序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1 为双酶切pNZ8149-
2RBD，泳道2 为双酶切pNZ8149-3RBD。泳道1 两个条带大小分别为2507bp 和2020bp，由此可知，融合
基因3RBD 的长度为 bp，泳道2 呈现一个条带的原因是 。
(4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，
pNZ8149-2RBD 菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD 菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明 。
13．（2024·北京顺义·一模）人在衰老过程中某些性状会发生改变，为寻找衰老的原因，科研人员对染色
质开展了相关研究。
(1)由图1 可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域 ，某些DNA 。
(2)DNA 甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散会 （促进/抑
制）基因表达。
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(3)科研人员推测：核内DNA 断裂后的修复会导致表观遗传信息紊乱或丢失，加速细胞衰老。为验证该推
测，科研人员基于图2 原理，利用以下实验材料构建ICE 模型鼠。
①Cre 酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于DNA 上的Lx 序列，导致两个Lx 间的DNA
片段丢失；
②I-E 核酸酶基因：编码的I-E 核酸酶位于细胞核，与诱导剂T、Cre 酶形成复合物，切割DNA；
③口服诱导剂T：小分子化合物，可诱导Cre 酶进细胞核。
请完善技术路线 ：
(4)染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE 小鼠的检测，发现已修复的DNA 未发生碱基序
列的改变。通过检测 ，可知获得的ICE 鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结构，可知细胞衰老。
14．（2024·贵州·模拟预测）某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图所示，
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①～④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ酶切位点唯一。其中BamHⅠ与EcoRⅠ之间的距离为
20kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ识别序列和切割位点如图。请回答：
BamHⅠ：—G↓GATCC— BglⅡ：—A↓GATCT— EcoRⅠ：—G↓AATTC—
(1)常用特异性地扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→ ”三步。
(2)启动子的功能是 。
(3)步骤①应选择限制酶 切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加 ，以便筛选出含
目的基因的甘蓝植株，原因是 。
(4)经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因存在
正向与反向两种连接方式。用 酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产物大
小，若出现 条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。
15．（2024·重庆·模拟预测）如图为将高蛋白优良基因THP9 导入植物细胞获得新品种的过程，请回答下
列问题：
EcoRI
BamHI
KpnI
MfeI
HindIII
(1)为大量获得THP9 基因，科研人员利用了RT-PCR 技术（用mRNA 首先获得cDNA，再进行聚合酶链式
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反应的技术）。RT-PCR 反应在含有Mg2+的缓冲液中进行，其中Mg2+的作用是 ，每次循环一般可以
分为 三步。若加入的mRNA 为a 个，要得到含目的基因的cDNA 片段，至少需要 个引物。
(2)已知图中THP9 基因转录方向为从左往右，应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图
中含 THP9 基因的DNA 片段，以获得能正确表达THP9 基因的重组质粒。
(3)若将上述含有THP9 基因的重组质粒导入动物细胞，常用的受体细胞是 ，进而培育转基因克隆动
物，若在个体水平检测转基因技术是否成功，其检测方法是 。
16．（2024·湖南永州·三模）大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构
建一种基因表达可控的工程菌，用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。科研人员利用温度敏感型转录调控
蛋白构建温控表达的质粒系统，部分结构如下图。在人体特定部位进行42℃处理后，p7 可在重组酶Bxb1
作用下翻转，免疫元件中的GFP 和aPD-L1 两种基因可以成功表达。据此回答下列问题：
(1)推测p7 应为 （填“启动子”或“终止子”），其功能是 。
(2)Tel42 为来自λ 噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子pLac 可以使Tel42
