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专题05 基因工程
从近几年的新课标卷的考查知识点来看，第24 题主要考查基因工程知识。
基因工程的流程和应用是高考的必考点，且常考常新，预计2023 年高考也不例外，依然会对其进行考查，
有可能与新的科研实事结合，综合考查基因工程的流程和应用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细胞
工程、胚胎工程等综合起来考查。
1、（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，
如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
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A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度
(2)CD
(3)限制性内切核酸酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
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（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行
PCR 扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR
过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR 反应体系中，模
板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温
度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用
的Taq DNA 聚 133 合酶为例，催化DNA 延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片
段大小在 30s~2min 的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能
与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中
的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，
由于PCR 产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核
酸酶（限制酶）和DNA 连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落
无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
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（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
2、（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛
形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能
是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进行了PCR 扩
增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，溶
液中添加NaC1 至2．0mol/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在 催化
下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，
可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M 重组质粒（在
EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融
①选择图Ⅱ引物 ；
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合片段M 中有白色的箭头，代表方
向）
②PCR 目的产物约为 bp。
确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连
接处上游含有Hind III+EcoR V 的识别
序列，下游含有EcoR V+BamH I 的识
别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细
胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤
毛基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量
相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环
数）。从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
倍。
【答案】(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心）
(2) 溶解DNA 耐高温DNA 聚合酶（Taq 酶） 3'
(3) a、b 1100 Q4 X 蛋白参与中心体的形成
(4) 逆转录 32
【分析】PCR 技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）；
PCR 的操作过程：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢
键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。
（2）从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，DNA 在2．
0mol/L 的NaC1 溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA 的溶解度均会下降，因此实验过程中添加
NaC1 至2．0mol/L 的目的是溶解DNA。PCR 扩增时，需在耐高温的DNA 聚合酶（即Taq 聚合酶）的催化
下，在引物的3’端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
（3）PCR 扩增目的DNA 片段时，在引物的3’端进行DNA 链的延伸，据图可知，应选择图II 中的引物a
和引物b，PCR 目的产物约为300+800=1100bp。确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连接处上游含有Hind
III+EcoR V 的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I 的识别序列，根据题干信息构建Y-M 重组质粒（在
EcoRⅤ位点插入片段），Y-M 的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I 的识别序列，根据EcoR V
识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细胞，发现对照组
整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X 参与中心体的组成。
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（4）研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量相等的条
件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环数），说
明病人基因Z 表达较弱，设健康人Z 基因的cDNA 数为x ，病人Z 基因的cDNA 数为y ，则有
x×215=y×220，从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
25=32 倍。
3、（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m 的功能，构建了融合表达蛋白M 和tag 标签的质粒，
