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专题05 基因工程
近几年高考题通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，
PCR 技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大：其中启
动子的插入位点和插入方向等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解
决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。预测2024 年难度系数
也会非常大，不排除出现细胞工程的可能。
1、（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果
酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1
为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
1
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(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂
质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
【答案】(1)溶解度
(2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME 基
因”）
(3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME 基因序列整合
到硅藻细胞基因组中”）
(4) 增加 细胞数量
(5)有氧呼吸生成的ATP 增多
(6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生
产”）
【分析】1、PCR 的含义：PCR 是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在生物
体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、PCR 原理：DNA 半保留复制。
3、PCR 基本条件：DNA 模板、4 种脱氧核苷三磷酸、2 种引物、耐高温的DNA 聚合酶、缓冲液。
【详解】（1）DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA 和蛋白质。
因此，根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到
的粗提DNA 可以作为PCR 扩增目的基因的模板。
（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有
特殊序列结构的DNA 片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果
酸酶（ME）基因。
2
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（3）PCR 是一项根据DNA 半保留复制原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的
基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链
核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA 作为
PCR 模板，而在实验组中以转ME 基因的硅藻细胞基因组DNA 作为模板。如此比较两个实验扩增结果可
以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME 基因序列是否整合到硅藻细胞基
因组中。
（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3 分析
可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B 的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定
硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A 与B 的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高
产生物柴油的优良硅藻细胞品系。
（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B 线
粒体中ME 含量显著高于品系A。据此分析可知，ME 基因的超表达导致线粒体中的NADH 水平升高，
NADH 进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。
（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、
不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
2、（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀
粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问
题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
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(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
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（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA 为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
3、（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为抗原来
制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原
代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
【答案】(1) 不需要
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使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免
疫的B 淋巴细胞；诱导B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛
选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培
养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物
质PEG 可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融
合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈
阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA 连接酶能连接DNA 片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH 位于3'端，①②③脱氧核苷酸
链的两端基团有误；DNA 连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱
氧核苷酸链的3'端的-OH 相连，④符合题意。
故选④。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．TAT 基因可以表达出一种转录激活因子，并能有效引导蛋白质穿透细胞膜。绿色荧光蛋白基因
（EGFP）是一种报告基因。研究人员通过构建TAT 基因与EGFP 的融合表达载体，在大肠杆菌内表达得到
纯化的TAT—EGFP 融合蛋白。将人工合成编码TAT 蛋白的DNA 片段插入载体pET28a 得到pET28a—TAT
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重组质粒，再利用引物对EGFP 进行PCR，并利用限制酶EcoRI 和XhoⅠ连接得到pET28a—TAT—EGFP 重
组质粒，操作流程如图所示。回答下列问题：
(1)图中TAT 基因结构中，每个磷酸基团直接连着 个脱氧核糖。构建pET28a—TAT 重组质粒使用
两种限制酶切割目的基因和PET28a 质粒的优点是 、 。
(2)PCR 扩增EGFP 基因的过程中，引物Ⅰ与引物Ⅱ的序列不能太短，且两者间不能 ，两种引
物的5'端必须分别添加 序列，以保证正确连接形成pET28a—TAT—EGFP 重组质粒。
(3)将上述重组质粒转化到大肠杆菌E·coliBL21 时，需先用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，目的是
。筛选转化成功的E·coliBL21 时，需要在LB 平板上添加 ，并运用平板划线法进行分离。
(4)将稳定的高表达菌株扩大培养后，再研究测定其融合蛋白表达的情况。利用超声波法裂解大肠杆菌，将
提取的全菌蛋白在100g/L 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，发现加入IPTG 组与未加入IPTG 组相比较，
泳带有明显的差异，如图所示：
注：1：未加入IPTG；2：37℃时0.2mmol/LIPTG 诱导1h；3～5：37℃时0.5mmol/LIPTG 分别诱导1h、
2h、3h
①电泳是指 。
②根据泳带结果可得出的结论是：IPTG 能够 ，在 的实验条件下作用
效果最佳。
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(5)研究人员将TAT 和EGFP 融合在一起研究，目的除了用于筛选成功导入TAT 基因的受体细胞外，还可用
于 （举一例）等。
【答案】(1) 1 或2 防止质粒和 TAT 基因的反向连接 防止质粒和TAT 基因的自身环化
(2) 进行碱基互补配对 限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ识别的核苷酸
(3) 使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 卡那霉素
(4) 在电场的作用下，带电（的蛋白质）分子会向着与其所带电荷相反的电极移动的过程 促进融
合蛋白（TAT—EGFP）的表达 37℃、0.5mmol/LIPTG 诱导3h
(5)追踪转录激活因子的位置，及其引导蛋白质穿透细胞膜的过程
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】（1）图中TAT 基因为双链结构，除了5'端一个游离的磷酸基团与1 个脱氧核糖相连外，其他每一
个磷酸基团都连接2 个脱氧核糖。双酶切目的基因和质粒，可产生不同的黏性末端，防止目的基因和质粒
反向连接及目的基因、质粒自身环化。
（2）PCR 中使用的两种引物的碱基之间不能互补配对，否则引物不能与模板DNA 链结合，导致不能合成
目的基因。根据题意，是利用限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ连接获得pET28a—TAT—EGFP 重组质粒的，所以在两
种引物的5'端必须添加限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ识别的核苷酸序列。
（3）为使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，提高转化效率，在将重组质粒导入
大肠杆菌之前，需先用一定浓度的Ca²⁺溶液处理大肠杆菌。重组质粒含有卡那霉素抗性基因，抗性基因作
为特殊的标记基因，有利于重组DNA 分子的筛选。成功导入重组质粒的大肠杆菌，能表达抗卡那霉素的
产物，故能在含卡那霉素的培养基中存活。
（4）①电泳是指在电场的作用下，带电（的蛋白质）分子会向着与其所带电荷相反的电极移动的过程。
②由电泳图可知加入IPTG 组菌株蛋白中含有TAT—EGFP 融合蛋白的电泳条带，且在37℃、0.5mmol/
LIPTG 诱导3h 时电泳条带最宽，由此说明IPTG 能够促进融合蛋白（TAT-EGFP）的表达，且在37℃、
0.5mmol/LIPTG 诱导3h 的实验条件下表达量最高。
（5）该研究除了用于筛选成功导入TAT 基因的受体细胞外，还可用于追踪转录激活因子的位置，及其引
导蛋白质穿透细胞膜的过程等。
2．将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖
转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG 基因敲
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除质粒构建过程如图1 所示，其中KanR 是抗生素抗性基因，SacB 是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖
积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI 的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回
答下列问题：
(1)图1 中利用PCR 获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增 轮。从引物角度分析，扩增得到
上、下同源臂能拼接到一起的关键是 。ptsG 基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI 和EcoRI 双酶
切的优点是 。
(2)将敲除ptsG 基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、
含10%蔗糖培养基， （填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上
生长的为目的菌。
(3)将筛选得到的敲除ptsG 基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG 基因（如
图2）。
①两次同源重组共有 个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定
的引物进行PCR，通常将扩增产物利用 方法鉴定。
