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专题05 基因工程
基因工程的流程和应用是高考的必考点，且常考常新，预计2024 年高考也不例外，依然会对其进行考查，
有可能与新的科研实事结合，综合考查基因工程的流程和应用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细胞
工程、胚胎工程等综合起来考查
1、（2023·广东·高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变
筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替换，
突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶将
两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养
1
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基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的
T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
涂黑 。
【答案】(1)野生型
(2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子
(3) DAI 基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是
细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI 基因为显性基因，因此采用
2
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农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大
小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR 技术扩增DAI 基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI 基因和运载体进行切割，再用
DNA 连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾
端，因此为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0 代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA 上含有DAI 基因和卡那霉素
抗性基因）液中转化，再将获得的T1 代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上
有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI 基因和卡那霉
素抗性基因。
②T1 代阳性植株都含有DAI 基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一
位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相
当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1 的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植
株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2 代阳性植株自交，再将得到的T3 代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养
基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目
标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X
的切割位点，而突变型的基因有限制酶X 的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有
150bp，突变型有50bp 和100bp，如图：
。
2、（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某
些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为
原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
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回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR 技术，在优化反应
条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合
成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
，终止子的作用是 。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济特点。从“碳中和”
的角度看，该技术的优势在于 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】(1)引物
(2) 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来
(3)酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足
(4) 工业废气资源化 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排
【分析】（1）PCR 技术的原理是DNA 半保留复制，是在体外大量复制DNA 的技术，该技术的关键是Taq
酶可以从引物的3’端延伸子链。