请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m 片段。
②为了获得融合tag 标签的蛋白M，设计引物P2 时，不能包含基因m 终止密码子的编码序列，否则将导致
。
③热启动PCR 可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA 聚合酶（Taq 酶）以外的各成分混合后，加
热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR 扩增，下列叙述正确的有
A．Taq 酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR 相比，热启动PCR 可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
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D．PCR 产物DNA 碱基序列的特异性体现了Taq 酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I 切开的载体A 与添加同源序列的m 混合，用特定DNA 酶处理形成黏性末端，然后降温以促进
，形成A-m 结合体。将A-m 结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA 聚合酶及 酶等，完成质
粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m 仍能被Sma I 切开，则Sma I 的酶切位点可能在 。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3 基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿
嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag 标签，说明 ，后续实验可借助tag 标签进行蛋
白M 的分离纯化。
【答案】(1) mRNA 蛋白M 上不含tag 标签 BC
(2) 黏性末端碱基配对 DNA 连接 基因m 的连接处或基因m 的内部
(3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3 基因可以长成菌落
融合基因表达（或融合基因正确解码）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①以逆转录获得cDNA 的方式，要先从真菌细胞中提取基因m 转录出来的mRNA。
②从构建好的重组质粒上看，tag 序列位于目的基因下游，若m 基因的转录产物mRNA 上有终止密码子，
核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag 序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M 上就不含tag
标签。
③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR 扩增”，故Taq 酶最适催化温度
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范围为94℃左右，A 错误；
B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形
成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反
应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B 正确；
C、DNA 分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C 正确；
D、Taq 酶没有特异性，与普通的DNA 聚合酶相比，Taq 酶更耐高温，D 错误。
故选BC。
（2）①从图上看，载体A 只有一个Sma I 的酶切位点，故被Sma I 切开后，载体由环状变为链状DNA，
将Sma I 切开的载体A 与添加同源序列的m 混合，用特定DNA 酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载
体A 与添加同源序列的m 的黏性末端碱基互补配对。将A-m 结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的
DNA 聚合酶及DNA 连接酶等，完成质粒的环化。
②重组质粒中，载体A 被Sma I 切开的位置已经与基因m 相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的
重组质粒A—m 仍能被Sma I 切开，则Sma I 的酶切位点可能在基因m 的连接处或基因m 内部。
（3）①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m 的目的菌株由于含有URA3 基因，能在无尿嘧啶的培养
基上存活，而URA3 基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag 标签，位于lag 标签上游的基因m 应该正常表达，说
明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细
节，能将教材中的知识结合题中信息进行知识迁移，准确答题。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．谷氨酸脱羧酶能以谷氨酸钠为前体产生γ-氨基丁酸，蛋白质复合物SNOI-SNZI 能提高谷氨酸脱羧酶的
活性。将谷氨酸脱羧酶基因gadB(1401bp)和基因SNOI(675bp) 、SNZI (894bp) 导入大肠杆菌， 以探究该
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复合物对其生产能力的影响。请回答下列问题：
(1)构建基因表达载体前，需先通过PCR 分别扩增目的基因片段，扩增反应体系应添加引物、模板、 、
缓冲液等，添加引物量不宜过多，原因主要是 。
(2)表1 是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2 是多种限制酶的识别序列和切割位点。构建重组质粒时，
先将gadB 和 pTrc99a 质粒(4176bp)分别用限制酶 进行双酶切， 并连接得到重组质粒 pTrc99a-
gadB。将基因 SNOI 和基因SNZI 分别连接到重组质粒 pTrc99a-gadB 上时， 均需用 (填限制酶)和
DNA 连接酶处理，最终得到重组质粒 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI，如图1 所示。
表1
基因
引物1 部分序列(5'→3')
引物2 部分序列(5'→3')
gadB
TCGCCCATGGCCATGATAAG
CTTCGGTACCTTAGGTATGT
SNZ1
CTAAGGATCCGAAGGAGATA
CCTTCTCTAGATTACCACCC
SNO1
TCGCGGTACCAAGGAGATAT
CTTCGGATCCTTAATTAGAA
表2
限制酶
识别序列
和酶切位点
Xba Ⅰ
T↓CTAGA
Kpn Ⅰ
GGTAC↓C
Nco Ⅰ
C↓CATGG
BamH Ⅰ
G↓GATCC
(3)采用电泳的方法对 pTrc99a 质粒、重组质粒 pTrc99a-gadB 和重组质粒 pTrc99a-gadB-SNO1-SNZI 进行
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鉴定。若构建成功， 用限制酶KpnI 单酶切后电泳获得图2-A，则可推测泳道2 是 的电泳结果；用限
制酶 酶切后电泳可获得图2-B 泳道3 结果。
(4)将质粒 pTrc99a、pTrc99a-gadB 和 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI 分别转化至处于 的大肠杆菌细胞中，
分别获得菌株R1、R2、R3，培养后分别接种于含一定量 的发酵培养基中，一段时间后测定γ-氨基丁
酸含量。结果如图3 所示。结果表明，与导入谷氨酸脱羧酶基因的菌株比，SNOI-SNZI 基因的导入
了其生产γ-氨基丁酸的能力，从能量代谢的角度分析，其原因有 。
【答案】(1) TaqDNA 聚合酶、四种脱氧核苷酸 易引起非特异性扩增
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(2) NcoI 和KpnI BamHI
