文档文本内容
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
专题05 基因工程
近几年高考题通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，
PCR 技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大：其中启
动子的插入位点和插入方向等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解
决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。预测2024 年难度系数
也会非常大，不排除出现细胞工程的可能。
1、（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果
酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1
为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
1
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂
质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
2、（2022·河北·高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制
剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列
问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上，此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有 （写出两点
即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。下图为三种
不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析 （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋
StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是 。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫
朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白
2
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
酶抑制剂的能力，其分子机制可能是 （写出两点即可）。
3、（2021·河北·高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修
复技术将土壤中的Cd 富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降
低土壤中Cd 的含量。为提高植物对Cd 污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd 转运蛋白（YCF1）基
因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，
这个群体称为 。
（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体
中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1 基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
。研究者进一步获得了转YCF1 基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是
。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd 污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同
器官中Cd 含量（图2）。据图1 可知，与野生型比，转基因植株对Cd 具有更强的 （填“耐
性”或“富集能力”）；据图2 可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd 污染最
为方便有效。
（5）已知YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高
Cd 环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd 污染土壤修复植物
的优势在于 （写出两点即可）。
3
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．TAT 基因可以表达出一种转录激活因子，并能有效引导蛋白质穿透细胞膜。绿色荧光蛋白基因
（EGFP）是一种报告基因。研究人员通过构建TAT 基因与EGFP 的融合表达载体，在大肠杆菌内表达得到
纯化的TAT—EGFP 融合蛋白。将人工合成编码TAT 蛋白的DNA 片段插入载体pET28a 得到pET28a—TAT
重组质粒，再利用引物对EGFP 进行PCR，并利用限制酶EcoRI 和XhoⅠ连接得到pET28a—TAT—EGFP 重
组质粒，操作流程如图所示。回答下列问题：
(1)图中TAT 基因结构中，每个磷酸基团直接连着 个脱氧核糖。构建pET28a—TAT 重组质粒使用