（2）减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等手段增加大气中二氧化碳
的消耗。
【详解】（1）利用PCR 技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，
引物与模板链结合后，Taq 酶才能从引物的3’端延伸子链。
（2）基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止
子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。
（3）重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足，所以会导致生长迟缓。
（4）根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气
体为原料，实现了工业废气资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过
4
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程通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
3、（2021·广东·高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获
得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4 步酶促反应的非细胞合
成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严
重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有
。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋
白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4 种酶的表达。表达载体
转化大肠杆菌时，首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的
方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是 。在分子水平上，可以通过改变 ，
从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】 基因文库中获取、人工合成法 盐析法、酶解法或高温变性 感受态 抗原-抗体
杂交技术 有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成
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蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR 技术，此外获
得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋
白，可根据DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或
高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4 种酶的表达。表达载体
转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易
于接受外来的DNA 分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，
常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水
平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】本题考查基因工程、DNA 的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与
实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗
虫基因（crylC）和双T-DNA 载体连接（图示连接后双T-DNA 部分结构），利用其中的“Cre/LoxP”系统培
育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两个
同向的loxP 序列并将两个loxP 间的序列删除。
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图：P—启动子（P1 为胚乳特异表达启动子；P2 为绿色组织特异性表达启动子）
回答下列问题：
(1)Cre 酶与基因工程中的 （工具酶）作用类似。
(2)载体中，T-DNA 的作用是转移到被侵染的细胞后 ，hpt 基因（潮霉素抗性基因）和
gus 基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA 共转化植株的筛选，起到基因表达载体中
（填结构）的作用。
(3)筛选得到双T-DNA 共转化成功的植株T0中，hpt 基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。
先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-1、GH-2 和GH-3，自交后得到
T1代植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus 基因进行PCR 检测，产物的电泳结
果如下图a。（不考虑减数分裂时发生互换）
①T0代中 （填编号）是T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。
②在答题卡对应的图b 中画出植株GH-2 的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置 （注：用圆点·表示
T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置）
