文档内容
押广东卷
基因工程
核心考点 考情统计 押题预测
基因工程 2023年广东卷第20题 基因工程的流程和应用是高考的必考
点，且常考常新，预计 2024年高考也不例
2022年广东卷第22题
外，依然会对其进行考查，有可能与新的科
2021年广东卷第22题 研实事结合，综合考查基因工程的流程和应
用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细
胞工程、胚胎工程等综合起来考查
1、（2023广东高考）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到
一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后
的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因
植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶
将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入
多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获
得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T 代植株并自交，将T 代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
0 1
因组中插入了_________。
②T 代阳性植株自交所得的T 代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养
1 2
基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T 代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的
2
T 代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
3
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
涂黑_________。
【答案】（1）野生型 （2） ①. 载体（基因表达载体） ②. 启动子和终止子
（3） ①. DAI 基因和卡那霉素抗性基因 ②. 75 ③. 自交 ④. 100 ⑤.【解析】
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是
细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【小问1详解】
根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将
野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植
株的种子大小相近。
【小问2详解】
利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA
连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，
因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
【小问3详解】
①根据题干信息和图形分析，将T 代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性
0
基因）液中转化，再将获得的T 代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够
1
萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性
基因。
②T 代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一
1
位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相
当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植
株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T 代阳性植株自交，再将得到的T 代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基
2 3上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标
转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的
切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有
150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
。
2、（2022广东高考）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭
菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO 等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，
2
通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反
应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的