两种限制酶切割目的基因和PET28a 质粒的优点是 、 。
(2)PCR 扩增EGFP 基因的过程中，引物Ⅰ与引物Ⅱ的序列不能太短，且两者间不能 ，两种引
物的5'端必须分别添加 序列，以保证正确连接形成pET28a—TAT—EGFP 重组质粒。
(3)将上述重组质粒转化到大肠杆菌E·coliBL21 时，需先用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，目的是
。筛选转化成功的E·coliBL21 时，需要在LB 平板上添加 ，并运用平板划线法进行分离。
(4)将稳定的高表达菌株扩大培养后，再研究测定其融合蛋白表达的情况。利用超声波法裂解大肠杆菌，将
提取的全菌蛋白在100g/L 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，发现加入IPTG 组与未加入IPTG 组相比较，
4
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
泳带有明显的差异，如图所示：
注：1：未加入IPTG；2：37℃时0.2mmol/LIPTG 诱导1h；3～5：37℃时0.5mmol/LIPTG 分别诱导1h、
2h、3h
①电泳是指 。
②根据泳带结果可得出的结论是：IPTG 能够 ，在 的实验条件下作用
效果最佳。
(5)研究人员将TAT 和EGFP 融合在一起研究，目的除了用于筛选成功导入TAT 基因的受体细胞外，还可用
于 （举一例）等。
2．将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖
转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG 基因敲
除质粒构建过程如图1 所示，其中KanR 是抗生素抗性基因，SacB 是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖
积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI 的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回
答下列问题：
5
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(1)图1 中利用PCR 获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增 轮。从引物角度分析，扩增得到
上、下同源臂能拼接到一起的关键是 。ptsG 基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI 和EcoRI 双酶
切的优点是 。
(2)将敲除ptsG 基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、
含10%蔗糖培养基， （填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上
生长的为目的菌。
(3)将筛选得到的敲除ptsG 基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG 基因（如
图2）。
①两次同源重组共有 个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定
的引物进行PCR，通常将扩增产物利用 方法鉴定。
②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG 基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别
培养在以葡萄糖为唯一碳源的 培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌 。
3．热激蛋白是一种普遍具有抗逆作用的保护蛋白，在植物处于逆境下发挥其重要的调控作用。HSP70 是
植物中含量最多的热激蛋白，研究已经证明南瓜细胞中HSP70 基因的表达与植物获得的耐热性呈显著正相
关性。花楸树为蔷薇科落叶小乔木，具有很高的园林观赏价值，但花楸树引种到低海拔地区后面临着严峻
的夏季高温环境胁迫，其正常生长及观赏价值会被影响。欲将南瓜细胞中的HSP70 基因（结构如图1 所示，
其中B 链是转录的模板链）用图2 所示的质粒导入花楸树细胞来研究其表达与耐热性之间的关系。回答下
列问题：
注：XhoI、KpnI、SacI 为三种限制酶，其识别位点分别是5'CTCGA↓G、5'G↓GTACC、5'GAGCT↓C；
AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。
(1)可通过提取南瓜细胞中的 经逆转录获得HSP70 基因，并用PCR 对其进行扩增。在PCR 扩增
HSP70 基因时应选择的引物组合是引物 。为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接，需在引物
（填“I”“Ⅱ”“Ⅲ”或“IV”）的5'端添加-CTCGAG 序列。
6
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(2)通过农杆菌转化法转化花楸树细胞后，可以使用含 的选择培养基筛选出含有目的基因的花楸树细
胞。将某细胞培育为植株后进行自交，收获子代植株641 株，其中不耐高温的植株为42 株，不考虑突变和
互换，出现该结果的原因最可能是 。
(3)为了检测目的基因是否成功导入并是否稳定维持和表达其遗传特性，可从分子水平上用PCR 技术进行
检测。若用PCR 技术进行检测，以花楸树细胞提取的DNA 为模板，PCR 扩增HSP70 基因片段后进行琼脂