③GH-1 的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt 基因的植株的比例为 。这些植株自
交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。
(4)水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了 ，培育
了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片 （填“具有”或“不具有”）抗虫的性状。
【答案】(1)限制酶
(2) 整合到染色体（细胞核）DNA 标记基因
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(3) GH-3
3/16
(4) 在胚乳中特异性删除抗虫基因（外源基因/两个loxP 间的序列） 具有
【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA 重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微
生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入
活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：
①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其
中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）由题干信息可知，在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两
个同向的loxP 序列并将两个loxP 间的序列删除，所以Cre 酶与基因工程中的限制酶作用类似。
（2）载体中，T-DNA 的作用是转移到被侵染的细胞后整合到染色体（细胞核）DNA，hpt 基因（潮霉素抗
性基因）和gus 基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA 共转化植株的筛选，起到基因表达载
体中标记基因的作用。
（3）①由题图信息可知，对自交后得到T1 代植株进行潮霉素抗性检测，而潮霉素抗性检测为阴性植株，
如果T-DNA1 和T-DNA2 以连锁形式在单一位点插入植株，则对叶片的gus 基因进行PCR 检测时，电泳结
果不会出现相应的条带，符合GH-3 植株的电泳结果。
②由题图信息可知，先从T0 植株中筛选T-DNA1 和T-DNA2 都是单拷贝（单个）插入的植株GH-2，再结
合植株GH-2 的T1 代叶片gus 基因电泳结果可知，抗性检测为阴性，但植株的叶片中都含有gus 基因，说
明T-DNA1 和T-DNA2 插入到了一对同源染色体的不同位点，如果插入到了两对同源染色体的不同位置，
符合自由组合定律，经过自交后会出现有的叶片含有gus 基因，有的叶片不含gus 基因，符合GH-1 的电泳
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结果，所以植株GH-2 的T-DNA1 和T-DNA2 在染色体上的位置如图：
③根据GH-1 的T0 代自交的后代T1 植株的gus 基因电泳结果可知，T-DNA1 和T-DNA2 插入到了两对同源
染色体的不同位置，符合自由组合定律，亲本为杂合子，所以在T1 植株中具有抗虫特性但不含hpt 基因的
植株的比例为3/4×1/4=3/16。
（4）由题干信息可以，在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两个同向的
loxP 序列并将两个loxP 间的序列删除，可以实现了在胚乳中特异性删除抗虫基因（或外源基因或两个loxP
间的序列），培育了安全可食用的转基因水稻。GH-1 的T0 代自交的后代T1 植株中，具有抗虫特性但不
含hpt 基因的植株，这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx，所以Tx 种子播种后获得的叶片具
有抗虫的性状。
2．利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内
定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），诱导机体产生免疫反应。
科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD 和3RBD，探究RBD 的二聚体蛋
白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD 的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1 所示，
Nco I 和Sac I 是pNZ8149 质粒上的限制酶识别位点，U-M 为信号肽-细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题：
(1)为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加 ，并在
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（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。
(2)拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR 技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的
5'端应分别添加 序列，以实现融合基因定向插入质粒。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1 为双酶切pNZ8149-
2RBD，泳道2 为双酶切pNZ8149-3RBD。泳道1 两个条带大小分别为2507bp 和2020bp，由此可知，融合
基因3RBD 的长度为 bp，泳道2 呈现一个条带的原因是 。
(4)实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，
