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专题05 基因工程
基因工程的流程和应用是高考的必考点，且常考常新，预计2024 年高考也不例外，依然会对其进行考查，
有可能与新的科研实事结合，综合考查基因工程的流程和应用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细胞
工程、胚胎工程等综合起来考查
1、（2023·广东·高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变
筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替换，
突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶将
两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养
1
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基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的
T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
涂黑 。
2、（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某
些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为
原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR 技术，在优化反应
条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合
成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
，终止子的作用是 。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
2
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，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济特点。从“碳中和”
的角度看，该技术的优势在于 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
3、（2021·广东·高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获
得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4 步酶促反应的非细胞合
成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严
重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有
。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋
白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4 种酶的表达。表达载体
转化大肠杆菌时，首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的
方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是 。在分子水平上，可以通过改变 ，
从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
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1．转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗
虫基因（crylC）和双T-DNA 载体连接（图示连接后双T-DNA 部分结构），利用其中的“Cre/LoxP”系统培
育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两个
同向的loxP 序列并将两个loxP 间的序列删除。
图：P—启动子（P1 为胚乳特异表达启动子；P2 为绿色组织特异性表达启动子）
回答下列问题：
(1)Cre 酶与基因工程中的 （工具酶）作用类似。
(2)载体中，T-DNA 的作用是转移到被侵染的细胞后 ，hpt 基因（潮霉素抗性基因）和
gus 基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA 共转化植株的筛选，起到基因表达载体中
（填结构）的作用。
(3)筛选得到双T-DNA 共转化成功的植株T0中，hpt 基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。
先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-1、GH-2 和GH-3，自交后得到
T1代植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus 基因进行PCR 检测，产物的电泳结
果如下图a。（不考虑减数分裂时发生互换）
①T0代中 （填编号）是T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。
②在答题卡对应的图b 中画出植株GH-2 的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置 （注：用圆点·表示
T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置）
③GH-1 的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt 基因的植株的比例为 。这些植株自
交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。
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(4)水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了 ，培育
了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片 （填“具有”或“不具有”）抗虫的性状。
2．利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内
定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），诱导机体产生免疫反应。