②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG 基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别
培养在以葡萄糖为唯一碳源的 培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌 。
【答案】(1) 2/二/两 引物2 和引物3 的5'端具有配对序列(引物2 和引物3 配对序列也可得分)
避免质粒或目的基因的自我拼接、避免目的基因倒接
(2)仅能在含卡那霉素
(3) 8/八 琼脂糖凝胶电泳 选择 低
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【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）第一轮扩增出来的DNA 双链不等长，再经第二轮的扩增才能得到上同源臂或下同源臂区段，
所以至少需要扩增2 轮；从引物角度分析，扩增得到上、下同源臂拼接到一起的关键是引物2 和引物3 的
5'端有配对序列，这样热变性后再复性时上同源区段和下同源区段有互补序列可以通过氢键连接，从而拼
接到一起；ptsG 基因敲除质粒构建选用XhoI 和EcoRI 进行双酶切的优点是由于两种酶切后的黏性末端不
同，从而可以避免质粒或目的基因的自我拼接、避免目的基因倒接。
（2）敲除G 基因质粒进行扩增并导入工程菌中，由于质粒上带有KanR 抗生素抗性基因，因此能在含卡那
霉素培养基上生长，具有SacB 基因，能将蔗糖转变为果聚糖，果聚糖积累对细菌有毒害，所以不能在含
有蔗糖的培养基上生长。
（3）①由图2 可知，每一次同源重组，都涉及DNA 分子双链断开与拼接，因此每一次都有4 个磷酸二酯
键的断裂(合成)，两次同源重组共8 个磷酸二酯键的断裂(合成)；敲除pstG 基因后的同源重组片段与原基
因片段的碱基数量不同，可以用琼脂糖凝胶电泳加以区分。
②将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的选择培养基上，从而起到筛选作用；
ptsG 基因为葡萄糖转运系统关键酶基因，因此敲除后该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌低。
3．毒物诱导型启动子S 在毒物诱导下可启动转录。研究人员将PCR 扩增得到的毒物诱导型启
动子S（如图2，图中箭头表示转录方向）插入图1 载体的P 区，构建表达载体并转入大肠杆菌，获得能够
检测水中毒物的大肠杆菌M。回答下列问题：
(1)基因中启动子是 识别和结合的部位。
(2)切割质粒载体最好用两种限制酶，而启动子S 上不含有这些限制酶的酶切位点，需要在引物上添加。图
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2 中引物I、Ⅱ分别加入限制酶 的识别序列。
(3)表达载体的P 区有一段核苷酸序列为“5'-ATCTCGAGCGGG—3'”，则对该序列进行剪切的XhoI（酶切
后产生黏性末端）识别的核苷酸序列（6 个核苷酸）最可能为 。
(4)用 处理大肠杆菌，便于转入构建好的表达载体。可以使用添加 的培养基筛
选转入载体的菌株。
(5)请写出利用大肠杆菌M 检测水体是否被毒物污染的实验思路，并预期实验结果及结论。
实验思路： 。
预期实验结果及结论： 。
【答案】(1)RNA 聚合酶
(2)BamH I、Xho I
(3)5'一CTCGAG—3'(或3'—GAGCTC 一5')
(4) Ca2+ 氨苄青霉素
(5) 将大肠杆菌M 加入待测水体,检测待测水体是否发出绿色荧光 若待测水体未发出绿色荧光,说
明待测水体未被毒物污染；若待测水体发出绿色荧光,说明待测水体被毒物污染
【分析】PCR 技术：(1)概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成
技术。(2)原理：DNA 双链复制。(3)前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。(4)
条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、ATP、一对引物、耐高温的DNA 聚合酶。(5)过程：高温变性：DNA
解旋过程(PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温复性：引物结合到
互补链DNA 上；中温延伸：合成子链。
【详解】（1）基因中启动子的作用是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录。
（2）将所需的启动子插入质粒的P 区，P 区有Xho I、EcoR I、Sma I 和BamH I 四种限制酶，由于启动子S
内部有EcoRⅠ和 SmaI 的切割位点，故不能选择EcoR Ⅰ和SmaⅠ，为使启动子正确插入到质粒上，需使用双
酶切的方法，故选用Xho I、BamH I 两种限制酶。根据启动子到终止子的方向，则引物Ⅰ上添加BamH Ⅰ
限制酶的识别序列，引物Ⅱ上添加 Xho Ⅰ限制酶的识别序列。
（3）限制酶切割DNA 产生黏性末端,需两条链都有识别位点(即识别片段两条链序列成倒序),故推测该序列
进行剪切的Xho Ⅰ识别的核苷酸序列(6 个核苷酸)最可能为5'一CTCGAG—3'或3'一GAGCTC 一5'。
（4）用Ca2+处理农杆菌,可使其成为感受态细胞,以便吸收周围环境中的DNA 分子。氨苄青霉素抗性基因
为标记基因,可使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入载体的菌株。
（5）毒物能诱导毒物诱导型启动子S 表达，若大肠杆菌M 质粒中的毒物诱导型启动子S 表达，可使大肠
杆菌M 的绿色荧光蛋白基因表达产生绿色荧光蛋白而发出绿色荧光,将大肠杆菌M 加入待测水体，检测加
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入待测水体是否发出绿色荧光来检测水体是否被毒物污染。预期实验结果及结论：若待测水体未发出绿色
荧光,说明待测水体未被毒物污染;若待测水体发出绿色荧光,说明待测水体被毒物污染。
4．干扰素是抗病毒的特效药，科学家利用基因工程和细胞工程技术制得了重组干扰素。请回答下列问题：
(1)获取干扰素基因的途径之一是：提取总RNA，利用 酶合成总cDNA，然后以cDNA 为模板，
采用PCR 技术扩增干扰素基因，已知干扰素基因一条链两端的序列为5'—AAGGGCGG—干扰素基因—GG
—GAAACT—3'，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是 （填字母）。若某一双链
cDNA 在PCR 仪中进行了4 次循环，需要消耗 个引物。
A．引物I 是5'—AAGGGCGG—3'，引物Ⅱ是5'—GGGAAACT—3'
B．引物I 是5'—AAGGGCGG—3'，引物Ⅱ是5'—AGTTTCCC—3'
C．引物I 是5'—CCGCCCTT—3'，引物Ⅱ是5'—GGGAAACT—3'
D．引物I 是5'—CCGCCCTT—3'，引物Ⅱ是5'—AGTTTCCC—3'
(2)图甲为获取的含有干扰素基因的DNA 片段，中间一段为干扰素基因。Sau3AI、EcoRI、BamHI 为三种
限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土
壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti 质粒结构示意图。
为保证目的基因和质粒正确连接，切割含有目的基因的DNA 片段和质粒经常都会用到两种限制酶，在该
实验中，切割含有目的基因DNA 片段的两种限制酶和切割质粒的两种限制酶是否完全相同?