合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
________________，终止子的作用是________________。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中
和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】22. 引物 23. ①. 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 ②. 终止转录，
使转录在需要的地方停下来
24. 酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足
25. ①. 工业废气资源化 ②. 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排【解析】
【分析】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制，是在体外大量复制DNA的技术，该技术的关键是Taq
酶可以从引物的3’端延伸子链。
（2）减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等手段增加大气中二氧化碳
的消耗。
【小问1详解】
利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结
合后，Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。
【小问2详解】
基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终
止转录，使转录在需要的地方停下来。
【小问3详解】
重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足，所以会导致生长迟缓。
【小问4详解】
根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原
料，实现了工业废气资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程通过捕
获二氧化 碳，实现固碳减排，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．（2024·广东茂名·二模）融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与其
他蛋白融合而产生的新型蛋白，常用于亲和蛋白质纯化和抗体药物的研发。图是原核细胞融合蛋白基因表
达载体，科研工作者在启动子Pc下游插入了两个与分离纯化有关的编码序列——谷胱甘肽转移酶基因
（GST基因）及凝血蛋白酶切割位点的编码序列。回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，需要用到的工具有 。上述融合表达载体中启动子Ptac的作用是
。
(2)当外源基因插入后，可表达出由 （填“二”或“三”）部分序列组成的融合蛋白。
(3)GST对谷胱甘肽有很强的结合能力。将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白
的全细胞提取物通过层析柱时， 将吸附在树脂内，其他细胞蛋白先被洗脱出来。接着用含游离
的还原型谷胱甘肽的缓冲液将融合蛋白洗脱。最后用 切割融合蛋白，即可获得纯化的目的蛋白。
(4)Fc融合蛋白由某种具有生物学活性的功能蛋白分子与抗体恒定区的Fc片段融合而成。该类融合蛋白不
仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体的性质，如长效半衰期。抗原在血浆中游离时
间越久，越容易被蛋白酶降解。
①利用哺乳动物细胞表达Fc融合蛋白比在原核细胞中表达更具优势的理由是 。
②目前疫苗设计的关键在于有效活化抗原呈递细胞（APC），APC表面能够表达Fc受体，常利用抗原—
Fc融合蛋白作为抗原运载工具，其原因是 。
【答案】(1) 限制酶、DNA连接酶、载体 与RNA聚合酶结合，驱动转录
(2)三
(3) 融合蛋白 凝血蛋白酶
(4) 真核生物能对基因转录后的mRNA进行剪接加工，而原核生物不能进行；真核细胞具有内质网、
高尔基体，能对表达产生的蛋白质进行糖基化等修饰。 借助Fc片段靶向结合APC，缩短抗原在血浆
中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的呈递。
【分析】1、基因工程基本操作步骤，需要经历四步：目的基因获取→基因表达载体的构建→目的基因导
入受体细胞→目的基因检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
2、基因表达载体的构建：（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
【详解】（1）构建基因表达载体时，需要用到的工具有限制酶、DNA连接酶、载体。融合表达载体中启
动子Ptac的作用是与RNA聚合酶结合，驱动转录。
（2）当外源基因插入后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。
（3）将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，
融合蛋白将吸附在树脂内，其他细胞蛋白先被洗脱出来。接着用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液将融合
蛋白洗脱。最后用凝血蛋白酶切割融合蛋白，即可获得纯化的目的蛋白。
（4）①真核生物能对基因转录后的mRNA进行剪接加工，而原核生物不能进行；真核细胞具有内质网、
高尔基体，能对表达产生的蛋白质进行糖基化等修饰，则哺乳动物细胞表达F℃融合蛋白比在原核细胞中