持续性表达，当温度 （填“低于”、“等于”或“大于”）42℃时，Tcl42 蛋白会抑制启动子pRL。
(3)质粒系统就像“基因电路”，其中的Tcl42 基因就像“开关”，能在加热时瞬时激活特定基因。其核心
基因包括重组酶Bxb1 基因、分泌型aPD-L1 蛋白基因（该蛋白可用于免疫治疗）等。请选择相关选项完善
该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA 连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件
及质粒，构建“基因电路”→ →重组酶Bxb1 基因不表达→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→
→解除Tcl42 蛋白对启动子pRL 的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量aPD-L1。将下列选项代
号填入上述横线，将“基因电路”补充完整。
A．受体菌37℃时
B．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42 失去活性
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C．荧光蛋白GFP 基因、aPD-L1 基因的转录
D．重组酶Bxb1 基因表达，进而引起p7 两侧发生重组
(4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是 。导入后的菌体用 方
法接种于含四环素的培养基上，由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌。
(5)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的
温度控制。为验证上述温控工程菌可被FUS 处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。请以成瘤建模后的小鼠
为材料，设计一个实验方案 。
17．（2024·北京东城·一模）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。
(1)研究发现，东方果蝇中dsx 基因 出的前体RNA 在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用
这一特性研发雌性特异性致死基因系统。
(2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1 所示的融合基因1，进而得到
转基因果蝇。
①根据图1，扩增dsx 内含子应选择的引物是 （选填字母）。
② 由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx 基因前体RNA 保留或剪切内含子和剪切识别序列
情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA 为
（填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。
(3)研究发现，RTA 蛋白第212 位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃
时，可抑制RTA 蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
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① 欲得到具有cs 效应的RTAcs 蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2 所
示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的5’端和3’端 。
② 对转入融合基因2 的果蝇进行以下操作：
ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）。
ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比
例，若 ，则说明G1具有cs 效应。
ⅳ：在 ℃继续培养具有cs 效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。
18．（2024·山东·二模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生
长和发育，决定作物的产量和品质。SUT 基因家族中的StSUT2 基因主要在花和老叶中表达，科学家借助
Gateway 克隆技术通过构建StSUT2 植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway 克隆技术包括
TOPO 反应和LR 反应（如图一、图二所示）。
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(1)获得大量StSUT2 基因：首先从植物的 细胞中提取总mRNA，经过 过程获得cDNA，根据StSUT2
基因两端的序列设计引物进行PCR 扩增，获得大量的StSUT2 基因。
(2)构建入门载体：利用图一中的TOPO 反应将目的基因PCR 产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被
拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，
并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保