（填“是”或“否”），原因是 。
(3)若要在水稻胚乳细胞中提取重组干扰素，需要用到植物组织培养技术，该技术的原理是 ；若
要利用乳腺生物反应器来生产重组干扰素，则应将构建的基因表达载体导入 中。
【答案】(1) 逆转录 B 30
(2) 否 ①切割质粒只能用EcoRI 和Sau3AI 两种限制酶，但由于Sau3AI 会破坏（切割）目的基因，
所以切割含有目的基因的DNA 片段不能用Sau3AI；②由于BamHI 与Sau3AI 切出的黏性末端相同且
BamHI 和EcoRI 切割含有目的基因的DNA 片段后可得到与质粒两端黏性末端相同的目的基因，故应该用
EcoRI 和BamHI 切割含有目的基因的DNA 片段
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(3) 植物细胞的全能性 哺乳动物的受精卵
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微
注射法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插
入目的基因：PCR 技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：PCR 技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质：抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1） 合成总cDNA 需提取细胞中所有的mRNA，在逆转录酶的作用下通过逆转录过程获得。采
用PCR 技术扩增干扰素基因（5'AAGGGCGG-干扰素基因-GGGAAACT3'）时，PCR 中需要一对特异性的
引物，该引物能与目的基因3'端的碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5'向3'端延伸，所以符合条件的
引物I 是5'-AAGGGCGG—3'，引物Ⅱ是5'-AGTTTCCC-3'，故选B。一条双链cDNA 在PCR 仪中进行4 次
循环，共产生24=16 个DNA 分子，所以共有25=32 条链，其中30 条链是新合成的，需要引物，所以需要
32-2=30 个引物。
（2） 图丙中有EcoRI 和Sau3AI 两种限制酶，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应该选择
Sau3AⅠ、EcoRⅠ切割质粒。结合图甲和图丙分析，Sau3AⅠ会破坏目的基因，应该选择EcoRⅠ和BamHⅠ切割
图1 所示DNA 片段。图乙中Sau3AⅠ和BamHⅠ的黏性末端相同，故采用BamHⅠ、EcoRⅠ充分切割目的基因，
可得到与质粒两端黏性末端相同的目的基因，结合以上分析可知切割含有目的基因DNA 片段的两种限制
酶和切割质粒的两种限制酶不完全相同。
（3） 植物组织培养技术的原理是植物细胞具有全能性，植物组织培养包括脱分化和再分化两个过程；构
建基因表达载体时，要将改造后的干扰素基因与哺乳动物的乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，目的是
让干扰素基因只在哺乳动物的乳腺细胞中表达，然后将基因表达载体导入哺乳动物的受精卵中。
5．筛选出能与SARS 病毒的S 蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S 蛋白末端添加TAP 标签（能特
异性地与人和哺乳动物体内IgG 类抗体结合），再利用该标签在病毒敏感细胞（如非洲绿猴肾细胞）中快
速纯化出S 蛋白及其相互作用的蛋白质，具体过程如下图。其中XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI 表示限制酶，
PCMV、T7 表示启动子，Kozak 序列是翻译起始因子结合位点的编码序列，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，
ori 表示复制原点。请回答问题：
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(1)为成功构建重组质粒pcDNA3.1-S-TAP，在利用PCR 扩增S 基因时，应在S 基因的5'端引入 序列，
3'端删除 的编码序列。
(2)将S 基因和TAP 序列的扩增产物进行 鉴定，结果显示两个片段均得到扩增且与预期值大小相一
致。再经测序证实正确后，将这两个片段经限制酶切割并通过 酶连接定向克隆入质粒pcDNA3.1.
(3)重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 转染细胞前，需将vero 细胞置于37℃、 （填气体条件）下培养
18~24h 进行传代。将传代的细胞与重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 以适宜比例混合，在转染试剂的作用下转染
细胞（实验组），为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。将转染24h 的细胞置于
载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血清稀释液和荧光素标记的羊抗人IgG 抗体稀释液，荧光显微镜下观察，
若 ，则说明S-TAP 融合蛋白在vero 细胞中得以表达。
(4)通过上述检测发现，S-TAP 融合蛋白表达量较低，其原因可能有 （填序号）。
①重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 在vero 细胞中大量复制
②S-TAP 融合基因在vero 细胞中转录出的mRNA 量较少
③S 基因与病毒宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA 的tRNA 数量不足
【答案】(1) Kozak 序列和SmaⅠ识别序列 终止密码子编码序列
(2) 琼脂糖凝胶电泳 DNA 连接
(3) 95%空气+5%CO2 使用PCDNA3.1 空载体转染细胞，其余操作相同 出现荧光标记
(4)②③
【分析】构建基因表达载体：用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生
相同末端的限制酶切割目的基因的DNA 片段；再利用DNA 连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
【详解】（1）Kozak 序列是翻译起始因子结合位点的编码序列，根据构建的重组质粒图示可分析，在S 基
因的上游加入了Kozak 序列；为了使目的基因和质粒连接，根据启动子的方向、质粒上的酶切位点可知，