表达更具优势。
②常利用抗原—Fc融合蛋白作为抗原运载工具的原因是借助Fc片段靶向结合APC，缩短抗原在血浆中的
游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的呈递。
2．（2024·广东茂名·二模）荔枝是我国南方地区重要的亚热带水果，品种繁多。荔枝产业中普遍存在“成
花难”的问题。荔枝花芽发育受温度波动影响较大，当花芽分化刚出现“白点”时遇到高温高湿环境，会
导致花序原基萎缩发育，雏形叶迅速生长的花芽败育现象。LcNAC29基因参与相关调控过程，该基因的启
动子区域包含脱落酸、温度和光等响应元件，它在萎缩花芽细胞中大量表达。回答下列问题：
(1)荔枝的地域性分布很大程度上由 （填“阳光”或“温度”）决定，与花芽的发育密切相关的
植物激素是 （至少填三种）。
(2)LcNAC29基因的表达可能受 的响应，它作用是 。
(3)荔枝的成熟上市期直接受开花的时间影响，COL基因是光周期调控荔枝开花的关键基因。研究发现荔枝
的2个COL基因表达受基因间的一段特定序列M调控。云南EEMC品种和海南LMC品种的染色体型如图
1，科研工作者为了研究盛产于广东的“妃子笑”EMC品种的开花机制和起源，分别以al和bl，al和cl为
引物结合位点对三个品系进行PCR扩增，电泳结果如图2。由此可推出3个品种之间起源关系是 ，序列M作为简便的分子标记在荔枝驯化史研究和品系选
育上有 的作用。
【答案】(1) 温度 脱落酸、赤霉素、生长素、细胞分裂素、乙烯
(2) 脱落酸、温度和光 调控花芽的萎缩
(3) 广东“妃子笑”是云南EEMC品种和海南LMC品种杂交驯化的后代 鉴别荔枝品种的亲缘关
系和选育不同开花期荔枝品种
【分析】植物激素是由植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的生长发育有显著影响的微
量有机物。赤霉素合成部位：主要是未成熟的种子、幼根和幼芽。主要作用：促进细胞伸长，从而引起植
株增高，促进种子萌发和果实发育。细胞分裂素合成部位：主要是根尖。主要作用：促进细胞分裂。脱落
酸合成部位：根冠、萎焉的叶片等。分布：将要脱落的器官和组织中含量多。主要作用：抑制细胞分裂，
促进叶和果实的衰老和脱落。乙烯合成部位：植物体各个部位。主要作用：促进果实成熟。
【详解】（1）题干中指出荔枝花芽发育受温度波动影响较大，并且荔枝主要生长在南方，荔枝的地域性
分布很大程度由温度决定，与花芽的发育密切相关的植物激素有脱落酸（抑制细胞分裂，促进叶和果实的
衰老和脱落）、赤霉素（促进细胞伸长，从而引起植株增高，促进种子萌发和果实发育）、生长素、细胞分裂素（促进细胞分裂）、乙烯（促进果实成熟）。
（2）题干中指出LcNAC29基因参与相关调控过程，该基因的启动子区域包含脱落酸、温度和光等响应元
件，它在萎缩花芽细胞中大量表达。LcNAC29基因的表达可能受脱落酸、温度和光的响应，它作用是在萎
缩花芽细胞中大量表达，调控花芽的萎缩。
（3）通过图二可以看出，广东的“妃子笑”EMC品种同时含有云南EEMC品种和海南LMC品种两个品
种的电泳条带，由此可推出3个品种之间起源关系是广东“妃子笑”是云南EEMC品种和海南LMC品种
杂交驯化的后代。在云南EEMC品种的基因中是缺失序列M，在海南LMC品种的基因中存在序列M，在
广东的“妃子笑”EMC品种中存在序列M，序列M作为简便的分子标记在荔枝驯化史研究和品系选育上
有鉴别荔枝品种的亲缘关系和选育不同开花期荔枝品种的作用。
3．（2024·广东深圳·一模）番茄在种植过程中容易发生虫害。研究人员将双价抗虫载体转入番茄中，获得
具有抗虫特性的转基因番茄。图为所用载体的部分结构示意图，其中Bar为除草剂抗性基因，Cry1Ac为苏
云金杆菌毒蛋白基因，Pta为半夏凝集素基因。
回答下列问题：
(1)双价抗虫载体中的P、P 和P 是属于基因表达载体中的 ，其作用是 。
1 2 3
(2)构建的载体通常用 法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，并在培养基中添加 用
于筛选转基因番茄。
(3)为验证Pta基因是否转入番茄基因组中，研究人员使用 技术筛选转基因番茄中的Pta基因，再进
行凝胶电泳鉴定，结果如图所示。
图中①为阳性对照，②为阴性对照，③为待测植株，试分析③中出现2条条带的可能原因是 。
(4)对于成功转化的番茄植株还需进一步进行抗虫鉴定，研究人员选取3株阳性转基因番茄进行小菜蛾幼虫
抗性实验，结果如下表。
株系编号 CK 1 2 3幼虫致死率（%） 0 39.8 6.5 48.9
注：CK表示对照
由表中可知，株系2的幼虫致死率较低，推测其可能原因是 。
【答案】(1) 启动子 RNA聚合酶识别和结合的位点
(2) 农杆菌转化法 除草剂
(3) PCR 所使用的的Pta引物特异性不高
(4)抗虫基因在转基因番茄株系2的表达水平比较低
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因
导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】（1）双价抗虫载体中的P1、P2和P3位于基因的首端，是属于基因表达载体中的启动子，启动
子是转录的起点，是RNA聚合酶识别和结合的位点。
（2）番茄为双子叶植物，常用农杆菌转化法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，基因表达载体中有
Bar为除草剂抗性基因，可作为标记基因，可在培养基中添加除草剂用于筛选转基因番茄。
（3）为验证Pta基因是否转入番茄基因组中，可使用PCR技术，筛选转基因番茄中的Pta基因，再进行凝
胶电泳鉴定，若PCR过程中引物特异性不高，可能会出现多条条带，③中出现2条条带的可能原因是所使
用的的Pta引物特异性不高
（4）由表中数据可知，株系2的幼虫致死率较低，可能是因为抗虫基因在转基因番茄株系2的表达水平比