(3) 重组质粒pTre99a-gadB BamHI 和Xba1
(4) 感受态(能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态) 谷氨酸钠 降低 SNOI-SNZI 基因
表达及其引起的细胞代谢过程消耗了大量的能量，导致γ-氨基丁酸的生产能力下降
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：利用PCR 技术扩增和人工合成。基因表达载体的构
建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导
入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）利用PCR 获取目的基因时，PCR 反应体系需要加入缓冲液、模板DNA、引物、4 种脱氧核
苷酸、耐高温的DNA 聚合酶等。若引物量添加过多，则引物会与非扩增序列中模板结合，易引起非特异
性扩增。
（2）根据表1 中GadB 基因的引物1 中含有序列CCATGG，引物2 中含有序列GGTACC，结合表2 可知，
要将GadB 基因插入质粒，需要用限制酶NcoI 和KpnI 将目的基因和质粒切出黏性末端，并用DNA 连接酶
连接得到重组质粒 pTrc99a-gadB。SNOI 基因的引物2 和SNZI 基因的引物1 上均含有GGATCC 序列
（BamHI 的识别序列），且重组质粒pTrc99a-gadB 上也含有BamHI 切割位点，结合表2 可知，将基因
SNOI 和基因SNZI 分别连接到重组质粒pTrc99a-gadB 上时，均需用BamHI 和DNA 连接酶处理，最终得到
重组质粒pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI。
（3）pTrc99a 质粒为4176bp，gadB 为1401bp，二者连接时需要使用NcoI 和KpnI 限制酶处理，因此构建
的重组质粒长度=4176+1401－265－286=5026，接近5000bp，重组质粒pTre99a-gadB 上含有一个限制酶
KpnI 识别位点，故用限制酶KpnI 单酶切后得到一个线性DNA，故推测图2-A 中泳道2 是重组质粒
pTre99a-gadB 电泳的结果。图2-B 的泳道3 中含有约1500bp 左右长度的片段，是基因SNOI(675bp)和SNZI
(894bp)的长度之和，图2-B 泳道3 中还含有接近5000bp 的片段，结合（2）构建重组质粒pTrc99a-gadB-
SNO1-SNZ1 所使用的限制酶可推测是使用限制酶BamHI 和XbaI 酶切后电泳获得的图2-B 泳道3 结果。
（4）将重组质粒导入大肠杆菌常用钙离子处理大肠杆菌，使其处于感受态，根据题意“谷氨酸脱羧酶能
以谷氨酸钠为前体产生γ-氨基丁酸”，因此培养基应加入谷氨酸钠。据图可知，R3 组的γ-氨基丁酸的含量
低于R2 组，说明与导入谷氨酸脱羧酶基因的菌株比，SNOI-SNZI 基因的导入降低了其生产γ-氨基丁酸的
能力，从能量代谢的角度分析，其原因可能是SNOI-SNZI 基因表达及其引起的细胞代谢过程消耗了大量
的能量，导致γ-氨基丁酸的生产能力下降。
2．Ⅰ、同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。下图是科研
人员利用该方法对大肠杆菌LacZ 基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB 基因
是蔗糖致死基因，LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解成蓝色化合物。请回答下列问题：
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限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
HindⅢ
XmaⅠ
识破序列和切割位
点
5'G↓AATTC3'
5'G↓GATCC3'
5'A↓AGCTT3'
5'C↓CCGGG3'
Ⅱ、咪唑喹啉衍生物（BEZ）和长春花碱（VLB）用于治疗卵巢癌、肝癌等癌症，为研究二者对肾癌的治
疗效果，研究人员进行了系列实验。
(1)过程①PCR 中影响退火温度的因素有引物的长度、 ，若温度过低会导致 。
(2)过程⑤中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加上 基因两端的同源序列。
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(3)过程⑦中，在含有 的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ 基因菌株。过程⑧通过
同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对LacZ 基因进行回补，筛选LacZ 基因回补菌株时应在培养基
中添加 。
(4)探究BEZ 和VLB 单独及联合使用对肾癌细胞凋亡的影响，结果如图1 所示。该实验的自变量是 ，
实验结果表明 对癌细胞凋亡无明显影响。
(5)Caspase—3 是细胞内促凋亡蛋白，Mcl—1 是Caspase—3 基因表达的调控因子。为研究BEZ 和VLB 治疗
肾癌的机制，研究人员对各组细胞进行实验处理24 小时后，检测Mcl—1 的mRNA 和蛋白质含量，结果如
图2.选用GAPDH 作为内参的原因是 。
(6)综合图1、图2 结果，在下列箭头上标明“+”或“-”（分别表示“促进”和“抑制”），图示药物发挥
作用的机理 、 。
【答案】(1) G、C 含量 非特异性扩增片段增多
(2)LacZ
(3) 四环素和X-gal 蔗糖和X-gal
(4) BEZ 的浓度、VLB 的浓度及不同浓度的组合 单独使用BEZ 和VLB
(5)GAPDH 基因在各组细胞中表达量基本相同，排除实验操作和检测方法的干扰
(6) （—） （—）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）影响退火温度的因素有引物的长度、G、C 含。若温度过低会导致引物与模板非特异性配对
增多，导致非特异性扩增片段增多。
（2）过程⑤中，设计两种引物时需在引物5＇端分别添加上LacZ 基因两端的同源序列，利用同源重组技
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术将LacZ 基因与载体相连。
（3）由于LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解成蓝色化合物，若培养基中出现白色菌落，则说
明成功导入重组质粒，LacZ 基因成功敲除，由于重组质粒上有四环素标记基因，故含有四环素和X-gal 的
培养基中出现白色菌落。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对LacZ 基因进行回补，
由于sacB 基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解
成蓝色化合物，则添加X-gal 起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X-gal 可筛选LacZ 基因回补菌株。
（4）由图可知，该实验的自变量是BEZ 的浓度、VLB 的浓度及不同浓度的组合，单独使用BEZ 和VLB
是细胞的凋亡数与对照组相比几乎无差别，故单独使用BEZ 和VLB 对癌细胞凋亡无明显影响。
（5）根据对图2 的分析可知，图2 中左图中GAPDH 内参的是mRNA，右图中GAPDH 内参的是蛋白质，
由于GAPDH 基因在各组细胞中表达量基本相同，选用GAPDH 作为内参的原因是排除实验操作和检测方
法的干扰。
（6）综合图1、图2 结果可知，BEZ 和VLB 共同使用抑制了Mcl-1 蛋白质的合成，Mcl-1 蛋白质含量的减
少对Caspase-3 基因表达的抑制作用减弱，从而Caspase-3 基因表达增强，Caspase-3 蛋白的含量增加，在
Caspase-3 蛋白的作用下促进细胞凋亡，从而达到减小肿瘤的体积的作用，故：
3．虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而
来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量
合成β-胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”（如图1）构建含BKT 基因和CRTR-B 基因的表达载体
（如图2，3），导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，回答下列问题。