StSUT2 基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2 基因时，可在引物中引入5'— —3'序列。
(3)构建StSUT2 基因超表达载体：LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和超表达载体上的attR 位点，将入
门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，得到所需载体。请结合图二中的LR 反应
过程，在下图三的方框中画出含StSUT2 基因的超表达载体 。
(4)StSUT2 基因超表达及检测：通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2 基因超表
达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定StSUT2 基因是否成功超量表达。
19．（2024·江苏盐城·模拟预测）Ⅰ、同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对基因进行敲除与回补，
研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ 基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr
是四环素抗性基因，sacB 基因是蔗糖致死基因，LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解成蓝色化合
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物。请回答下列问题：
限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
HindⅢ
XmaⅠ
识破序列和切割位
点
5'G↓AATTC3'
5'G↓GATCC3'
5'A↓AGCTT3'
5'C↓CCGGG3'
Ⅱ、咪唑喹啉衍生物（BEZ）和长春花碱（VLB）用于治疗卵巢癌、肝癌等癌症，为研究二者对肾癌的治
疗效果，研究人员进行了系列实验。
(1)过程①PCR 中影响退火温度的因素有引物的长度、 ，若温度过低会导致 。
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(2)过程⑤中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加上 基因两端的同源序列。
(3)过程⑦中，在含有 的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ 基因菌株。过程⑧通过
同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对LacZ 基因进行回补，筛选LacZ 基因回补菌株时应在培养基
中添加 。
(4)探究BEZ 和VLB 单独及联合使用对肾癌细胞凋亡的影响，结果如图1 所示。该实验的自变量是 ，
实验结果表明 对癌细胞凋亡无明显影响。
(5)Caspase—3 是细胞内促凋亡蛋白，Mcl—1 是Caspase—3 基因表达的调控因子。为研究BEZ 和VLB 治疗
肾癌的机制，研究人员对各组细胞进行实验处理24 小时后，检测Mcl—1 的mRNA 和蛋白质含量，结果如
图2.选用GAPDH 作为内参的原因是 。
(6)综合图1、图2 结果，在下列箭头上标明“+”或“-”（分别表示“促进”和“抑制”），图示药物发挥
作用的机理 、 。
20．（2024·山东·二模）某研究所为研究水稻叶肉细胞中miR5810（一种小分子RNA）和MRLP6 蛋白之
间的关系，分别探究了两者对水稻光合色素含量和净光合速率的影响，结果如图一所示。同时，研究人员
利用双荧光素酶技术探究了转录因子NFYB7 与miR5810 基因表达的关系。该项研究揭示了一种调节光合
作用的分子机制，为水稻高光合育种提供了新思路。
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(1)水稻中的光合色素分布在 ，可用 提取。矿质元素是指除C、H、O 以外，植物根系从土壤中吸收
的元素，合成叶绿素分子所需要的矿质元素是 。
(2)miR5810 会 （填“促进”或“抑制”）MRLP6 蛋白合成， （填“升高”或“降低”）光合色素
的含量，进而调节光合作用速率。
(3)双荧光素酶技术可通过测定荧光强度的比值（LUC/REN），实现对目标基因表达水平的定量分析。LUC
和REN 是两种催化不同底物的荧光素酶，通过分别添加不同的荧光素测其荧光强度，计算荧光强度之比。
相比较NFYB7 基因表达载体（如图二）与双荧光素酶基因表达载体（如图三）共转化细胞，只转化双荧
光素酶基因表达载体的细胞中，荧光强度LUC/REN 比值降低，原因是 。
(4)综上所述，NFYB7—miR5810—MRLP6 调节水稻光合作用速率的可能分子机制是 。
21．（2024·河南·二模）糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能
直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115（对氨苄青
霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1 所示。三种限
制酶的识别序列及切割位点见表，请回答下列问题。
限制酶
BamHI
PstI
XbaI
识别序列和切割位点（5’→3’）
G↓GATCC
C↓TGCAG
T↓CTAGA
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(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到 含量高的培养基上，恒温