科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD 和3RBD，探究RBD 的二聚体蛋
白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD 的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1 所示，
Nco I 和Sac I 是pNZ8149 质粒上的限制酶识别位点，U-M 为信号肽-细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题：
(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加 ，并在
（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR 技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的
5'端应分别添加 序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1 为双酶切pNZ8149-
2RBD，泳道2 为双酶切pNZ8149-3RBD。泳道1 两个条带大小分别为2507bp 和2020bp，由此可知，融合
基因3RBD 的长度为 bp，泳道2 呈现一个条带的原因是 。
(4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，
pNZ8149-2RBD 菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD 菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明 。
3．植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植
物中。
资料一：放线菌也是一种常见的内生菌，能抑制病原菌的生长。研究者利用两种不同类型的放线菌获得新
型工程菌，过程如图：
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(1)收集上述两种菌丝体，加入 (填“纤维素酶”或“溶菌酶”)处理，分离原生质体，将两种原生
质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。终止反应并洗涤后，取一定量混合液接种于
(填“固体”或“液体”)培养基中培养，根据菌落特征，选出性状稳定的融合菌株。
资料二：某真菌的w 基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中w 基因转录方向是从左往右。为使
放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因操作。
限制酶
BamH I
EcoR I
Mfe I
Kpn I
HindⅢ
识别序列和切割位点( 5-3’ )
G↓GATTC
G↓AATTC
C↓AATTG
GGTAC↓C
A↓AGCTT
(2)根据图表分析，在构建基因表达载体时，应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶
切割图中含w 基因的DNA 片段，以获得能正确表达w 基因的重组质粒。
(3)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入w 基因，其
上游启动子应选择 启动子(选填“真菌”或“放线菌”)。
4．中药红花中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）因在植物发育中对植物次生代谢产物的调控和对环境刺激的响应
而被广泛研究。研究人员从红花盛花期花瓣中提取了总RNA，通过转基因实现了PAL 基因（2124bp）在
红花悬浮细胞中的超表达（具体过程见下图），为研究PAL 基因在红花次生代谢产物代谢途径中的功能和
对环境刺激的响应奠定了基础。请回答下列问题：
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(1)次生代谢产物一般 （填“是”或“不是”）植物基本生命活动所必需的。从红花盛花期花瓣
中提取总RNA 的理由是 。
(2)RT-PCR 是将mRNA 逆转录和cDNA 的聚合酶链式反应相结合的技术。若要在该体系中通过①从总RNA
中扩增出PAL 基因的cDNA，应加入 的2 种引物。
(3)构建质粒2 时，需要利用限制酶BglⅡ和BstEⅡ对图中PAL 基因和质粒1 进行双酶切；验证质粒2 是否
构建成功时，若用上述双酶切质粒后电泳得到两种条带， （填“能”或“不能”）说明质粒2
构建成功，请说明理由： 。
(4)GUS 基因的表达产物能催化X-Gluc（一种无色物质）分解为蓝色物质，实验农杆菌和红花细胞中均无
该基因。加工质粒1 时，引入GUS 基因可以起到 的作用；选择悬浮细胞而不是愈伤组织作为
PAL 的生物反应器的原因是 。
5．瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P 载体含有的绿色荧光蛋白（GFP）基因能在真核细胞
中表达GFP。将目的基因插入GFP 基因后，能表达出目的蛋白和GFP 的融合蛋白，根据荧光的强弱，可
确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素
基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P 载体的结构如图所示。
回答下列问题。
(1)PCR 扩增瘦素基因时，与引物1 互补的a 链左侧是脱氧核苷酸链的 （填“5′”或“3′”）端。
据图推测，构建该基因表达载体时，P 载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、 。
(2)已知HindⅢ和BamHI 在P 载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindⅢ、
BamHI 分别对瘦素基因PCR 产物、P 载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构
建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。
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(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。
同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是 。本实验中为筛选转化的细胞，
应在培养基中添加 。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是 （答出2 种）。为进一步获得更多能表
达融合蛋白的细胞，还需要进行 。