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(1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总DNA 为 ，设计特异性
引物扩增BKT 基因和CRTR-B 基因，此过程需要 酶的催化。
(2)构建转化载体：
①PCR 获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序
列。若将来需要将抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增
抗除草剂基因时，设计的引物序列（
→
）为 。
A．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列
B．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列
C．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列
②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将BKT 基因和CRTR-B 基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如
图2 所示，推测此过程扩增BKT 基因所用的引物为 ；扩增CRTR-B 基因所用的引物为 。
③最终形成的重组质粒如图3 所示，其中atpA 启动子和psbA 启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内
源性启动子的目的是 。
(3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养，一段时间后，挑取生长状态良
好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。两次培养的目的分别为 、 。
(4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含
的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用相关技术检测是否成功表达 。
(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，
功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿
体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。
【答案】(1) 模板 耐高温DNA 聚合/Taq DNA 聚合
(2) B ①③ ⑥⑧ 确保目的基因正常表达
(3) 纯化杜氏盐藻 扩大培养杜氏盐藻
(4) 除草剂 β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶
(5) 目的基因的表达量 基因污染
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）因雨生红球藻是天然虾青素重要来源，是目的基因的来源，故可提取雨生红球藻的总 DNA
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为模板，设计特异性引物扩增其 DNA 中的 BKT 基因和CRTR-B 基因进行PCR 扩增，此过程需要 Taq
DNA 聚合酶（耐高温DNA 聚合酶）的催化。
（2）①根据 PCR 扩增的原理，在 PCR 过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在5’ 端添加对应
的同源序列；根据题意，若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，则所需引物（5’一 3’）的序列应
为“同源序列十限制酶识别序列十特异性扩增引物序列（抗除草剂基因部分序列）”，AC 错误，B 正确，
故选B。
②根据图2 所示，要通过“无缝克隆法”同时将 BKT 基因和CRTR-B 基因插入质粒，则要保证BKT 基因
一侧有一致同源序列，另一侧能带上CRTR-B 基因，因此扩增 BKT 基因所用的引物为①③ ； 同理，扩
增CRTR-B 基因所用的引物为⑥⑧。
③启动子是转录的起始信号，选用内源性启动子的目的是防止基因沉默，确保目的基因能表达。
（3）选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养的目的是纯化杜氏盐藻，挑取生长状态良好
的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养的目的是扩大培养杜氏盐藻。
（4）筛选已转化的杜氏盐藻的培养基是选择培养基，其中含除草剂；再通过抗原—抗体杂交实验检测是
否成功表达 β-胡萝卜素酮化酶和 β-胡萝卜素羟化酶。
（5）因每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量；且叶绿体基因位于细胞质中，一
般不能稳定遗传，因此可避免基因污染。
4．具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌，侵入肠粘膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加，导致
结直肠肿瘤的形成。细菌培养与鉴定等传统检测技术费时费力，不能满足快速检测的需求。科研人员采用
基于滚环扩增技术（RCA）的荧光标记滚环扩增检测方法，实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度和
高特异性的检测。下图1 为RCA 的原理示意图，图2 为荧光标记滚环扩增检测过程示意图，其中，nusG
基因为具核梭杆菌的特异性基因，锁式探针为依据nusG 基因序列设计出来的单链DNA 分子，检测探针中
的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）在一定的范围内时，荧光会被淬灭。请回答下列问题。
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(1)RCA 反应体系中需添加多种物质，除图1 所示物质外，还应添加的物质是 RCA 产生长重复单链DNA
过程中，Phi29DNA 聚合酶既需催化 键的形成，也需催化 键的断裂。
(2)过程②为锁式探针进行连接以实现环化，该过程中需要的酶是 过程③中，需添加核酸外切酶进行
“消化”，据图分析“消化”的目的是 ，推测核酸外切酶的作用是 ，消化完成后，需将反应体系置
于95℃条件下持续20min 后再进行RCA 扩增，目的是 。
(3)过程④通过RCA 扩增得到长重复单链DNA，与常规PCR 相比，RCA 缺乏 环节，说明RCA 扩增过
程中所使用的Phi29DNA 聚合酶不具有 特性。
(4)若检测样品存在具核酸杆菌，经图2 中②-④过程得到的长重复单链DNA 与 特异性结合，导致FAM
与BHQ-1 距离增大，发出荧光。因为 ，提高了该检测方法的灵敏度；肠道中含有多种微生物，为保证
检测的特异性，在设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG 基因的特异性序列，同时还需注意无关序列中
。
【答案】(1) 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP） 磷酸二酯 氢
(2) DNA 连接酶 去除非成环的核酸序列 催化DNA（中核苷酸从末端逐个）水解 使核
酸外切酶变性，防止对后续RCA 扩增产生影响
(3) 变性 耐高温
(4) 检测探针 长重复单链DNA 中可同时结合多个检测探针
尽可能不含有其他微生物的序列
【分析】PCR 是体外模拟DNA 复制的过程，其原理是DNA 双链复制。体内DNA 复制过程中需要模板、
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原料、能量、引物和酶等，PCR 过程中原料和能量由dNTP 提供，酶是热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）。
【详解】（1）PCR 是体外模拟DNA 复制的过程，PCR 过程中需要模板、原料、能量、引物和酶等，图1
含有模版、引物和酶，还应该添加4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），为PCR 提供原料和能量。由图1 可知，
以单链环状DNA 为模板可在Phi29DNA 聚合酶作用下形成滚动形成长重复单链DNA，说明Phi29DNA 聚