培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈（不产生蓝色）直径 （填“较大”或“较小”）的菌株。
再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶切割质粒pPIC9K，图2 是高产糖化酶基因示意图（仅示部
分碱基），为使其能定向插入表达载体并成功表达，应在引物的 （5'或3'）端添加
酶识别序列，则PCR 扩增时引物的碱基序列应为下列①-⑥中的 。若扩增4 次，不同时含两种引
物的DNA 分子有 个。
(3)将筛选出的菌株接种至发酵罐内进行扩增，在接种环节要对培养基和发酵设备进行严格灭菌以防止杂菌
污染的原因是 （答出一点即可）。培养过程中可定期取样并常用 （仪器名称）对菌体进
行直接计数，以评估增殖情况。如发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后采用 （答出1 项即
可）等方法获得所需的发酵产品。
22．（2024·江西景德镇·模拟预测）热原是由微生物产生的、能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
注射类药物或医疗器材的热原含量检测是评价药物安全的重要指标。
(1)热原能刺激免疫细胞分泌与发热相关的细胞因子（如IL-6）。ELISA 利用IL-6 抗体和IL-6 特异性结合，
可以实现对IL-6 的定量检测（图1）。下列说法正确的有____________（多选）。
A．固相抗体和酶标抗体竞争性结合IL-6 的相同活性位点
B．酶标抗体具有免疫学活性和酶活性，具有多个活性位点
C．实验需设置仅有酶标抗体或仅有上清液的两组对照实验
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D．需给予足够长的时间使无色底物充分反应后检测光信号
E．反应体系中光信号越强则细胞上清液中IL-6 含量越高
(2)现有检测方法中，免疫细胞存在来源少、稳定性差、灵敏度低等问题。因此，科研人员通过基因工程，
将免疫细胞中参与热原反应信号通路的关键基因（TLR4、MD2、CD14）转入HEK293T 细胞系，构建热原
敏感的细胞系解决该问题。原理如图2，回答下列问题。
①从免疫细胞中提取总RNA，经逆转录和PCR 获得TLR4基因，构建真核表达载体，完成上述过程需要用
到的酶有 。
②将基因表达载体通过显微注射技术导入HEK293T 细胞，目的基因有机会整合到HEK293T 的染色体，这
种变异类型属于 。
③提取表达绿色荧光蛋白的细胞DNA，利用引物组合 扩增（图3），如果出现目的基因片段，
初步证明TLR4已整合到染色体上。
④利用同样的方式将MD2-CD14-红色荧光蛋白基因导入HEK293T 的染色体。
(3)经检测，细胞传代培养后导入的基因能够稳定遗传，欲证明热原敏感细胞系可替代免疫细胞实现热原检
测，还需设计哪些实验? 。
23．（2024·湖北·三模）“杂交水稻之父”袁隆平利用雄性不育野生稻改写了世界水稻育种史，杂交水稻
研究团队不断刷新我国水稻产量和品质，举世瞩目。请分析回答：
(1)水稻（2n=24）是禾本科植物，在我国有野生种、引进种：杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，
这主要体现了生物多样性的 价值。在育种研究中，对水稻进行基因组测序要测
条染色体中DNA 的碱基序列。
(2)安农S-1 是我国发现的第一个籼稻（水稻的一个品种）光温敏雄性不育系。该光温敏雄性不育系与9 种
常规雄性可育系进行正反交，得到的F1均为雄性可育。据此可推出有关该雄性不育基因的两个结论是：
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。
(3)另有一个水稻品系，其雄性的育性由一对等位基因M、m 控制，基因型为mm 的个体表现为雄性不育，
能产生正常的雌配子，M 基因可使雄性不育个体恢复育性产生可育雄配子。通过转基因技术将M 基因与雄
配子致死基因A、蓝色素生成基因D 一起导入基因型为mm 的个体中，并使其插入一条不含m 基因的染色
体上（D 基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D 基因的种子呈现白色）。如图：
①图中基因型为mmADM 的个体自交时（不考虑突变和互换），子代种子的表型及比例为 ，
这种转基因改良品系的显著优点是 。
②要成功得到转基因个体（mmADM），先要构建基因表达载体。研究人员准备在已插入M 基因的运载体
（如下图）中再插入A、D 融合基因。他们分析发现A、D 融合基因拼接处存在XbaI 的识别序列，为使基
因表达载体中A、D 融合基因和M 基因都正确表达，应
在A、D 融合基因两端添加 两种限制酶的识别序列，并用 两种限制酶对运载
体进行酶切。
24．（2024·重庆九龙坡·二模）葡萄酒中的氨基甲酸乙酯（EthylCarbamate，EC）是一种潜在致癌物，主要
由尿素和乙醇反应生成。通过在亲本酿酒酵母菌株中，敲除一个拷贝的精氨酸酶基因CAR1，同时选用强
启动子PGK1 过表达脲基酰胺酶基因DUR1、2，来获得低产EC 的重组酿酒酵母菌株。与亲本菌株相比，
重组酿酒酵母菌株发酵性能及风味物质不受影响，尿素和EC 的含量分别降低了40.38%和34.45%。满足葡
萄酒相关领域对酵母的较高要求，有广泛的应用前景。
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(1)下图为目的基因脲基酰胺酶基因DUR1、2 的部分序列：
模板链3'-TACTGTCAATCA……ATGACGGCCACT-5'
编码链5'-ATGACAGTTAGT……TACTGCCGGTGA-3'
利用PCR 扩增目的基因应选择的一对引物是____
A．5'-TACTGCCGGTGA-3'
B．5'-ATGACAGTTAGT-3'