糖凝胶电泳实验，结果如图3（1 号为空白对照，2、3 号为转基因植株）所示。若与1 号相比，2 号花楸树
植株的耐热能力没有增强，原因可能是 。
4．多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸，为解决猪肉中PUFAs 含量不足的问题，研究者从线虫
中获得控制PUFAs 合成的必需酶基因fatl，培育转fatl 基因猪，操作过程如图所示。图中GFP 基因表达出
绿色荧光蛋白。据图回答下列问题：
(1)用PCR 技术在体外扩增目的基因时，PCR 扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、 （答出2 点）等。
(2)由图可知，在构建基因表达载体时，为克服目的基因自身环化，即线性DNA 的末端相互连接形成圆环，
以及便于目的基因与载体的连接，切割含目的基因的DNA 和载体的限制酶应选用 和 。
(3)构建的基因表达载体中，GFP 基因的作用是 。除GFP 基因外，未标注出的必需元件还有 。
(4)猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期 ，以防止细胞代谢
物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为 。
7
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
此过程中，对于悬浮培养的细胞直接用 法收集细胞处理成细胞悬液。
(5)经检测，fatl 基因成功整合在猪基因组DNA 后，不能说明成功培育转基因猪，还需要 。
5．透明质酸（HA）又称玻尿酸，是重要的医学材料和化妆品添加原料。枯草芽孢杆菌无透明质酸合成酶
（HAS），但含有HA 代谢的其他途径，而链球菌含有HAS 的基因（H 基因）。研究者通过基因工程来改
变枯草芽孢杆菌代谢通路，以实现枯草芽孢杆菌生产HA。
(1)目的基因的获取和扩增：从链球菌获取H 基因，为通过外源添加诱导剂来控制H 基因的表达，研究者选
择含木糖诱导型启动子的p 质粒作为H 基因的运载体，其中EcoRV 识别序列为5'—GATATC—3'，XbaI 识
别序列为5'-TCTAGAH—3'，H 基因以a 链作为转录模板链，据此推测H 基因的转录从其 （填“左
侧”或“右侧”）开始。利用PCR 扩增H 基因时，需依据图中已知碱基序列及以上信息，设计的两种引物
碱基序列为 和 （写出5'端的10 个碱基）。
(2)基因表达载体的构建：用XbaI 酶和EcoRV 酶处理目的基因和p 质粒，然后加入 酶催化重组质粒形
成。
(3)目的基因的导入与筛选：将构建好的重组质粒转入经 处理的枯草芽孢杆菌，在含 的培养基上筛
选，得到枯草芽孢杆菌A。
(4)菌种扩大培养与发酵：用发酵工程对转基因枯草芽孢杆菌进行大规模培养，该工程的中心环节是 。
扩大培养的枯草芽孢杆菌A 接种一定时间后添加 ，诱导合成HA。HA 对枯草芽孢杆菌来说属于
（填“初生”或“次生”）代谢产物。
6．中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）是可以无限增殖的细胞。科研人员利用CHO 细胞系生产乙肝疫苗的过
程是：①将得到的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因与信号肽基因连接形成融合基因，信号肽可以引导
HBsAg 进入内质网内进行合成和加工，进而以分泌蛋白的形式分泌到胞外，融合基因的结构如图1 所示；
②将融合基因插入图2 所示的质粒，将重组质粒与带有小鼠二氢叶酸还原酶（dhfr）基因的质粒共转染缺
乏二氢叶酸还原酶的CHO 细胞；③从CHO 细胞系的培养液中分离提取HBsAg，用以生产乙肝疫苗。图1
中的F1~F4分别为扩增信号肽基因和HBsAg 基因时所需的引物。请回答下列问题：
8
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(1)需要通过 技术扩增融合基因，该技术的原理是 。
(2)为了将信号肽基因和HBsAg 基因连接在一起，在分别扩增两种基因时，应在引物F2和引物F3的5′端引
入 。通过PCR 检测融合基因是否形成，可选用图1 中引物 对连接产物进行扩增。
(3)为了将融合基因正确地插入图2 所示的质粒，应选择限制酶 切割质粒。与单独将HBsAg 基因转
入CHO 细胞相比，导入融合基因的好处是 。
(4)缺乏dhfr 的CHO 细胞在培养基上不能正常生长，因此在筛选表达HBsAg 的细胞株时，dhfr 基因起
的作用。
(5)在生物反应器中大规模连续培养目标细胞株时，通过 的措施，为培养的细胞株营造无毒的环境。
同时要通入 和5%CO2的混合气体，其中CO2的主要作用是 。
7．细胞中NF-κB 蛋白的活性水平与肿瘤的发展呈正相关。为了高效地筛选出以NF-κB 为靶点的抗肿瘤药
物，研究人员利用基因工程构建了NF-κB-GFP 的报告基因载体。具体原理为把已确定的NF-κB 基因与报
告基因GFP（其表达产物荧光蛋白可被实时检测）正确连接，使报告基因能与NF-κB 基因同步表达，其工
作模式见下图1。回答下列问题：
(1)构建NF-κB-GFP 报告基因载体时，首先利用PCR 技术扩增GFP 基因序列，能否准确扩增出GFP 基因的
关键是 。降温至50℃时，PCR 反应体系中完成的反应主要是 。
(2)GFP 基因所在DNA 分子上有3 种限制酶（BamHI、EcoRI、HindⅢ）的识别序列；如下图2 所示。限制
9
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
酶BamHI 在碱基G 和G 之间进行切割，画出其切割后产生的黏性末端（体现出限制酶的切割位点）
。应使用限制酶 对GFP 基因所在的DNA 进行切割，再连接到质粒上，该方法的优点是