合酶既需催化磷酸二酯键的形成，也需催化氢键的断裂。
（2）过程②为锁式探针进行连接以实现环化，即在nusG 基因一条链与锁式探针碱基互补配对的前提下，
通过DNA 连接酶形成磷酸二酯键将锁式探针连接形成环状，因此②过程中需要的酶是DNA 连接酶。据图
可知，过程③在核酸外切酶作用下去除非成环的核酸序列，保留形成环状的单链DNA，即核酸外切酶的作
用是催化DNA（中核苷酸从末端逐个）水解。消化完成后，需将反应体系置于95℃条件下持续20min 后
再进行RCA 扩增，目的是使核酸外切酶变性，防止对后续RCA 扩增产生影响。
（3）由于模板是单链DNA，因此扩增时不需要解旋形成单链，故与常规PCR 相比，RCA 缺乏变性环节，
即该扩增过程不需要在高温条件下进行，因此可说明RCA 扩增过程中所使用的Phi29DNA 聚合酶不具有耐
高温特性。
（4）若检测样品存在具核酸杆菌，经图2 中②-④过程得到的长重复单链DNA 与检测探针特异性结合，导
致探针两端的FAM 与BHQ-1 距离增大，发出荧光。由于长重复单链DNA 中可同时结合多个检测探针，从
而使荧光强度增加，因此提高了该检测方法的灵敏度；肠道中含有多种微生物，为保证检测的特异性，在
设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG 基因的特异性序列，同时还需注意无关序列中不含其它微生物的
特异性碱基序列，防止扩增的长重复单链中含有其它微生物的特定碱基序列。
5．黑水虻是重要的资源昆虫，体内H 基因编码的抗菌肽HI-3 具有抗菌、抗癌和免疫调节作用。科研人员
利用酵母菌生产抗菌肽HI-3，并避免基因污染。请回答下列问题：
(1)利用PCR 技术扩增H 基因，需根据H 基因设计两种引物，引物的作用有____。
A．为Taq 酶提供结合位点
B．决定扩增产物大小
C．决定反应的特异性
D．决定变性时间
(2)已知H 基因编码链的编码区序列是：5'-CTCGAGATGCTGCAG………GGATCCTC-TAGA-3'，扩增H 基
因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是 （方向为5'→3'，写出5'端8 个碱基序列）。
获得H 基因产物后需要进行凝胶电泳，将符合要求的条带 以便提取纯化并进行测序。
(3)由于抗菌肽HI-3 会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H 基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了
最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3 对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA 中
插入P 和S 基因，使质粒上H 基因的表达受红光控制。红光调控H 基因表达的原理如图1 所示。
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P 和S 基因表达应为 （从“组成型表达”“红光诱导型表达”选填）。红光调控H 基因表
达的原理是S 基因指导合成的S 蛋白直接与启动子Jub 结合，P 基因表达的P 蛋白在 ，启动
H 基因的表达过程。
(4)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F 蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而
沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统如图2，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E 蛋白的
基因（E1、E2），使F 基因的表达受到蓝光控制如图3。
图3 中E2 基因持续性表达少量的E 蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力，E1 基因的作用是
。
(5)制药过程中需避免工程菌泄露到环境中引发基因污染。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T 和L）和调
控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N 的表达，进而诱导工程菌死亡，如图4。
若图中①选用的启动子为Jub ，②处选用的启动子为CYC ，则③④处结合的阻遏蛋白分别为
。
(6)请结合上述分析，利用该工程菌发酵生产抗菌肽HI-3 各阶段需控制的光照条件是：I 菌种培养阶段
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；Ⅱ菌种发酵阶段 ；II 产物分离阶段 ；IV 安全处理阶段红光、蓝光同时照射。
【答案】(1)ABC
(2) 5'-TCTAGAGG-3' 切割和回收
(3) 组成型表达 红光调控下，与结合在启动子上的S 蛋白结合
(4)蓝光照射后，快速表达大量E 蛋白，进而激活F 基因的表达
(5)T 蛋白、L 蛋白
(6) 黑暗 红光照射 蓝光照射
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——DNA 分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活
性鉴定等。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，引物之间或引物内部
不能互补配对，用于PCR 的引物长度通常为20-30 个核苷酸，引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始
连接脱氧核苷酸，提供了DNA 聚合酶所需的3'端（末端），即为Taq 酶提供结合位点，引物的长度和位置
决定了PCR 扩增产物的大小，引物的设计基于已知的目标DNA 序列，决定反应的特异性，ABC 正确。
故选ABC。
（2）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，已知H 基因编码链的编码区序
列是：5'-CTCGAGATGCTGCAG………GGATCCTC-TAGA-3'，扩增H 基因的编码区段时，结合到编码链
上的引物序列是5'-TCTAGAGG-3'；获得H 基因产物后需要进行凝胶电泳，将符合要求的条带切割和回收
以便提取纯化并进行测序。
（3）由图可知，P 和S 基因的表达不需要其他物诱导，因此属于组成型表达，H 基因属于红光诱导型表达；
由图可知，在没有红光诱导时，S 基因指导合成的S 蛋白直接与启动子Jub 结合，红光调控下，P 基因指导
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合成的P 蛋白与结合在启动子上的S 蛋白结合，启动H 基因的表达（转录）过程。
（4）依据题意可知，科研人员引入蓝光激活系统目的是激活F 基因表达产生F 蛋白，使酵母细胞彼此结合，
进而沉淀在发酵罐底部，与CYC 相连的E1 基因的作用是接受照射蓝光后，快速表达大量E 蛋白，进而激
活F 基因的表达。
（5）依据题干可知，启动子Jub 接受红光的诱导调控，启动子CYC 接受蓝光的诱导调控，③和④为阻遏
蛋白的结合位点，其与阻遏蛋白结合后会抑制相关基因的表达。致死基因N 的表达会诱导工程菌死亡，若
①选用的启动子为Jub，②处启动子为CYC，在红光和蓝光同时照射时，红光调控Jub 启动子启动T 基因
表达出T 蛋白，结合在③处，抑制了L 基因的表达，④处无L 阻遏蛋白与之结合，在蓝光调控下，CYC 启
动N 基因的表达而使酵母菌死亡，故③④分别是T 蛋白、L 蛋白。
（6）根据题目信息，红光照射使产物增多，蓝光照射使产物凝集，红蓝光同时照射使工程菌死亡，I 菌种
培养阶段应在黑暗条件下培养至种群数量达到最适，Ⅱ菌种发酵阶段红光照射至抗菌肽HI-3 在培养液中达
到适宜浓度，II 产物分离阶段蓝光照射至工程菌凝集，回收发酵产物；IV 安全处理阶段红光蓝光同时照射，
杀死工程菌。
6．结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细
胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化
为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
(1)小鼠SP110 基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110 基因的功能，