较低。
4．（2024·广东韶关·二模）I结球甘蓝（雌雄同株）又称卷心菜，是老百姓菜篮子里四季常见、质优价廉
的蔬菜。开展与之有关的遗传与育种研究，具有十分重要的意义。请回答下列问题结球甘蓝的叶色有紫色
和绿色两种，由两对独立遗传的等位基因（D/d和E/e）控制。现将两种纯合的紫色叶结球甘蓝分别与绿色
叶结球甘蓝杂交，并设为甲、乙两组；两组F 叶色均为紫色，将两组F 分别自交，甲组所得F 中紫色叶
1 1 2
植株与绿色叶植株的比例为15∶1，乙组所得F 中紫色叶植株与绿色叶植株的比例为3∶1.由题意可知，甲
2
组F 紫色叶植株中杂合子基因型的种类有 种；乙组亲本紫色叶植株的基因型为 ；若让乙组F
2 2
紫色叶植株自由交配，所得子代表现型及比例为 。
II.研究发现，P5CS基因能促进脯氨酸的大量合成进而提高植物耐盐碱能力。某研究小组利用基因工程等技
术将从野生茄子中获得的P5CS基因（简称StP5CS基因）导入到结球甘蓝细胞中，培育出了耐盐碱的结球
甘蓝转基因新品种（实验流程图如图所示）。①根据上图可知，Bar基因的作用是 ；若Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ为5种限制酶及其酶切位点，为使
StP5CS基因最终能正确表达，过程①应选用 （填符号）进行酶切；耐盐碱的结球甘蓝转基因植株细
胞是以StP5CS基因的 （选填“a链”或“b链”）为模板进行转录，并最终使植株表现出耐盐碱性
状。
②根据题意，请写出一种检测或鉴定所得植株为转基因耐盐碱结球甘蓝的方法 。
【答案】【小题1】 5 DDee或ddEE 紫色：绿色=8：1 【小题2】 作为标记基因，
起筛选作用 Ⅲ和Ⅳ b链 检测实验所得结球甘蓝植株的脯氨酸含量并与未进行实验的对照组
比较
【分析】1、基因的分离定律的实质：在杂合体的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定
的独立性，在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，
独立地随配子遗传给后代。
2、基因的自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减
数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时非同源染色体上的非等位基因自由组合。
【小题1】现将两种纯合的紫色叶结球甘蓝分别与绿色叶结球甘蓝杂交，两组F1叶色均为紫色，将两组F1
分别自交，甲组所得F2中紫色叶植株与绿色叶植株的比例为15∶1，由此可推测绿色叶植株是双隐性，其
余均为紫色叶植株，且F1基因型为DdEe，则亲本基因型为DDEE和ddee；甲组F2紫色叶植株中杂合子
基因型的种类有DDEe、DDee、DdEE、Ddee、DdEe共5种，乙组中F2中紫色叶：绿色叶=3：1，可推测
F1基因型为Ddee或ddEe，则亲本中紫色叶植株的基因型为DDee或ddEE，若乙组中的F2紫色叶植株自
由交配，假设F1为Ddee，F2中DDee：Ddee∶ddee=1∶2∶1，令紫色叶植株自由交配，仅考虑D/d，则有
1/3DD、2/3Dd，配子为2/3D、1/3d，理论上后代有8/9D-∶1/9dd，表现型及比例为紫色：绿色=8：1
（ddEe结果相同）。【小题2】①基因表达载体应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等，据图可知，图中
的Bar基因属于标记基因，其作用是起筛选作用；据图可知，图中标记基因两侧都有II的酶切位点，可能
导致自身环化等问题，不能选择，且I会破坏目的基因，也不能选择，又因为酶切位点应位于运载体的启
动子和终止子之间，则V也不能选择，故最终选择Ⅲ和Ⅳ进行酶切；转录时需要从模板链的3'端开始，保
证子链从5'向3'延伸，故耐盐碱的结球甘蓝转基因植株细胞是以StP5CS基因的b链为模板进行转录，并最
终使植株表现出耐盐碱性状。
②检测或鉴定所得植株为转基因耐盐碱结球甘蓝可以通过个体生物学水平进行检测，具体方法为：检测实
验所得结球甘蓝植株的脯氨酸含量并与未进行实验的对照组比较。
5．（2024·广东广州·一模）人乳铁蛋白（hLTF）是一种铁结合的糖蛋白，具有抑菌、提高免疫力等重要功
能。研究者通过转基因技术培育能生产hLTF的奶牛，从牛奶中分离提纯hLTF，回答下列问题。
(1)从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真
核细胞中表达，主要原因是 。
(2)研究人员采用小鼠乳清酸蛋白基因的启动子和终止子来替换pA 质粒中的部分序列，再拼接hLTF 基因，
最终形成pW2-hLTF 重组质粒，过程如下图：
注：Nrul、Mlul和Notl是三种限制酶，图中表示相应限制酶的识别序列和切割位点。pA、pW1、pW2和
pW2-hLTF表示不同阶段的质粒。
通过PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子、终止子和hLTF 基因时，均需引入限制酶的识别序列和切
割位点，以便剪接到质粒的指定位置。据图分析，PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物
应分别包含 、 （限制酶）的识别序列，将修饰后的hLTF基因插入到重组质粒的启动子和终止子
之间后，不一定能获得所需要的基因表达载体，原因是 。(3)经检测筛选所获得的基因表达载体pW2-hLTF通过 的方法导入到奶牛的受精卵细胞中，以获得能产
生hLTF 的转基因奶牛。
【答案】(1)真核生物和原核生物的 RNA 聚合酶所识别和结合的启动子有所不同
(2) Nrul MluI hLTF 基因两端被同一种限制酶切割成相同的末端，可能会反向连接到质粒上
(3)显微注射
【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的