上游不能用XhoI，故应在S 基因的上游加入Smal 识别序列；因为S 基因和TAP 序列需要同步表达才能利
用TAP 作为S 蛋白的标签，二者共用一个启动子，故应去除S 基因下游的终止密码子编码序列。
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（2）将S 基因和TAP 序列的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示两个片段均得到扩增且与预期
值大小相一致。DNA 连接酶可将限制酶切割后形成的末端连接。
（3）细胞培养的气体条件是95%的空气和5%的CO2。对照组是为了排除空质粒的影响，故应使用
PCDNA3.1 空载体转染细胞，其余操作相同。将转染24h 的细胞置于载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血
清稀释液和荧光素标记的羊抗人IgG 抗体稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明S-TAP 融
合蛋白在vero 细胞中得以表达，荧光素标记的羊抗人IgG 抗体才能够与TAP 标签结合发出荧光。
（4）蛋白质表达要经过转录和翻译两个过程，①重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 在vero 细胞中大量复制，与
蛋白表达量较低无关，①错误；②S-TAP 融合基因在vero 细胞中转录出的mRNA 量较少，模板少，影响
翻译出的蛋白质含量，②正确；③tRNA 在翻译过程中起到转运氨基酸的作用，tRNA 数量不足影响翻译的
进行，③正确，故选②③。
6．抗菌肽是一类具有广谱抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,细菌不易对其产生耐药性且无残留等,被认为
是理想的抗生素替代品。为了突破抗菌肽在畜禽养殖业广泛应用的瓶颈，我国研究人员运用小分子泛素蛋
白（SUMO）融合技术将含有重组抗菌肽LLv 基因的质粒导入大肠杆菌，表达融合蛋白SUMO-LLv,并优化
了表达条件,从而能高效获得重组抗菌肽 LLv。所用质粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)、LacZ 基因及
SacⅠ、XhoⅠ酶切位点等，其结构和构建重组质粒的过程如图1 所示。据此分析回答以下问题：
注：LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
(1)扩增LLv 基因时，PCR 反应体系中含有的酶有 ；已知该基因序列不含图1 中限制酶的识
别序列，为了使其能与已被酶切的质粒连接，需根据 设计引物。
(2)LLv 基因以a 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'。该基因内部没有SacⅠ、XhoⅠ这
两种酶切位点。图1 中酶切位点1 和2 所对应的酶分别是 。
(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，需用CaCl2处理大肠杆菌，其目的是 。
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(4)为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal 等成分的培养基中进
行接种，结果如图2，该同学采用的接种方法是 。图2 中出现的 菌落即成功导入重组
质粒的大肠杆菌菌落，判断的理由是 。
【答案】(1) 耐高温的 DNA 聚合酶 LLv 基因两端的部分核苷酸序列和 Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ的识别序
列
(2)Xho Ⅰ、Sac Ⅰ（二者顺序不可调换）
(3)使大肠杆菌变为感受态细胞，便于从周围环境吸收 DNA 分子
(4) 稀释涂布平板法 白色 目的基因（或 LLv 基因）的插入破坏了 LacZ 基因的结构，使
其不能正常表达形成β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不会被分解
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 技术的基本原理是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于TaqDNA
聚合酶的酶促合成反应，即扩增LLv 基因时，PCR 反应体系中含有的酶有耐高温的 DNA 聚合酶。PCR 过
程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。目的基因需要与质粒进行连接，
但已知LLv 基因序列不含图1 中限制酶（ Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ）的识别序列，为了使LLv 基因能与已被酶切的
质粒连接，需要根据LLv 基因两端的部分核苷酸序列和 Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ的识别序列设计引物。
（2）LLv 基因以a 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'，DNA 模板被转录方向是从
3→5′，即图1 中酶切位点1 对应的酶为Xho Ⅰ，酶切位点2 对应的酶为Sac Ⅰ。
（3）将目的基因导入微生物细胞，常用Ca2+处理微生物，使微生物细胞处于感受态，便于从外界环境吸
收DNA 分子。
（4）分析菌落分布可知，采用的接种方法是稀释涂布平板法。为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选
出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal 等成分的培养基中进行接种，目的基因（ LLv 基因）的插入破坏
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了 LacZ 基因的结构，使其不能正常表达形成β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不会被分解，使菌落为白色，因
此图2 中出现的白色菌落即成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落。
7．遗传学技术在突变检出领域中有着重要的贡献与作用。
(1)Muller-5 技术常用于果蝇X 染色体上突变的检出，已知果蝇棒眼对圆眼为显性，红眼对杏色眼为显性，
且控制这两对相对性状的基因皆位于X 染色体上。下图为利用Muller-5 品系雌果蝇检测基因突变的过程图。