同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR 可以启动SP110 基因在吞噬细胞内的表达，将MRS 启动
子与小鼠SP110 基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。
组别
主要操作
培养细胞后，使之破裂
对照组
1
空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量
结核杆菌
细胞培养72 小时后，加入③ ，使吞噬细胞破
裂，释放结核杆菌
对照组
2
含有能广泛表达SP110 基因的山羊肺泡吞
噬细胞，①
实验组
② ，接种等量的结核杆菌
取三组实验等量的细胞裂解液，用 法培养，结果如下图1 所示。由图可知小鼠SP110 基因可用于双抗
羊的研制，依据的实验现象是 。
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(2)非致病性朊蛋白是由山羊13 号染色体上的PRNP 基因的第三外显子控制合成的，PRNP 基因的结构如图
2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP 基因的外显子3 序列实施定点敲除。
请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据 设计引物
进行PCR，并用 作用于PCR 产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
(3)用TALEN 敲除载体与供体DNA 表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因
定点敲入PRNP 基因的外显子3 部位，原理如图3．请指出图4 中数字1 和2 的分别代表的结构：1．
、2． 。经用 法检测，山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110 基因的表达情况是
（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。
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(4)欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有 （至少写出两项）。
【答案】(1) 接种等量的结核杆菌 含有融合基因与质粒构建的重组质粒的山羊肺泡吞噬细胞
等量蒸馏水 稀释涂布平板 组3 的吞噬细胞裂解后释放的结核杆菌数量与组2 接近，显著小于组
1
(2) 外显子3 的（部分）序列 BamHⅠ
(3) L4 序列 MRS 启动子 抗原抗体杂交技术 均降低（或不表达）
(4)体细胞核移植、动物细胞培养（早期胚胎培养）、胚胎移植
【分析】基因工程中的操作工具及其作用：
①“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶），能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，
并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
②“分子缝合针”——DNA 连接酶，E·coliDNA 连接酶，只能将双链DNA 片段互补的黏性末端之间的磷
酸二酯键连接起来；而T4DNA 连接酶能缝合黏性末端和平末端。
③“分子运输车”——载体。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti 质粒上的T-
DNA 可整合到受体细胞的染色体DNA 上。基因表达载体常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。
标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
【详解】（1）实验目的是验证SP110 基因的功能，同时验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR 可以启动
SP110 基因在吞噬细胞内的表达，自变量是是否有SP110 基因、是否有特异性启动子MSR，实验组是将
MRS 启动子与小鼠SP110 基因形成融合基因，构建成重组质粒后导入肺泡吞噬细胞，现在已经设置转入空
质粒的山羊吞噬细胞为对照组（组1），还需要设置已经转入广泛表达小鼠SP110 基因的重组质粒的山羊
吞噬细胞（组3）作为对照组。构建重组质粒时，需要用限制酶切割目的基因和质粒，用DNA 连接酶将目
的基因和质粒连接在一起。分别接种等量的结核杆菌，经72h 后需要使吞噬细胞破裂，应加入蒸馏水使其
吸水膨涨破裂。取三组实验等量的细胞裂解液，用稀释涂布平板法培养，根据图1，实验组（组2）的吞噬
细胞裂解后释放的结核杆菌数量和组3 接近，显著小于1 组，说明特异性启动子MSR 可以启动SP110 基因
在吞噬细胞内的表达。
（2）由图可知，外显子3 序列内部存在限制酶BamHⅠ识别序列，若利用基因敲除技术对体外培养的山羊
成纤维细胞PRNP 基因的外显子3 序列实施定点敲除，则外显子3 内部限制酶BamHⅠ识别序列被破坏，因
此检测敲除是否成功可提取山羊成纤维细胞的DNA，根据外显子3 的（部分）序列设计引物进行PCR，并
用BamHⅠ作用于PCR 产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
（3）非致病性朊蛋白是由山羊13 号染色体上的PRNP 基因的第三外显子控制合成的，为了降低非致病性
朊蛋白的量，同时又能抗结核病，可设计用将MRS 启动子与小鼠SP110 基因形成的融合基因替换PRNP 基
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因的第三外显子，据图2 和图3，对山羊成纤维细胞L4 与R1 之间的序列实施定点敲除，将TALEN 敲除载
体与供体DNA 载体（MRS 启动子与小鼠SP110 基因形成的融合基因）共转化幼羊成纤维细胞，将SP110
基因定点敲入PRNP 基因的第三外显子中。则图4 中供体DNA 表达载体中：1 是L4 序列（和第三外显子
前的L4 序列同源），2 是MRS 启动子，3 是终止子（使SP110 基因转录停止），4 是R1 序列（和第三外
显子后的R1 序列同源）。若想对山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110 基因的表达情况进行检
测，则需要进行抗原抗体杂交技术。由于PRNP 基因的第三外显子被敲除，非致病性朊蛋白基因不表达，
由于成纤维细胞中特异性启动子MSR 不能发挥作用，SP110 基因也不表达。
（4） 若将TALEN 敲除载体与供体DNA 载体共转化的幼羊成纤维细胞获得双抗羊，首先将该细胞细胞核
移植到去核卵母细胞中，诱导卵母细胞分裂、分化，进行早期胚胎细胞培养，到适宜阶段进行胚胎移植，
移入适宜的代孕母体。
7．蒂蛀虫是荔枝的重要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如下图1 所示。图2 是SalI、HindⅢ和
BamHI 三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题：
(1)与RNA 相比，质粒特有的化学成分是 ；抗氨苄青霉素基因的作用是 。
(2)研究人员采用了如下图巢式PCR 技术获取抗虫基因，巢式PCR 是一种变异的聚合酶链反应（PCR），
使用两对PCR 引物扩增完整的片段。第一对PCR 引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR 相似。第二对
引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR 扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR 产物内部，
使得第二次PCR 扩增片段短于第一次扩增。
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①PCR 扩增时加入引物的原因是 ，在最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min 的目的是
，PCR 产物常采用 来鉴定。
②相比于常规PCR，巢式PCR 获得错误目标产物概率 ，这是因为 。
③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR 扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是 ，不
添加在引物3'端的原因是 。