基因的检测与鉴定。
【详解】（1）真核生物和原核生物的 RNA 聚合酶所识别和结合的启动子有所不同，因此从原核生物中
获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达。
（2）由图可知，在pW2-hLTF这个质粒中，启动子两侧的限制酶的识别序列和切割位点分别是Nrul和
Mlul，因此PCR 扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应分别包含Nrul和Mlul的识别序列。
由图可知hLTF基因两侧的限制酶识别序列和切割位点都是Mlul，相同酶切位点的序列一样，可能存在反
向连接的现象。
（3）根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，
因此经检测筛选所获得的基因表达载体pW2-hLTF通过显微注射的方法导入到奶牛的受精卵细胞中。
6．（2024·广东湛江·一模）他汀类药物是目前应用广泛、效果理想的降脂药物，醇脱氢酶是该药物催化合
成过程中的关键酶。研究人员对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR，并将其导入大肠杆菌BL-21中，构建重
组醇脱氢酶工程菌，利用LB培养基可大量生产醇脱氢酶。请回答下列问题：
(1)对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR时，需要先设计引物，引物应选择图1中的 。
(2)PCR反应过程如图2所示，其中58℃退火45s的目的是 。TaqDNA聚合酶在图2中的 过程中
发挥作用。(3)pET-28b质粒（图3）中a区段表示的是 结构，a区段的作用是 。构建重组质粒时最好选用限
制酶 。将构建重组质粒导入BL-21中后，培养在含有 的LB固体培养基上，以达到筛选的目的。
限制酶 识别序列
NcoⅠ C↓CATGG
XhoⅠ C↓TCGAG
EcoRⅠ G↓AATTC
(4)通常用 的方法，检测工程菌BL-21是否生产出了醇脱氢酶。
【答案】(1)引物Ⅱ、引物Ⅲ
(2) 引物与模板结合 延伸和后延伸
(3) 启动子 与RNA聚合酶结合，启动转录 NcoⅠ和XhoⅠ 卡那霉素
(4)抗原抗体杂交
【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链
的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。【详解】（1）PCR过程中，子链延伸方向为5＇→3＇，因此选用的引物为引物Ⅱ、引物Ⅲ。
（2）PCR过程中退火的目的是使引物与模板的碱基之间形成氢键从而结合；TaqDNA聚合酶作用为催化形
成磷酸二酯键，延伸子链，因此在延伸和后延伸过程中起作用。
（3）目的基因要插入启动子和终止子之间，所以a区段为启动子，启动子的作用是与RNA聚合酶结合，
启动转录；构建重组质粒时最好选用限制酶NcoⅠ和XhoⅠ以避免破坏标记基因（卡那霉素抗性基因），若
只选其中一个有可能出现目的基因的倒接或质粒的重新拼接；由于标记基因是卡那霉素，故需要在含有卡
那霉素的LB固体培养基上，以达到筛选的目的。
（4）抗原与抗体的结合具有特异性，由于醇脱氢酶的本质是蛋白质，故检测醇脱氢酶是否产生，通常采
用抗原-抗体杂交法。
7．（2024·广东梅州·一模）磷酸吡哆醛（PLP）是维生素 B6的活性形式，是多种酶的重要辅酶。科研人
员从大肠杆菌（E.coliK12）中找到了合成PLP 的关键酶A， 通过基因工程构建了高产PLP的工程菌，流
程如下图所示。请回答下列问题：
(1)①过程需要用到的基因工程的基本工具是 。利用PCR 获取和扩增酶 A 基因过程中温度最低的一步
称为 ，其目的是 。
(2)③过程一般先用Ca2+处理E.coliBL21细胞, 使细胞处于一种 的生理状态,进而在适宜的条件下完成转化过程。
(3)③过程后需将工程菌置于含 的培养基中筛选出能够生长的菌落。
(4)为探究④过程得到的是否为高产 PLP 工程菌，请简要写出实验思路： 。
【答案】(1) 限制性内切核酸酶（限制酶） 复性 使两种引物（通过碱基互补配对）与两条
单链DNA结合（或答“引物与模板链结合”）
(2)能吸收周围环境中DNA分子
(3)氨苄青霉素
(4)将等量原始（E.coliBL21）菌株与重组菌株（工程菌）分别置于相同且适宜的条件下培养，一段时间后
分别检测（比较单位体积的）培养液中PLP的含量
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：(1)分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--
DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。(2)个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①过程可用PCR技术获得酶A基因，需要用到的基因工程的基本工具是限制性内切核酸酶
（限制酶），PCR每次循环可以分为变性（超过90℃）、复性（50℃左右）、延伸（72℃左右）三步，其
中温度最高的是变性，该步的目的是使酶A基因DNA解为单链。
（2）导入目的基因时，首先用Ca2+处理E.coliBL21细胞,，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子
的生理状态，进而在适宜的条件下完成转化过程。
（3）③过程后将工程菌先置于含氨苄青霉素的培养基中筛选出能够生长的菌落，能够生长的菌落包括两
种类型，再做进一步筛选即可得到所需菌落。
（4）验证④过程得到的是否为高产PLP工程菌，可以将等量原始E.coliBL21菌株与含有重组质粒的菌株
分别在含有适量IPTG的培养液中适宜条件下培养，一段时间后分别检测培养液中PLP的含量。