C．5'-TCACCGGCAGTA-3'
D．5'-ACTAACTGTCAT-3'
(2)如图所示，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择 （填写酶的具体名称）识别并切割质粒，再
用DNA 连接酶连接。氨苄青霉素抗性基因的作用是 。
(3)已知目的基因上无相关酶切位点，应在引物的 （填5'或3'）端设计酶切序列，目的基因上游设计的
酶切序列+引物序列为5'- -3'。
(4)已知DUR1、2 基因的转录模板链为A 链，如果采用一定方法将目的基因与质粒进行反向连接，构建出
反义DUR1、2 基因，则其转录模板链为 链。将其导入之前的转基因工程菌中，其结果无法获得低EC
产品，推测其原因可能是 。
25．（2024·海南儋州·一模）In—Fusion 是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与
线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序列），经In—Fusion 酶（能从线性DNA 分子链的末端按
3'→5'的方向顺次水解若干个磷酸二酯键）处理后可实现无缝连接，基本过程如图所示，其中Amp'表示氨
苄青霉素抗性基因。回答下列问题：
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(1)过程①中引物1、2 设计的依据是 ，除引物外，反应体系中还需添加的物质有 。
(2)过程①和②通常不能在同一反应体系中进行，主要原因是两对引物之间会发生 。过程②所获得的
线性化质粒含有 个游离磷酸基团。
(3)过程③中，DNA 片段先经In—Fusion 酶处理形成 ，降温后通过碱基互补配对而形成“结合体”。
过程④需用 处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。导入后的重组质粒利用大肠杆菌细胞中的
酶，实现完全环化。
(4)转化后，利用含 的选择培养基初筛获得目标大肠杆菌，提取细胞内的DNA，经 （方法）进
一步鉴定与验证重组质粒。
(5)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 技术的优势主要有 。
26．（2024·山西晋中·模拟预测）镰刀菌会造成小麦赤霉病，受感染的麦穗出现红色霉层，不仅造成减产，
还会产生霉素，造成食品安全方面的问题。我国科学家从小麦近缘属植物长穗偃麦草中首次克隆出主效抗
赤霉病基因Fhb7（编码一种谷胱甘肽S 一转移酶），为解决小麦赤霉病的世界性难题提供了“金钥匙”。
研究发现，用光诱导型启动子（PrbcS）能够使Fhb7 基因表达，其结合T 基因后能使Fhb7 基因更高水平表
达。
(1)Fhb7 基因可在不同种的禾谷类作物细胞中转录并翻译出相同的谷胱甘肽转移酶，这说明 （答出
2 点即可）。
(2)PrbcS 是一段有特殊结构的DNA 片段，能被 识别并结合，驱动基因的持续 过程。
(3)通过PCR 技术可从长穗偃草中获得Fhb7 基因并大量扩增，首先要根据已知的核酸序列，设计具有特异
性的 ，使 酶能够从其 端开始连接脱氧核苷酸。
(4)如图，甲、乙均为Fhb7 基因表达载体构建过程中的中间载体。区别含有中间载体甲与含有重组载体丙
的微生物的方法是 。经酶切后凝胶电泳，测得含2B 基因片段长度为0.3kb，经图示信息分析，含光
诱导型启动子一T 基因的片段长度约为 。据图分析，形成重组载体丙，需要使用 限制酶切
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割中间载体甲和乙，图中重组载体丙问号处有 种限制酶的酶切位点。
27．（2024·全国·模拟预测）科学家从紫苏中提取DGATI 基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四
尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产的四尾栅藻的部分流程如图。
质粒pCAMBIA 与PCR 扩增出的DGAT1 含有的酶切位点如图所示。现有BamHI、BgIII 、EcoRI 三种限制
酶，它们识别并切割的碱基序列如表。
BamHI
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BgIII
EcoRI
(1)过程②所需的技术是 ，②的产物的鉴定方法是 。
(2)将表达载体导入大肠杆菌时需要在培养液中加入
，目的是使大肠杆菌处于 的生理状态，将
目的基因导入大肠杆菌的目的是 。
(3)将DGAT1 与pCAMBIA 分别用限制酶切割后进行连接可形成重组质粒，重组质粒将不会被BamHI 或
BgIII 切割，原因是 。
(4)若只考虑DNA 片段的两两连接，构建重组质粒时可得到3 种大小不同的连接产物，长度分别为 。
(5)配制大肠杆菌的培养基由于加入了 ，因此从作用上来看属于 长出的菌落不一定都是含有
重组质粒的大肠杆菌，也可能是含有 的大肠杆菌，因此需要进一步筛选。
28．（2024·山西吕梁·二模）中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）是可以无限增殖的细胞。科研人员利用CHO
细胞系生产乙肝疫苗的过程是：①将得到的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因与信号肽基因连接形成融合
基因，信号肽可以引导HBsAg 进入内质网内进行合成和加工，进而以分泌蛋白的形式分泌到胞外，融合基
因的结构如图1 所示；②将融合基因插入图2 所示的质粒，将重组质粒与带有小鼠二氢叶酸还原酶
（dhfr）基因的质粒共转染缺乏二氢叶酸还原酶的CHO 细胞；③从CHO 细胞系的培养液中分离提取
HBsAg，用以生产乙肝疫苗。图1 中的F1~F4分别为扩增信号肽基因和HBsAg 基因时所需的引物。请回答