(3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的 ，能携带目的基因进入受
体细胞，并将目的基因整合到受体细胞 上。
(4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可采用鉴定方法是 。
【答案】(1) 脱氧核糖和胸腺嘧啶 便于筛选含重组DNA 分子的受体细胞
(2) Taq 酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3’端上 充分延伸子链 琼脂糖凝胶
电泳 低 如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概
率低 AAGCTT 和GTCGAC 使引物的3’端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸
(3) Ti 质粒含有一段T-DNA 染色体DNA
(4)采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
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（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】（1）质粒的本质为小型环状的DNA 片段，与RNA 相比，质粒特有的化学成分是脱氧核糖和胸
腺嘧啶；抗氨苄青霉素基因可作为标记基因，标记基因的作用为便于筛选含重组DNA 分子的受体细胞。
（2）①由于Taq 酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3’端上，故PCR 扩增时加入引物，延
伸过程的温度一般为72℃，最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min 的目的是充分延伸子链，琼脂
糖凝胶电泳能将不同分子量的DNA 分开，PCR 产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
②如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概率低，故巢式
PCR 获得错误目标产物概率低。
③由图1 可知，BamHI 会破坏目的基因，所以可以用SalI、HindⅢ两种限制酶切割目的基因的两端及质粒，
可防止目的基因和质粒的自我环化或反向连接，所以第二次PCR 扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序
列是AAGCTT 和GTCGAC。子链延伸的方向为5'端→3’端，为了使引物的3’端与模板链严格互补配对，
保证子链的延伸，故不添加在引物3'端。
（3）农杆菌含有Ti 质粒，Ti 质粒含有一段T-DNA，T-DNA 能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因
整合到受体细胞的染色体DNA 上。
（4）培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可从个体水平做抗性实验鉴定，鉴定方法是采摘转基因抗虫荔枝
叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况。
8．为筛选出宿主细胞中能与某病毒S 蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S 蛋白末端添加TAP 标签，
再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S 蛋白及其相互作用的蛋白质，过程如下图。请回答下列问题：
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(1)S 基因及TAP 基因的体外扩增
①通过PCR 体外扩增S 基因时，应该在S 基因的5'端引入 和 序列，并删除S 基因3'端的 编码
序列。
②为了防止PCR 反应中发生突变，常选择高保真Pyrobest DNA 聚合酶，与一般的Taq DNA 聚合酶相比，
它具有3'到5'核酸外切酶活性，Pyrobest DNA 聚合酶能防止发生突变的原因是 。
③PCR 一般要经历三十多次循环，在第一次循环之前，常进行预变性（95℃5min），目的是 。
(2)重组质粒的构建
下表为四种限制酶的识别序列及切割位点：
限制酶
Xho l
Sma l
EcoR I
BamH l
识别序列
↓
5'-CTCGAG-3'
3'-GAGCTC-5'
↑
↓
5'-CCCGGG-3'
3'-GGGCCC-5'
↑
↓
5-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5'
↑
↓
5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'
↑
由图可知TAP 标签应该插入 酶切位点之间，经限制酶切割后，为得到目标 DNA 片段，还需要通过
进行鉴定和纯化，再加入DNA 连接酶完成质粒的环化。
(3)细胞转染
使用特定转染试剂，将纯化后的重组质粒进行细胞转染，为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体
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做法为 。
(4)融合蛋白的表达
①TAP 标签含有特定的氨基酸序列，可用异硫氰酸荧光素标记的 来检测融合蛋白的表达。
②研究发现，转染质粒之后融合蛋白的表达量较低，推测原因可能有
a. 重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 在病毒敏感细胞中大量复制
b. S-TAP 融合基因在病毒敏感细胞中转录出的mRNA 量较少
c. 病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA 的tRNA 数量不足
③若病毒敏感细胞在转染前感染过重组痘苗病毒，则共转染后发出荧光的细胞数量会明显增多，且荧光强
度显著增强，原因可能是 。
【答案】(1) Kozak 序列 Smal 识别序列 终止密码子 能切除不正确掺入的单核苷酸，
并将其替换成正确的核苷酸 增加模板DNA 分子彻底变性的概率
(2) EcoRI 和BamHI 琼脂糖凝胶电泳
(3)使用PCDNA3.1 空载体转染细胞，其余操作相同
(4) 特定抗体 bc 重组痘苗病毒感染细胞后，细胞中合成了能与T7 特异性结合的RNA 聚合
酶
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）①根据构建的重组质粒图示可分析，在S 基因的上游加入了Kozak 序列，为了使目的基因
和质粒连接，根据启动子的方向、质粒上的酶切位以及S 基因内部存在XhoI 序列进行分析，上游不能用
XhoI 酶，故应在S 基因的上游加入Smal 识别序列；因为S 基因和TAP 序列需要同步表达才能利用TAP 作
为S 蛋白的标签，二者共用一个启动子，故应去除S 基因下游的终止密码子编码序列。
②Pyrobest DNA 聚合酶具有3'到5'核酸外切酶活性，能切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的
核苷酸，故而可防止发生突变。
③变性是利用高温使DNA 解旋，第一次循环之前，常进行预变性可增加模板DNA 分子彻底变性的概率，
增大PCR 成功率。
（2）由图可知TAP 标签上游具有EcoRI 序列，下游具有BamHI，质粒上也具有EcoRI 和BamHI 序列，但
实际上用EcoRI 切割后TAP 直接与目的基因下游相连接，故应插入EcoRI 和BamHI 之间。PCR 的产物一
般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等
有关，凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。
（3）对照组是为了排除空质粒的影响，故应使用PCDNA3.1 空载体转染细胞，其余操作相同。
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（4）①TAP 标签含有特定氨基酸序列，可利用抗原-抗体结合原理，利用异硫氰酸荧光素标记的特定抗体
对TAP 标签进行检测，从而检测融合蛋白的表达。
②基因的表达包括转录和翻译两个过程，一方面若S-TAP 融合基因在病毒敏感细胞中转录出的mRNA 量较
少，会导致蛋白表达量低；另一方面tRNA 的数量与密码子的使用频率呈正相关，实验所使用的病毒敏感
细胞与病毒原宿主细胞在翻译时，若不同密码子的使用频率不同，会导致翻译的tRNA 数量不足，导致蛋