6．融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与其他蛋白融合而产生的新
型蛋白，常用于亲和蛋白质纯化和抗体药物的研发。图是原核细胞融合蛋白基因表达载体，科研工作者在
启动子Pc 下游插入了两个与分离纯化有关的编码序列——谷胱甘肽转移酶基因（GST 基因）及凝血蛋白
酶切割位点的编码序列。
回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，需要用到的工具有 。上述融合表达载体中启动子Ptac 的作用是
。
(2)当外源基因插入后，可表达出由 （填“二”或“三”）部分序列组成的融合蛋白。
(3)GST 对谷胱甘肽有很强的结合能力。将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白
的全细胞提取物通过层析柱时， 将吸附在树脂内，其他细胞蛋白先被洗脱出来。接着用含游离
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的还原型谷胱甘肽的缓冲液将融合蛋白洗脱。最后用 切割融合蛋白，即可获得纯化的目的蛋白。
(4)Fc 融合蛋白由某种具有生物学活性的功能蛋白分子与抗体恒定区的Fc 片段融合而成。该类融合蛋白不
仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体的性质，如长效半衰期。抗原在血浆中游离时
间越久，越容易被蛋白酶降解。
①利用哺乳动物细胞表达Fc 融合蛋白比在原核细胞中表达更具优势的理由是 。
②目前疫苗设计的关键在于有效活化抗原呈递细胞（APC），APC 表面能够表达Fc 受体，常利用抗原—
Fc 融合蛋白作为抗原运载工具，其原因是 。
7．番茄在种植过程中容易发生虫害。研究人员将双价抗虫载体转入番茄中，获得具有抗虫特性的转基因
番茄。图为所用载体的部分结构示意图，其中Bar 为除草剂抗性基因，Cry1Ac 为苏云金杆菌毒蛋白基因，
Pta 为半夏凝集素基因。
回答下列问题：
(1)双价抗虫载体中的P1、P2和P3是属于基因表达载体中的 ，其作用是 。
(2)构建的载体通常用 法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，并在培养基中添加 用
于筛选转基因番茄。
(3)为验证Pta 基因是否转入番茄基因组中，研究人员使用 技术筛选转基因番茄中的Pta 基因，再进
行凝胶电泳鉴定，结果如图所示。
图中①为阳性对照，②为阴性对照，③为待测植株，试分析③中出现2 条条带的可能原因是 。
(4)对于成功转化的番茄植株还需进一步进行抗虫鉴定，研究人员选取3 株阳性转基因番茄进行小菜蛾幼虫
抗性实验，结果如下表。
株系编号
CK
1
2
3
幼虫致死率（%）
0
39.8
6.5
48.9
注：CK 表示对照
由表中可知，株系2 的幼虫致死率较低，推测其可能原因是 。
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8．I 结球甘蓝（雌雄同株）又称卷心菜，是老百姓菜篮子里四季常见、质优价廉的蔬菜。开展与之有关的
遗传与育种研究，具有十分重要的意义。请回答下列问题结球甘蓝的叶色有紫色和绿色两种，由两对独立
遗传的等位基因（D/d 和E/e）控制。现将两种纯合的紫色叶结球甘蓝分别与绿色叶结球甘蓝杂交，并设为
甲、乙两组；两组F1叶色均为紫色，将两组F1分别自交，甲组所得F2中紫色叶植株与绿色叶植株的比例
为15∶1，乙组所得F2中紫色叶植株与绿色叶植株的比例为3∶1.由题意可知，甲组F2紫色叶植株中杂合
子基因型的种类有 种；乙组亲本紫色叶植株的基因型为 ；若让乙组F2紫色叶植株自由交配，
所得子代表现型及比例为 。
II.研究发现，P5CS 基因能促进脯氨酸的大量合成进而提高植物耐盐碱能力。某研究小组利用基因工程等技
术将从野生茄子中获得的P5CS 基因（简称StP5CS 基因）导入到结球甘蓝细胞中，培育出了耐盐碱的结球
甘蓝转基因新品种（实验流程图如图所示）。
①根据上图可知，Bar 基因的作用是 ；若Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ为5 种限制酶及其酶切位点，为使
StP5CS 基因最终能正确表达，过程①应选用 （填符号）进行酶切；耐盐碱的结球甘蓝转基因植株细
胞是以StP5CS 基因的 （选填“a 链”或“b 链”）为模板进行转录，并最终使植株表现出耐盐碱性
状。
②根据题意，请写出一种检测或鉴定所得植株为转基因耐盐碱结球甘蓝的方法 。
9．健康的生活方式、乐观的心态和定期体检是预防癌症的主要手段。（CAR-T 细胞疗法是治疗血液恶性
肿瘤及淋巴瘤的研究热点，我国首款新型肿瘤治疗方法——CAR-T 产品于2021 年上市。左图为CAR-T 细
胞疗法的原理示意图，该疗法借助基因工程和细胞工程技术，根据CAR 蛋白（右图）是多种肿瘤的嵌合
抗原受体的特点而设计。
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回答下列问题：
(1)机体肿瘤的发生主要与免疫系统的 功能降低有关。
(2)图中过程①称为 ，这是基因工程的核心步骤，需要用到的工具酶有 。过程②最常用的方法
是 。CAR-T 细胞输入患者体内后，其活化需要两个信号的刺激，具体是 。
(3)据图可知，CAR-T 细胞疗法相对传统的药物化疗和放疗而言，具有 （请写出两点）的突出优点。
(4)CAR-T 细胞在治疗肺癌、肝癌、乳腺癌等实体瘤的总体效果上还不尽如人意，请根据右图并结合特异性
免疫的原理，提出一种CAR 蛋白改造的简单思路，以提升CAR-T 细胞对实体瘤的疗效： 。
10．人乳铁蛋白（hLTF）是一种铁结合的糖蛋白，具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因
技术培育能生产hLTF 的奶牛，从牛奶中分离提纯hLTF。回答下列问题。
(1)从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真
核细胞中表达，主要原因是 。
(2)研究人员采用小鼠乳清酸蛋白基因的启动子和终止子来替换pA 质粒中的部分序列，再拼接hLTF 基因，
最终形成pW2-hLTF 重组质粒，过程如下图：
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通过PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子、终止子和hLTF 基因时，均需引入限制酶的识别序列和切割
位点，以便剪接到质粒的指定位置。据图分析，PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应
分别包含 、 （限制酶）的识别序列。将修饰后的hLTF 基因插入到重组质粒的启动子和终止子之间
后，不一定能获得所需要的基因表达载体，原因是 。
(3)经检测筛选所获得的基因表达载体pW2-hLTF 通过 的方法导入到奶牛的受精卵细胞中，以获得能产
生hLTF 的转基因奶牛。
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