不考虑交叉互换。
为检测出果蝇X 染色体上是否发生了突变，F1代需进行 （填“自由交配”“自交”或“单对交
配”）获得F2代。现有某纯合致死突变基因被检出，则在F2代中，最好选取性状为 果蝇进一步研究
该突变基因的作用。
(2)PCR 扩增法可用于基因点突变的检出，其基本原理是，如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用耐
热DNA 聚合酶无法延伸。已知某变异果蝇品种在Badh2 基因的EXON7 区出现了一个8bp 的碱基对缺失和
三个位置的碱基替换（其他序列与野生型一致），为了检测该变异，现设计以下四条引物进行PCR（如图
所示）。
除了题干中提到的引物、耐热DNA 聚合酶和DNA 模板外，PCR 反应体系中还需添加 。若在8bp 缺
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失型的DNA 样本中同时加入四条引物进行PCR 扩增，实验结束后应使用 技术对产物进行检测，且理
论上可以得到 种序列不同的DNA 片段。
(3)在检出突变基因后，科学家往往利用基因工程的方式获得该基因对应的蛋白质并进行下一步研究。如图
为构建重组质粒的流程示意图，在该过程中，应使用 对质粒S 进行酶切。将重组质粒通过转化导入
亮氨酸合成缺陷细菌后，应使用 （填“添加亮氨酸”或“不添加亮氨酸”）的选择培养基，同时挑
取 （填“有绿色荧光”或“没有绿色荧光”）的菌落进行进一步鉴定。
【答案】(1) 单对交配 棒眼红眼雌
(2) 四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）、缓冲溶液 琼脂糖凝胶电泳 2 /两
(3) BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 不添加亮氨酸 没有绿色荧光
【分析】1、根据题意，Muller-5 技术常用于果蝇X 染色体上突变的检出，由于突变具有随机性和不定向性，
为了准确判断X 染色体是否发生突变，宜用子代单对交配。
2、在构建重组质粒时，使用两种酶切出不同黏性末端有利于目的基因正向插入。
【详解】（1）根据题意，Muller-5 技术常用于果蝇X 染色体上突变的检出，由于突变具有随机性和不定向
性，为了准确判断X 染色体是否发生突变，F1 代需进行单对交配获得F2 代。假设控制棒眼/圆眼和红色
眼/杏色眼的相关基因用A/a、B/b 表示，则图中亲本基因组合为XAbXAb×XaBY，F1 基因型为XAbXaB、
XAbY，F1 雌雄交配，F2 基因型为XAbXAb、XAbXaB、XAbY、XaBY,已知有某纯合致死突变基因被检出，
则XaBY 个体死亡，则在F2 代中，最好选取性状为棒眼红眼雌（XAbXaB）果蝇进一步研究该突变基因的
作用。
（2）在进行PCR 扩增时，PCR 反应体系中需添加引物、耐热DNA 聚合酶、DNA 模板、四种脱氧核糖核
苷酸（dNTP）和缓冲溶液。若在8bp 缺失型的DNA 样本中同时加入四条引物进行PCR 扩增，实验结束后
应使用琼脂糖凝胶电泳技术对产物进行检测，根据题意如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用耐热
DNA 聚合酶无法延伸，引物3 的碱基能够与8bp 缺失型右端序列完全互补配对，即引物1 和引物3 组合能
成功扩增，而引物2 的3'端碱基不能与8bp 缺失型另一条链互补配对，无法延伸，无论EXON7 区是否缺失
或者替换，引物1 和引物4 都能够成功扩增，所以理论上可以得到2 种序列不同的DNA 片段。
（3）根据目的基因两端的粘性末端可知，初步可以选出BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和Bgl Ⅱ，当选择Hind Ⅲ和Bgl
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Ⅱ时，无法判断受体细胞中的质粒是否插入目的基因，而选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ时，GFP 基因被破坏，无
法发出绿色荧光，可以通过荧光有无判断受体细胞中的质粒是否插入目的基因，故应使用BamH Ⅰ和Hind
Ⅲ对质粒S 进行酶切。将重组质粒通过转化导入亮氨酸合成缺陷细菌后，由于重组质粒含有亮氨酸合成基
因，应使用不添加亮氨酸的选择培养基，又因为GFP 基因被破坏，无法发出绿色荧光，应挑取没有绿色荧
光的菌落进行进一步鉴定。
8．磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA 的动态变化，研
究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA 结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建
有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA 含量。无缝克隆技术连接DNA 片段的机理和
构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。
注：bar 为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5 核酸外切酶（从核苷酸链的外侧向内侧剪切核苷酸）沿 （填“5’→3’或“3’→5’”）
的方向水解DNA，其目的是形成 。T5 核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为
50℃，目的是 ，防止过度水解DNA。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是 ，过程③所需的酶有 。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有___（多选）。
A．不受限制酶切位点的限制
B．不需要使用PCR 技术扩增目的基因
C．不会出现目的基因的反接和自身环化
(4)PCR 扩增GFP 基因时需依据 的部分核苷酸序列设计引物R2。已知引物F1 的碱基序列是5’-
TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3’，据图分析扩增目的片段的所用的引物R2 可对应下表中的 （填序
号）。
①
5’-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCG-3’
②
5’-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGACA-3’
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③