白表达量低，bc 正确。
故选bc。
③T7 是强启动子，能与病毒RNA 聚合酶特异性结合，若重组痘苗病毒感染细胞后，细胞中合成了能与T7
特异性结合的RNA 聚合酶，转染质粒之前若受体细胞感染某重组痘苗病毒，则发出荧光的细胞数量明显
增多，且荧光强度显著增强。
9．利用新冠病毒（SARS-CoV-2）包膜表面的S 蛋白研发的疫苗已在我国广泛接种。下图表示制备疫苗的
相关过程，其中m、n 分别是启动子和终止子，箭头处是限制酶的切点，SUC2 是酵母菌的蔗糖转化酶基因，
其终产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用。下表是可供选择使用的限制酶及其识别序
列和切割位点。
限制酶
BamHI
NheI
NcoI
SphI
Sau3AI
识别序列和切割位点
5'-G↓CTAGC-3'
5'-G↓GATCC-3'
5'-C↓CATGG-3'
5'-GCATG↓C-3'
5'-↓GATC-3'
(1)基因工程的核心是 。
(2)上图②过程所使用的两种酶是 ，选择两种酶切割的优点是 。
(3)由上图推测，目的基因S 表达的模板链是 链；该目的基因的表达离不开m，原因是
。
(4)RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。利用S 蛋白的RNA 作为模
板进行过程①，首先需要加入缓冲液、原料、 酶（酶I）、引物I 等物质后进行RT，获得单链
DNA 后，还需要添加与单链DNA 互补的引物II 及酶II，在PCR 过程中酶I 所处的状态是 。在
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PCR 过程中，Mg2+的作用是 。以一个单链DNA 为起点，进行n 次循环的扩增，理
论上需要 个引物Ⅱ；PCR 每次循环一般可以分为变性、 、延伸三步。
(5)SUC2 作为B 上的标记基因，可以对导入B 的酵母菌进行筛选。筛选时，需要使用以蔗糖为唯一碳源的
培养基，对受体突变型酵母菌的要求是 。
(6)与普通灭活或减活疫苗相比，上述方法制备的疫苗对人体更安全，主要原因是 。
【答案】(1)基因表达载体的构建
(2) NheI、NcoI 形成不同的黏性末端，防止质粒及目的基因自连及目的基因反接
(3) a 基因表达包括转录和翻译，启动子m 是RNA 聚合酶识别和结合部位，有了它才能驱动基因
的转录
(4) 逆转录酶 失活 激活耐高温的DNA 聚合酶 2n-1 复性
(5)不含SUC2 基因或者SUC2 基因被敲除
(6)此疫苗不含新冠病毒的核酸，不会在人体内增殖，仅注射病毒的部分蛋白进入人体，更安全
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基
因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程的基本步骤中第二步是核心步骤，即基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
（2）②过程为对DNA 进行切割形成黏性末端，需要两种限制性内切酶，从黏性末端可看出是识别序列分
别为5'-G↓GATCC-3'、5'-C↓CATGG-3'，因此选用的两种酶分别是NheI、NcoI；选择两种酶切割的优点是可
以形成不同的黏性末端，防止质粒及目的基因自连及目的基因反接，保证目的基因的正向连接。
（3）结合质粒上限制酶酶切位点可知，目的基因的上链位于重组质粒的内侧，下链位于外侧，转录方向
为m→n，且转录只能从模板链的为3'端开始，因此上链（a 链）是模板链（3'→5'方向与m→n 相同）；m
是启动子，帮助目的基因转录，因此该目的基因的表达离不开m。
（4） 酶I 是逆转录酶，在PCR 的过程中由于温度过高，酶I 已失活；在PCR 过程中，Mg2+能激活耐高
温的DNA 聚合酶，因此在PCR 过程中缓冲液中需要包含镁离子。以一个单链DNA 为起点，第一次循环需
要1 个引物Ⅱ，第2 次需要2 个，第3 次需要4 个，以此类推，进行n 次循环的扩增，理论上需要2n-1 个
引物Ⅱ；PCR 是体外扩增DNA 的技术，一般可以分为变性（高温解旋）、复性（降温结合引物）、延伸
（降温合成子链）三步。
（5）SUC2 是酵母菌的蔗糖转化酶基因，SUC2 作为B 上的标记基因，培养基需以蔗糖为唯一碳源，受体
突变型酵母菌需要不含SUC2 基因或者SUC2 基因被敲除，这样才能实现对成功导入目的基因的受体细胞
进行筛选。
（6）上述疫苗是基因工程疫苗，是蛋白质（S 蛋白），不含新冠病毒的核酸，不会在人体内增殖，仅注射
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病毒的部分蛋白进入人体，比普通灭活或减活疫苗更安全。
10．α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β 和γ 环糊精的混合物，
分离纯化十分不便。cgt 在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt 的372 位天冬氨酸和89 位酪氨酸是
酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt 催化
特异性提高了27 倍。请回答下列问题。
(1)蛋白质工程的第一步通常是确定预期的 。重叠PCR 是常用的DNA 定点突变技术，其原理如图所
示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR 不需要用到 酶。要完成两处位点的突变，至少要设计 种
引物。
(2)下图是该酶编码链的部分序列，请你设计替换372 位天冬氨酸（密码子：GAU、GAC）到赖氨酸（密码
子：AAA、AAG）的引物FP2 和RP1 中三个连续碱基，分别为 、 。
(3)用大肠杆菌大量生产重组cgt 需要解决酶的分泌问题。重组cgt 位于双突变载体（简称Ｔ载体）上，研究
人员将重组cgt 基因与pET-20b（+）载体（简称p 载体）上的pelB 信号肽序列连接，构成重组载体cgt-p，
该过程如图所示。应选用 、 对T 载体酶切处理，用 、 对p 载体进行酶切处理，并用
酶构建重组载体cgt-p，导入目的工程菌。培养基中除基本营养外，还需加入 完成筛选。
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【答案】(1) 蛋白质功能 解旋 6
(2) AAA TTT
(3) XmaI BamHI XmaI BclI DNA 连接 氨苄青霉素
【分析】1、PCR 扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
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（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）蛋白质工程的基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列
→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。因此蛋白质工程
的第一步通常是确定预期的蛋白质功能。
与细胞内的DNA 复制相比，PCR 技术用的原理是DNA 的体外复制，其中双链分开靠的是加热，不需要解
旋酶。要完成两处位点的突变，由图可知，完成一处突变需要两种通用引物和两种突变引物，如果要完成
两种突变，则需要两种通用引物，和四种突变引物，至少要设计6 种引物。
（2）将372 位天冬氨酸（GAC）替换为赖氨酸（AAA、AAG），为了改变最少的碱基序列，可将天冬氨
酸（GAC）替换为赖氨酸（AAA），赖氨酸的密码子为AAA，目的基因的碱基序列为TTT，根据碱基互
补配对原则，引物FP2 三个连续碱基为AAA，引物RP1 三个连续碱基为TTT。
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（3）为了不破坏重组cgt 的完整性，应选用XmaI、BamHI 对T 载体酶切处理。由重组载体cgt-p 上的顺序
可知，需要保持pelB 的完整性，所以只能选用BclI 切一端，（XmaI、SmaI 的识别序列相同），由图可知，
为了保证重组cgt 的反向连接，用XmaI、BclI 对p 载体进行酶切处理，并用DNA 连接酶构建重组载体cgt-
p，导入目的工程菌。重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（标记基因），因此，培养基中除基本营养外，
还需加入氨苄青霉素完成筛选。
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