pNZ8149-2RBD 菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD 菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明 。
【答案】(1) 维生素 无氧
(2)限制酶Nco I 和Sac I 的识别
(3) 2686bp 双酶切pNZ8149-3RBD 后产生的两个片段大小相近
(4)二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加
维生素，乳酸菌属于厌氧菌，需要在无氧的环境条件下培养。
（2）根据质粒上启动子、终止子与限制酶识别序列的位置关系可知，为保证融合基因定向插入，应选择
两种限制酶切割，所用两种引物的5'端应分别添加限制酶Nco I 和Sac I 的识别序列。
（3）由图可知pNZ8149-2RBD 和pNZ8149-3RBD 的碱基对分别为4527bp 和5193bp，所以RBD 长度为
5193-4527=666bp，泳道1 为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp 和2020bp，所以融合基
因3RBD 的长度为666+2020=2686bp，泳道2 呈现一个条带的原因是双酶切pNZ8149-3RBD 后产生的两个
片段大小相近。
（4）实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，
pNZ8149-2RBD 菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149-3RBD 菌株表面三聚体蛋白多，由于抗原蛋白需穿
过细胞膜展示在细胞表面，因此该现象说明二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表
面。
3．植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植
物中。
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资料一：放线菌也是一种常见的内生菌，能抑制病原菌的生长。研究者利用两种不同类型的放线菌获得新
型工程菌，过程如图：
(1)收集上述两种菌丝体，加入 (填“纤维素酶”或“溶菌酶”)处理，分离原生质体，将两种原生
质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。终止反应并洗涤后，取一定量混合液接种于
(填“固体”或“液体”)培养基中培养，根据菌落特征，选出性状稳定的融合菌株。
资料二：某真菌的w 基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中w 基因转录方向是从左往右。为使
放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因操作。
限制酶
BamH I
EcoR I
Mfe I
Kpn I
HindⅢ
识别序列和切割位点( 5-3’ )
G↓GATTC
G↓AATTC
C↓AATTG
GGTAC↓C
A↓AGCTT
(2)根据图表分析，在构建基因表达载体时，应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶
切割图中含w 基因的DNA 片段，以获得能正确表达w 基因的重组质粒。
(3)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入w 基因，其
上游启动子应选择 启动子(选填“真菌”或“放线菌”)。
【答案】(1) 溶菌酶 固体
(2) MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ
(3) RNA 聚合酶 放线菌
【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一
段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合酶识别和结合的部
位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，能被溶菌酶水解，故收集上述两种菌丝体，加入溶菌
酶处理，分离原生质体，将两种原生质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。筛选是通过菌落
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特征进行的，所以接种于固体培养基上才能形成菌落。
（2）根据题图信息“图中w 基因转录方向是从左往右”、“放线菌质粒启动子到终止子方向为顺时针”，
故重组质粒的启动子应在w 基因左侧，终止子应在w 基因右侧，w 基因右侧只能用HindⅢ切割，w 基因左
侧有BamHI、KpnI、EcoRI 三种酶切位点，BamHI 位于启动子的内部，MfeI 位于w 基因内部，结合质粒情
况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中
含w 基因的DNA 片段，以获得能正确表达w 基因的重组质粒。
（3）启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA 聚合酶；根据题干信息“启动子通常具
有物种特异性”，目标是使放线菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择放线菌的质粒，在质粒中插入w 基
因，其上游启动子应选择放线菌启动子。
4．中药红花中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）因在植物发育中对植物次生代谢产物的调控和对环境刺激的响应
而被广泛研究。研究人员从红花盛花期花瓣中提取了总RNA，通过转基因实现了PAL 基因（2124bp）在
红花悬浮细胞中的超表达（具体过程见下图），为研究PAL 基因在红花次生代谢产物代谢途径中的功能和
对环境刺激的响应奠定了基础。请回答下列问题：
(1)次生代谢产物一般 （填“是”或“不是”）植物基本生命活动所必需的。从红花盛花期花瓣
中提取总RNA 的理由是 。