5’-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATAA-3’
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有 的培养基上进行筛
选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，了解PA
的分布和含量。
【答案】(1) 5'→3' 黏性末端 降低酶活性
(2) （过程①）形成的黏性末端长度不同 DNA 聚合酶和DNA 连接酶
(3)AC
(4) PABD 基因和GFP 基因 ③
(5) 草胺膦 绿色荧光点（的分布）
【分析】PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：（1）模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至
90℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引
物结合，为下一轮反应作准备。（2）模板DNA 与引物的退火（复性）：模板DNA 经加热变性成单链后，
温度降至50℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合。（3）延伸：DNA 聚合酶由降温时结合
上的引物开始沿着DNA 链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA 聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及
需要合成的DNA 片段长度。
【详解】（1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5 核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末
端。温度能影响酶活性，T5 核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降
低酶活性，防止过度水解DNA。
（2）过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的
黏性末端大于互补配对的区段（同源序列），因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA 链
的补齐，可以看作DNA 分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA 聚合酶将游离的单个脱氧核苷
酸加到子链3′末端）和DNA 连接酶（将两个DNA 片段进行连接）。
（3）传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA 连接酶对目的基因
和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切
位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，不会出现目的基因的反接和自身环化，操作时间短，
成功率高，但该过程也需要利用PCR 技术扩增，AC 正确，B 错误。
故选AC。
（4）用于PCR 扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，由重组DNA 图可知，GFP 基
因和PABD 基因进行连接，因此PCR 扩增GFP 基因时需根据GFP 基因一端的核苷酸序列和PABD 基因一
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端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1 仅需根据PABD 基因一端的核苷酸序列，由于PCR 扩增GFP
基因时需根据GFP 基因一端的核苷酸序列和PABD 基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2 的一部分能
与引物F1 进行碱基互补配对，观察表中①②③的引物碱基序列可知，③的5’端部分碱基序列与F1 的5’端
部分碱基序列互补，因此可知，R2 对应于下表中的③。
（5）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA 上，农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可
转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获
得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA 结
合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测定
拟南芥细胞内PA 含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA 的动态变化。
9．肌肉生长抑制素MSTN 是骨骼肌生长发育负调控因子，MSTN 在肌肉组织中特异性表达，其活性的丧
失或降低会引起动物肌肉的过度发育，表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加，口感良好。因此，通过基
因敲除获得具有育种能力的MSTN 基因突变牛十分必要。
限
制
酶
KpnI
MfeI
HindIII
EcoRI
BamHI
识
别
序
列
及
切
割
位
点
图2
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(1)科研人员利用打靶载体敲除牛MSTN 基因（以下简称M 基因），载体构建及M 基因敲除过程如图1 所
示。为构建能够敲除M 基因的打靶载体，需先设计引物，通过PCR 技术扩增M 基因。在引物上添加PstI
限制酶识别序列，限制酶识别序列添加至引物的 （填“5'端”或“3'端”），据图1 应选择的引物是
（从a、b、c、d 中选择），将得到的PCR 产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。
(2)为将抗生素抗性基因neo（抵抗抗生素新霉素）从原载体中切下，随后插入M 基因中。据上图1 及表中
限制酶信息，应选择限制酶 分别对M 基因和neo 基因进行酶切，并用 连接，完成打靶载体构建。
(3)将构建好的打靶载体通过 法导入牛受体细胞中。据图1，受体细胞基因组中的M 基因通过交换被替
换为打靶载体上插入neo 基因的M 基因片段。交换后的打靶载体以及未成功交换的打靶载体（线形DNA
片段）很不稳定，在相关酶的作用下随即降解。