下列问题：
(1)需要通过 技术扩增融合基因，该技术的原理是 。
(2)为了将信号肽基因和HBsAg 基因连接在一起，在分别扩增两种基因时，应在引物F2和引物F3的5′端引
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入 。通过PCR 检测融合基因是否形成，可选用图1 中引物 对连接产物进行扩增。
(3)为了将融合基因正确地插入图2 所示的质粒，应选择限制酶 切割质粒。与单独将HBsAg 基因转
入CHO 细胞相比，导入融合基因的好处是 。
(4)缺乏dhfr 的CHO 细胞在培养基上不能正常生长，因此在筛选表达HBsAg 的细胞株时，dhfr 基因起
的作用。
(5)在生物反应器中大规模连续培养目标细胞株时，通过 的措施，为培养的细胞株营造无毒的环境。
同时要通入 和5%CO2的混合气体，其中CO2的主要作用是 。
29．（2024·山东泰安·二模）研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用
于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT 是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性
降解区域ODD（多肽）的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人
员以RTA 作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT 的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用
ODD 的作用减轻RTA 对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融
合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。
(1)可采用PCR 的方法获取融合基因TAT-RTA，需要根据TAT 和RTA 基因设计引物，引物的作用是
。已知RTA 基因和欲得到的TAT-RTA 融合基因的结构如图1 所示，TAT 基因编码链序列
5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1 的5′端
加入 酶切位点，引物2 的5′端加入 酶切位点，利用TAT 和RTA 核酸序列设计引
物时，要求在RTA 蛋白的前端引入TAT 短肽，请根据要求写出引物1 （写出引物5′端的12 个
碱基即可）。
(2)载体的部分结构如图2 所示，His 标签由连续的6 个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，
将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但是在研究时，发现融合
蛋白中没有His 标签蛋白，据图分析原因是 。可通过引物2 的特殊设计使His 标签正常表达，
请结合图1 和图2 写出引物2 （引物中如需添加碱基补足对应的密码子，可以添加任意碱
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基）。
30．（2024·江苏·模拟预测）人体内的t-PA 蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心
梗患者注射大剂量的基因工程t-PA 会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA 第84 位的半胱氨酸换成丝氨酸，
能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA 基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达
该突变基因，可制造出性能优异的t-PA 突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR 技术获取t-PA 改良基因和利
用质粒pCLY11 构建含t-PA 改良基因的重组质粒示意图（图中重叠延伸PCR 过程中引物a、b 用来扩增突
变位点的上游DNA 序列，引物c、d 用来扩增突变位点的下游DNA 序列）。请回答下列问题。
(1)科学家将t-PA 第84 位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA 突变蛋白的生物技术手段属于
范畴。
(2)获得性能优良的t-PA 突变蛋白的正确顺序是 （选择正确编号并排序）。
①t-PA 蛋白功能分析和结构设计②借助定点突变改造t-PA 基因序列③检验t-PA 蛋白的结构和功能④设计t-
PA 蛋白氨基酸序列和基因序列⑤利用工程菌发酵合成t-PA 蛋白
(3)已知t-PA 蛋白第84 位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA 基因的上链）上的碱基序列是ACA，
丝氨酸的密码子是UCU。重叠延申PCR 示意图中的黑点便是突变部位的碱基，引物b 中该突变位点的碱
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基是 ，引物c 中该突变位点的碱基是 。
(4)据图可知，重叠延伸时，需要的引物是 ，引物的作用是 。若扩增图中序列时引物选择正确，
PCR 操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现
此情况的原因 。
(5)若获得的t-PA 突变基因如图所示，那么质粒pCLY11 需用限制酶 切开，才能与t-PA 突变基因高效
连接。
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