(2)RT-PCR 是将mRNA 逆转录和cDNA 的聚合酶链式反应相结合的技术。若要在该体系中通过①从总RNA
中扩增出PAL 基因的cDNA，应加入 的2 种引物。
(3)构建质粒2 时，需要利用限制酶BglⅡ和BstEⅡ对图中PAL 基因和质粒1 进行双酶切；验证质粒2 是否
构建成功时，若用上述双酶切质粒后电泳得到两种条带， （填“能”或“不能”）说明质粒2
构建成功，请说明理由： 。
(4)GUS 基因的表达产物能催化X-Gluc（一种无色物质）分解为蓝色物质，实验农杆菌和红花细胞中均无
该基因。加工质粒1 时，引入GUS 基因可以起到 的作用；选择悬浮细胞而不是愈伤组织作为
PAL 的生物反应器的原因是 。
【答案】(1) 不是 PAL 基因能够在红花盛花期花瓣细胞中表达，所以花瓣细胞中存在PAL 基因转
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录形成的mRNA
(2)分别与PAL 基因的cDNA 两条模板链两端结合
(3) 不能 质粒之上也有BglⅡ和BstEⅡ的酶切位点，双酶切后电泳也能得到两种条带
(4) 筛选成功导入质粒2 的农杆菌、筛选成功导入PAL 基因的红花愈伤组织细胞 相比在固体培养
基中的愈伤组织，悬浮细胞在液体培养基中又加之不断搅拌，所以细胞增殖的速度更快．单位时间获得的
产物更多
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技
术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据教材基础知识可知，次生代谢产物一般不是植物基本生命活动所必需的。根据题干信
息“研究人员从红花盛花期花瓣中提取了总RNA．通过转基因实现了PAL 基因（21241p）在红花悬浮细
胞中的超表达”可以推断，PAL 基因能够在红花盛花期花解细胞中表达．所以花瓣细胞中存在PAL 基因转
录形成的mRNA。
（2）若要在该体系中从总RNA 中扩增出PAL 基因的cDNA，应该利用PCR 获取目的基因，即应加入分别
与PAL 基因的cDNA 两条模板链两端结合的2 种引物。
（3）利用双酶切还可以验证质粒?是否构建成功，若用题中双酶切质粒后电泳得到两种条带，不能说明质
粒2 构建成功，因为质粒1 上也有BglⅡ和BstEⅡ的酶切位点，双酶切后电泳也能得到两种条带。
（4）加工质粒1 时，引入的GUS 基因相当于标记基因，标记基因的作用是便于对重组DNA 是否进入受体
细胞进行筛选，由图分析可知，农杆菌和红花愈伤组织细胞都是目的基因的受体，故答案为筛选成功导入
质粒2 的农杆菌、筛选成功导入PAL 基因的红花愈伤组织细胞；相比在固体培养基中的愈伤组织，悬浮细
胞在液体培养基中又加之不断搅拌，所以细胞增殖的速度莫快，单位时间获得的产物更多，故选择悬浮细
胞而不是愈伤组织作为PAL 的生物反应器。
5．瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P 载体含有的绿色荧光蛋白（GFP）基因能在真核细胞
中表达GFP。将目的基因插入GFP 基因后，能表达出目的蛋白和GFP 的融合蛋白，根据荧光的强弱，可
确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素
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基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P 载体的结构如图所示。
回答下列问题。
(1)PCR 扩增瘦素基因时，与引物1 互补的a 链左侧是脱氧核苷酸链的 （填“5′”或“3′”）端。
据图推测，构建该基因表达载体时，P 载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、 。
(2)已知HindⅢ和BamHI 在P 载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindⅢ、
BamHI 分别对瘦素基因PCR 产物、P 载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构
建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。
(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。
同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是 。本实验中为筛选转化的细胞，
应在培养基中添加 。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是 （答出2 种）。为进一步获得更多能表
达融合蛋白的细胞，还需要进行 。
【答案】(1) 3′ Hind Ⅲ和BamH Ⅰ切割位点
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(2)
(3) Kanr /Neor 抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子或转录后的加工不同或翻译后的加工不同
新霉素
(4) 抗原-抗体杂交技术、检测荧光强弱 动物细胞培养
【分析】基因工程的基本操作程序为目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）引物的作用是使DNA 聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，因此引物1 左侧为5'端，DNA
分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，因此与引物1 互补的a 链左侧是脱氧核苷酸链的3'端。构建
该基因表达载体时，P 载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、Hind Ⅲ和BamH Ⅰ切割位点。
（2）由于HindⅢ和BamHI 在P 载体上的切割位点非常接近，因此用HindⅢ、BamHI 对P 载体进行切割后，
会形成一个大片段，接近4700bp，一个超小片段可忽略，即对P 载体酶切产物电泳后，只出现4700bp 的