(4)载体可整合到受体细胞基因组DNA 的其他部位，引发K 基因表达，使细胞在加入物质Q 的培养基上无
法存活。在选择培养基中除有细胞培养的必需成分外，还需要加入物质Q 和 ，可筛选出成功敲除M 基
因的受体细胞，其原因是 。
【答案】(1) 5'端 a 和d
(2) EcoRI 和MfeI DNA 连接酶
(3)显微注射
(4) 新霉素 成功敲除M 基因的受体细胞基因组DNA 含有neo 基因，无K 基因表达，使其具有新
霉素抗性，且可在含物质Q 的培养基上存活
【分析】1、引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，其作用是使DNA 聚合酶能够从引物的
3'端开始连接脱氧核苷酸。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：
①不能破坏目的基因
②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）
③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自
身环化和质粒的自身环化。
3、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
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导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因；
②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平
上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）利用PCR 技术扩增DNA 分子时，子链的延伸方向是从引物的5'端到3'端，因此在引物上添
加PstI 限制酶识别序列，限制酶识别序列应添加至引物的5'端，否则引物失效。就图中给定的a、b、c、d
四种引物而言，想要将基因M 完整的扩增出来，应当选用引物a 和d。
（2）由图可知，M 基因内部有HindⅢ、EcoRI 和BamHI 的识别位点，因此切割M 基因必须在这三种限制
酶之间选择；neo 基因两侧具有MfeI 和KpnI 的识别序列，切割neo 基因只能在这两种限制酶之间选择，根
据表中各种限制酶识别序列可知，只有MfeI 与EcoRI 切割得到的黏性末端相同，都为AATT—3'，因此可
用EcoRI 切割M 基因，用MfeI 切割neo 基因，得到相同黏性末端之后再用DNA 连接酶将其连接，即可将
neo 基因插入M 基因中，完成打靶载体构建。
（3）将目的基因导入受体细胞时，若受体细胞是动物细胞，常采用显微注射法。
（4）打靶载体也可能整合到受体细胞基因组DNA 的其他部位，引发K 基因表达，使细胞在加入物质Q 的
培养基上无法存活。在选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分外，还需加入新霉素和物质Q，可筛选
出成功敲除M 基因的受体细胞，其原因是敲除M 基因的受体细胞基因组DNA 含有neo 基因，无K 基因表
达，使其具有新霉素抗性，且可在含物质Q 的培养基上可存活。
10．谷氨酸脱羧酶在植物生长发育和逆境胁迫中具有重要作用，OsGAD2 是水稻中一种能编码谷氨酸脱羧
酶的基因。南昌大学科研团队用CRISPR/Cas9 技术获得了几个OsGAD2 基因敲除的纯合突变体，发现敲除
了OsGAD2 的突变体水稻在株高、粒长和粒重上都有显著提高。回答下列问题：
(1)科研人员首先将OsGAD2 基因编码区的片段和CRISPR/Cas9 载体连接，得到重组载体，这个过程需要
用到的酶是 。导入受体细胞后，载体上的OsGAD2 基因片段可以转录出一段引导RNA 序列
（sgRNA），sgRNA 可以和受体细胞中OsGAD2 基因的相应位置（靶点）发生 ，从而引导
Cas9 蛋白特异性诱导靶点发生碱基随机突变。若突变后的0sGAD2 基因表达出的蛋白质比原来更短，可能
原因是 。突变后OsGAD2 基因往往会失去原有功能，所以重组载体也可以叫“OsGAD2 基
因敲除载体”，该载体的部分结构细节如下图所示。
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(2)用农杆菌转化将OsGAD2 基因敲除载体导入愈伤组织细胞，将转化后的愈伤组织转接培养基上进行培养。
为筛选出含有OsGAD2 基因敲除载体的愈伤组织细胞，培养基中需要加入 。同时，
加入抗生素还可以起到 作用。
(3)要检测是否成功诱变，最好选取下图中的引物 （填编号），以受体细胞染色体DNA 为模
板进行PCR，对扩增出的产物进行DNA 分子测序。PCR 每个循环有3 个步骤，其中 这个步
骤需要将温度降到50℃左右，其目的是
【答案】(1) 限制酶和DNA 连接酶 碱基互补配对 OsGAD2 基因编码区发生突变导致mRNA
提前出现终止密码（或碱基缺失导致表达出的蛋白质中氨基酸数量减少）
(2) 卡那霉素、潮霉素 抑制杂菌生长
(3) ②③ 复性 让引物（通过碱基互补配对）与（两条单链）模板DNA 结合
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）科研人员首先将OsGAD2 基因编码区的片段和CRISPR/Cas9 载体连接，得到重组载体，这
个过程需要用到的酶是限制酶（切割目的基因和载体，催化磷酸二酯键的断裂）和DNA 连接酶（连接目
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的基因和载体，催化磷酸二酯键的形成）。导入受体细胞后，载体上的OsGAD2 基因片段可以转录出一段
引导RNA 序列（sgRNA），sgRNA 可以和受体细胞中OsGAD2 基因的相应位置（靶点）发生碱基互补配
对，从而引导Cas9 蛋白特异性诱导靶点发生碱基随机突变。若突变后的0sGAD2 基因表达出的蛋白质比原
来更短，可能原因是OsGAD2 基因编码区发生突变导致mRNA 提前出现终止密码（或碱基缺失导致表达
出的蛋白质中氨基酸数量减少）。
（2）结合重组DNA 分子图，为筛选出含有OsGAD2 基因敲除载体的愈伤组织细胞，培养基中需要加入卡
那霉素、潮霉素进行筛选。同时，加入抗生素还可以起到抑制杂菌生长作用。
（3）图中靶点位于②③之间，要检测是否成功诱变，最好选取下图中的引物②③，区间更小更为准确，
以受体细胞染色体DNA 为模板进行PCR，对扩增出的产物进行DNA 分子测序。PCR 每个循环有3 个步骤，
其中复性这个步骤需要将温度降到50℃左右，其目的是让引物（通过碱基互补配对）与（两条单链）模板
DNA 结合。
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