。最后得到NF-κB-GFP 报告基因载体，该载体中GFP 基因和NF-κB 基因表达时使用的启动子
（填“相同”或“不同”）。
(3)将NF-κB-GFP 报告基因载体导入肿瘤细胞常用的方法是 。体外培养肿瘤细胞需要提供
（答出2 点即可）条件；再放入气体具体组成成分为 的培养箱中进行培养。
(4)将导入成功的肿瘤细胞置于含待检测抗肿瘤药物的培养基中培养一段时间，并检测细胞中GFP 蛋白表达
量的变化。若药物抗肿瘤效果显著，可观测到的现象为 。
8．磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6 的活性形式，是多种酶的重要成分。科研人员从大肠杆菌(E. colik12)中找
到了合成PLP 的关键酶A，通过基因工程构建了高产PLP 的工程菌，流程如图甲所示。图甲中③过程后将
工程菌置于含氨苄青霉素的培养基中培养，对筛选出的4 个工程菌菌落进一步检测，结果如图乙所示。请
回答下列问题：
(1)DNA 复制时，DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖即 (填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向合成互补链。
②过程是基因工程的核心工作，需要用到的两种工具酶为 。
(2)由图乙分析，只有 号菌落才是高产PLP 的工程菌菌落，原因是 。
(3)蔬菜是提供维生素的重要食物来源。科学家利用苏云金芽孢杆菌和具有防病等优良性状的枯草芽孢杆菌
10
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
进行原生质体融合，构建了多功能工程菌，其对小菜蛾的杀虫率在59%以上，对防治蔬菜病虫害具有重要
意义。
①苏云金芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的细胞壁的主要成分是 ，可选择 (填“纤维素酶
和果胶酶”“蛋白酶”或“溶菌酶”)对这两种细菌进行去壁处理，从而获得两者的原生质体。
②从培养基类型(物理性质)来讲，如何对工程菌进行筛选与扩大培养？ 。
9．玉米原产亚热带，幼苗抗寒能力弱，为提高玉米植株的抗寒性，科学家利用基因工程将耐寒蛋白基因
（LEA 基因）导入玉米细胞中获得转基因玉米。如图为Ti 质粒和LEA 基因的酶切位点，其中酶A、B、C
均为限制酶。回答下列问题：
(1)将Ti 质粒和LEA 基因构建成基因表达载体需要利用酶 切割DNA，原因是 。
(2)构建好的基因表达载体导入土壤农杆菌前，需要用含（Ca2+的溶液处理土壤农杆菌，目的是 。Ti 质
粒中的氨苄青霉素抗性基因的作用是 。
(3)为确保获得的玉米植株是抗寒性较强的转基因玉米，可进行 检测，之后再进行玉米植株的耐寒性实
验。
(4)为制备强耐寒蛋白基因突变系，科研人员将单个突变碱基引入LEA 基因组cDNA 质粒克隆，流程如图。
已知在农杆菌体内合成的DNA 分子有甲基化修饰，通过PCR 扩增的DNA 链无甲基化修饰。
①已知DpnI 可识别甲基化的GATC 四个碱基序列，因此其能将 水解消化掉。
②若已知重组质粒为a 个，经过程①扩增15 个循环，需要突变引物 个，后经过程②形成的产物全部转
入农杆菌后复制n 轮，得到双链突变的DNA 个。
11
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
10．1965 年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科
学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB 法是根据胰岛素A、B 两条肽链的
氨基酸序列人工合成两种DNA 片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA 法
是利用胰岛B 细胞中的mRNA 得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为
载体。
(1)AB 法中人工合成的两种DNA 片段均有多种可能的序列的原因是 。用 （填
“AB”、“BCA”或“AB 和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2)图中是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确
连接，在设计PCR 引物时可添加限制酶 的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要
通过PCR 技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-TTTAAAGGG-，则对应引物设计的序列
是5'- -3'。
(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal 产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。据此，经钙离子
处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal 的培养
基上筛选出 色的菌落即为工程菌。
(4)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。
写出获取赖脯胰岛素基因的流程：从 →设计预期的蛋白质结构→ →找到相对于的
脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质。
12
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
13