条带，若重组质粒构建成功，重组载体上会携带瘦素基因，用HindⅢ、BamHI 对重组质粒切割后，会出现
两个片段，一个是瘦素基因，一个是近4700bp 的片段，则电泳结果会出现两个条带，如图所示：
（3）Kanr /Neor 抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子或转录后的加工不同或翻译后的加工不同，
因此同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同。本实验中受体细胞为小鼠成纤维细胞，为真核细胞，则
Kanr/Neor 在真核细胞中表达具有新霉素抗性，为筛选转化的细胞，应在培养基中添加新霉素，能存活的
细胞为导入重组质粒的受体细胞。
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（4）瘦素基因表达产物为蛋白质，因此可以用抗原-抗体杂交技术进行检测瘦素基因是否成功表达，同时
目的基因插入GFP 基因后，能表达出目的蛋白和GFP 的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在
细胞内的表达情况，即可以检测荧光的强弱。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行动物
细胞培养。
6．融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与其他蛋白融合而产生的新
型蛋白，常用于亲和蛋白质纯化和抗体药物的研发。图是原核细胞融合蛋白基因表达载体，科研工作者在
启动子Pc 下游插入了两个与分离纯化有关的编码序列——谷胱甘肽转移酶基因（GST 基因）及凝血蛋白
酶切割位点的编码序列。
回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，需要用到的工具有 。上述融合表达载体中启动子Ptac 的作用是
。
(2)当外源基因插入后，可表达出由 （填“二”或“三”）部分序列组成的融合蛋白。
(3)GST 对谷胱甘肽有很强的结合能力。将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白
的全细胞提取物通过层析柱时， 将吸附在树脂内，其他细胞蛋白先被洗脱出来。接着用含游离
的还原型谷胱甘肽的缓冲液将融合蛋白洗脱。最后用 切割融合蛋白，即可获得纯化的目的蛋白。
(4)Fc 融合蛋白由某种具有生物学活性的功能蛋白分子与抗体恒定区的Fc 片段融合而成。该类融合蛋白不
仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体的性质，如长效半衰期。抗原在血浆中游离时
间越久，越容易被蛋白酶降解。
①利用哺乳动物细胞表达Fc 融合蛋白比在原核细胞中表达更具优势的理由是 。
②目前疫苗设计的关键在于有效活化抗原呈递细胞（APC），APC 表面能够表达Fc 受体，常利用抗原—
Fc 融合蛋白作为抗原运载工具，其原因是 。
【答案】(1) 限制酶、DNA 连接酶、载体 与RNA 聚合酶结合，驱动转录
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(2)三
(3) 融合蛋白 凝血蛋白酶
(4) 真核生物能对基因转录后的mRNA 进行剪接加工，而原核生物不能进行；真核细胞具有内质网、
高尔基体，能对表达产生的蛋白质进行糖基化等修饰。 借助Fc 片段靶向结合APC，缩短抗原在血浆
中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的呈递。
【分析】1、基因工程基本操作步骤，需要经历四步：目的基因获取→基因表达载体的构建→目的基因导
入受体细胞→目的基因检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
2、基因表达载体的构建：（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目
的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
【详解】（1）构建基因表达载体时，需要用到的工具有限制酶、DNA 连接酶、载体。融合表达载体中启
动子Ptac 的作用是与RNA 聚合酶结合，驱动转录。
（2）当外源基因插入后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。
（3）将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，
融合蛋白将吸附在树脂内，其他细胞蛋白先被洗脱出来。接着用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液将融合
蛋白洗脱。最后用凝血蛋白酶切割融合蛋白，即可获得纯化的目的蛋白。
（4）①真核生物能对基因转录后的mRNA 进行剪接加工，而原核生物不能进行；真核细胞具有内质网、
高尔基体，能对表达产生的蛋白质进行糖基化等修饰，则哺乳动物细胞表达F℃融合蛋白比在原核细胞中
表达更具优势。
②常利用抗原—Fc 融合蛋白作为抗原运载工具的原因是借助Fc 片段靶向结合APC，缩短抗原在血浆中的
游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的呈递。
7．番茄在种植过程中容易发生虫害。研究人员将双价抗虫载体转入番茄中，获得具有抗虫特性的转基因
番茄。图为所用载体的部分结构示意图，其中Bar 为除草剂抗性基因，Cry1Ac 为苏云金杆菌毒蛋白基因，
Pta 为半夏凝集素基因。
回答下列问题：
(1)双价抗虫载体中的P1、P2和P3是属于基因表达载体中的 ，其作用是 。
(2)构建的载体通常用 法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，并在培养基中添加 用
于筛选转基因番茄。
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(3)为验证Pta 基因是否转入番茄基因组中，研究人员使用 技术筛选转基因番茄中的Pta 基因，再进
行凝胶电泳鉴定，结果如图所示。
图中①为阳性对照，②为阴性对照，③为待测植株，试分析③中出现2 条条带的可能原因是 。
(4)对于成功转化的番茄植株还需进一步进行抗虫鉴定，研究人员选取3 株阳性转基因番茄进行小菜蛾幼虫
抗性实验，结果如下表。
株系编号
CK
1
2
3
幼虫致死率（%）
0
39.8
6.5
48.9
注：CK 表示对照
由表中可知，株系2 的幼虫致死率较低，推测其可能原因是 。
【答案】(1) 启动子 RNA 聚合酶识别和结合的位点
(2) 农杆菌转化法 除草剂
(3) PCR 所使用的的Pta 引物特异性不高
(4)抗虫基因在转基因番茄株系2 的表达水平比较低
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因
导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】（1）双价抗虫载体中的P1、P2 和P3 位于基因的首端，是属于基因表达载体中的启动子，启动
子是转录的起点，是RNA 聚合酶识别和结合的位点。
（2）番茄为双子叶植物，常用农杆菌转化法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，基因表达载体中有
Bar 为除草剂抗性基因，可作为标记基因，可在培养基中添加除草剂用于筛选转基因番茄。
（3）为验证Pta 基因是否转入番茄基因组中，可使用PCR 技术，筛选转基因番茄中的Pta 基因，再进行凝
胶电泳鉴定，若PCR 过程中引物特异性不高，可能会出现多条条带，③中出现2 条条带的可能原因是所使
用的的Pta 引物特异性不高
（4）由表中数据可知，株系2 的幼虫致死率较低，可能是因为抗虫基因在转基因番茄株系2 的表达水平比
较低。
8．I 结球甘蓝（雌雄同株）又称卷心菜，是老百姓菜篮子里四季常见、质优价廉的蔬菜。开展与之有关的
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遗传与育种研究，具有十分重要的意义。请回答下列问题结球甘蓝的叶色有紫色和绿色两种，由两对独立
遗传的等位基因（D/d 和E/e）控制。现将两种纯合的紫色叶结球甘蓝分别与绿色叶结球甘蓝杂交，并设为
甲、乙两组；两组F1叶色均为紫色，将两组F1分别自交，甲组所得F2中紫色叶植株与绿色叶植株的比例
为15∶1，乙组所得F2中紫色叶植株与绿色叶植株的比例为3∶1.由题意可知，甲组F2紫色叶植株中杂合
子基因型的种类有 种；乙组亲本紫色叶植株的基因型为 ；若让乙组F2紫色叶植株自由交配，
所得子代表现型及比例为 。
II.研究发现，P5CS 基因能促进脯氨酸的大量合成进而提高植物耐盐碱能力。某研究小组利用基因工程等技
术将从野生茄子中获得的P5CS 基因（简称StP5CS 基因）导入到结球甘蓝细胞中，培育出了耐盐碱的结球
甘蓝转基因新品种（实验流程图如图所示）。
①根据上图可知，Bar 基因的作用是 ；若Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ为5 种限制酶及其酶切位点，为使
StP5CS 基因最终能正确表达，过程①应选用 （填符号）进行酶切；耐盐碱的结球甘蓝转基因植株细
胞是以StP5CS 基因的 （选填“a 链”或“b 链”）为模板进行转录，并最终使植株表现出耐盐碱性
状。
②根据题意，请写出一种检测或鉴定所得植株为转基因耐盐碱结球甘蓝的方法 。
【答案】【小题1】 5 DDee 或ddEE 紫色：绿色=8：1 【小题2】 作为标记基因，
起筛选作用 Ⅲ和Ⅳ b 链 检测实验所得结球甘蓝植株的脯氨酸含量并与未进行实验的对照组
比较
【分析】1、基因的分离定律的实质：在杂合体的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定
的独立性，在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，
独立地随配子遗传给后代。
2、基因的自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减
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数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时非同源染色体上的非等位基因自由组合。
【小题1】现将两种纯合的紫色叶结球甘蓝分别与绿色叶结球甘蓝杂交，两组F1 叶色均为紫色，将两组F1
分别自交，甲组所得F2 中紫色叶植株与绿色叶植株的比例为15∶1，由此可推测绿色叶植株是双隐性，其
余均为紫色叶植株，且F1 基因型为DdEe，则亲本基因型为DDEE 和ddee；甲组F2 紫色叶植株中杂合子
基因型的种类有DDEe、DDee、DdEE、Ddee、DdEe 共5 种，乙组中F2 中紫色叶：绿色叶=3：1，可推测
F1 基因型为Ddee 或ddEe，则亲本中紫色叶植株的基因型为DDee 或ddEE，若乙组中的F2 紫色叶植株自
由交配，假设F1 为Ddee，F2 中DDee：Ddee∶ddee=1∶2∶1，令紫色叶植株自由交配，仅考虑D/d，则有
1/3DD、2/3Dd，配子为2/3D、1/3d，理论上后代有8/9D-∶1/9dd，表现型及比例为紫色：绿色=8：1
（ddEe 结果相同）。
【小题2】①基因表达载体应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等，据图可知，图中
的Bar 基因属于标记基因，其作用是起筛选作用；据图可知，图中标记基因两侧都有II 的酶切位点，可能
导致自身环化等问题，不能选择，且I 会破坏目的基因，也不能选择，又因为酶切位点应位于运载体的启
动子和终止子之间，则V 也不能选择，故最终选择Ⅲ和Ⅳ进行酶切；转录时需要从模板链的3'端开始，保
证子链从5'向3'延伸，故耐盐碱的结球甘蓝转基因植株细胞是以StP5CS 基因的b 链为模板进行转录，并最
终使植株表现出耐盐碱性状。
②检测或鉴定所得植株为转基因耐盐碱结球甘蓝可以通过个体生物学水平进行检测，具体方法为：检测实
验所得结球甘蓝植株的脯氨酸含量并与未进行实验的对照组比较。
9．健康的生活方式、乐观的心态和定期体检是预防癌症的主要手段。（CAR-T 细胞疗法是治疗血液恶性
肿瘤及淋巴瘤的研究热点，我国首款新型肿瘤治疗方法——CAR-T 产品于2021 年上市。左图为CAR-T 细
胞疗法的原理示意图，该疗法借助基因工程和细胞工程技术，根据CAR 蛋白（右图）是多种肿瘤的嵌合
抗原受体的特点而设计。
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回答下列问题：
(1)机体肿瘤的发生主要与免疫系统的 功能降低有关。
(2)图中过程①称为 ，这是基因工程的核心步骤，需要用到的工具酶有 。过程②最常用的方法
是 。CAR-T 细胞输入患者体内后，其活化需要两个信号的刺激，具体是 。
(3)据图可知，CAR-T 细胞疗法相对传统的药物化疗和放疗而言，具有 （请写出两点）的突出优点。
(4)CAR-T 细胞在治疗肺癌、肝癌、乳腺癌等实体瘤的总体效果上还不尽如人意，请根据右图并结合特异性
免疫的原理，提出一种CAR 蛋白改造的简单思路，以提升CAR-T 细胞对实体瘤的疗效： 。
【答案】(1)免疫监视
(2) 基因表达载体的构建 限制酶和DNA 连接酶 显微注射法 CAR 蛋白与肿瘤细胞表面
抗原结合；细胞因子刺激
(3)治疗更精准、免疫排斥反应少、杀瘤效果更持久、杀瘤范围更广
(4)改造胞外识别区，使CAR 蛋白能与更多实体瘤的癌细胞结合；改造胞内信号域，更好调控CAR-T 细胞
的活化与增殖
【分析】由图可知，CAR-T 细胞疗法是通过设计CAR 基因，并导入癌症患者的T 细胞中，使其转化为
CAR-T 细胞。CAR-T 细胞膜上的CAR 蛋白与癌细胞表面抗原特异性结合后，可激活CAR-T 细胞使其增殖、
分化，从而实现对癌细胞的特异性杀伤和记忆。
【详解】（1）免疫系统的三大功能是：免疫防御、免疫自稳、免疫监视。机体能识别和清除突变的细胞，
防止肿瘤发生，这与免疫监视功能有关。
（2）CAR 基因作为目的基因与PCDH 质粒连接，属于基因工程中的基因表达载体构建环节；过程中需要
使用同种限制酶切割目的基因与质粒，保证获得相同的黏性末端，再用DNA 连接酶使目的基因与质粒连
接形成基因表达载体；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法；CAR-T 细胞输入患者体内后，
其活化需要两个信号的刺激，具体是CAR 蛋白与肿瘤细胞表面抗原结合和细胞因子刺激。
（3）传统的化疗、放疗只是杀死癌细胞，只能暂缓病情，无法遏制癌细胞的增殖和扩散。而且癌细胞有
很多干扰机制能让它逃掉免疫细胞的追杀。据题可知，CAR—T 细胞疗法是一种免疫疗法，CAR—T 细胞
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可以在癌细胞的干扰下，继续精准识别并消灭癌细胞。这种调用病人自身免疫系统的治疗方法比传统疗法
更精准（不伤害正常细胞、副作用小）、更持久、排斥反应更少、杀瘤范围更广。
（4）①据图分析，CAR-T 细胞表面表达有CAR 蛋白，CAR 蛋白的胞外识别区能直接识别肿瘤细胞表面的
特异性抗原，并与细胞内信号域蛋白相连，建立信号通路，目前，CAR-T 疗法是治疗血液恶性肿瘤及淋巴
瘤的热点，面对实体瘤，其识别能力不强。因此可以改造CAR-T 细胞的胞外识别区，使CAR 蛋白能识别
并结合更多实体瘤的癌细胞。
②改造CAR 蛋白的胞内信号域部分，可以增强信号通路，使CAR-T 细胞更易活化，快速增殖，增强免疫
能力。
10．人乳铁蛋白（hLTF）是一种铁结合的糖蛋白，具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因
技术培育能生产hLTF 的奶牛，从牛奶中分离提纯hLTF。回答下列问题。
(1)从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真
核细胞中表达，主要原因是 。
(2)研究人员采用小鼠乳清酸蛋白基因的启动子和终止子来替换pA 质粒中的部分序列，再拼接hLTF 基因，
最终形成pW2-hLTF 重组质粒，过程如下图：
通过PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子、终止子和hLTF 基因时，均需引入限制酶的识别序列和切割
位点，以便剪接到质粒的指定位置。据图分析，PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应
分别包含 、 （限制酶）的识别序列。将修饰后的hLTF 基因插入到重组质粒的启动子和终止子之间
后，不一定能获得所需要的基因表达载体，原因是 。
(3)经检测筛选所获得的基因表达载体pW2-hLTF 通过 的方法导入到奶牛的受精卵细胞中，以获得能产
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生hLTF 的转基因奶牛。
【答案】(1)原核生物和真核生物的RNA 聚合酶所识别和结合的启动子有所不同
(2) NruⅠ MluⅠ hLTF 基因两端被同一种限制酶切割成相同的末端，可能会反向连接到质粒上
(3)显微注射
【分析】因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
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上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）由于原核生物和真核生物的RNA 聚合酶所识别和结合的启动子有所不同，因此从原核生物
中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达。
（2）启动子插入了NruⅠ和MluⅠ序列之间，因此PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物
应分别包含NruⅠ和MluⅠ（限制酶）的识别序列。从图中看出，hLTF 基因和表达载体均采用MluⅠ切割，
hLTF 基因两端被同一种限制酶切割成相同的末端，可能会反向连接到质粒上，因此将修饰后的hLTF 基因
插入到重组质粒的启动子和终止子之间后，不一定能获得所需要的基因表达载体。
（3）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物
细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 因此经检测筛选
所获得的基因表达载体pW2-hLTF 通过显微注射的方法导入到奶牛的受精卵细胞中，以获得能产生hLTF
的转基因奶牛。
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