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05 生物技术与工程综合题
1．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基
因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本
过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，
最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生
质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的
原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的
__________为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶
进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙
原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确
定原生质体密度。两种原生质体1∶1 混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；
一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体
分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于
__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
__________
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形
成再生植株。
(5)用PCR 技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA 序列a，乙植物细胞
质具有特异性DNA 序列b；M1、M2为序列a 的特异性引物，N1、N2为序列b 的特异性
引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的__________。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同
样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经__________后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现
了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
1
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【答案】(1) 再生 叶
(2) 纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG 浓
度，使其失去融合作用
(3) 同一个杂种融合原生质体 ABD
(4) 再分化 根和芽
(5) 模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【分析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分
化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作
过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再
生以及杂种植株鉴定等步骤。
【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体
是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进
行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进
行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，
在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞
质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后
的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1
混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀
释，稀释的目的是降低PEG 浓度,使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质
体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源
于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法
正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核
失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、
分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生
植株。
（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的模板。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系，M1、M2 为特异性引物，扩增序列a；用同样
的方法扩增序列b。
2
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Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了
预期的1 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
2．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键
酶基因P1 导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR（卡那霉素抗性基因）
和SacB 两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物________和
________，并在引物的________（5＇∕3＇）端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR 扩
增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包
含___________（EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2 构建
高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL
突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有
__________的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载
体5 上其他DNA 片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
3
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D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用__________技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产
量。
【答案】(1) 1 4 5＇
(2)XhoⅠ
(3)卡那霉素
(4)B
(5)PCR
【分析】PCR 反应过程:变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链
DNA 解聚为单链，复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单
链DNA 结合，延伸：72℃左右时，Taq 酶有最大活性，可使DNA 新链由5'端向3'端延
伸。
【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基
因），需要引物1 和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1 和4。PCR 时，
在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的，因此在引物的5'端引入XhoⅠ酶识别序列。
（2）据图可知，载体4 中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载
体3 中不含XhoⅠ酶识别序列，如果将载体2 和载体3 连接形成高效筛选载体4 时，需
要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。
（3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5
中含有RpsL（链霉素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5 导入链霉
素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌
株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
（4）据题意可知，载体5 导入的时链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉素敏
感的受体菌，受体菌中P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他
DNA 片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B 正确，ACD
错误。
故选B。
（5）通过PCR 技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA 中或目的基因
是否转录出了mRNA，因此可采用PCR 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。
3．（2022·重庆·统考高考真题）研究发现柑橘精油可抑制大肠杆菌的生长。某兴趣小
组采用水蒸气蒸馏法和压榨法提取了某种橘皮的精油（分别简称为HDO 和CPO），
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并研究其抑菌效果的差异。
(1)为便于精油的提取，压榨前需用________浸泡橘皮一段时间。在两种方法收集的油
水混合物中均加入NaCl，其作用是________；为除去油层中的水分，需加入________。
(2)无菌条件下，该小组制备了两个大肠杆菌平板，用两片大小相同的无菌滤纸分别蘸
取HDO 和CPO 贴于含菌平板上，37℃培养24h，抑菌效果见如图。有同学提出该实验
存在明显不足：①未设置对照，设置本实验对照的做法是________，其作用是
________；②不足之处还有________（答两点）。
(3)若HDO 的抑菌效果低于CPO，从提取方法的角度分析，主要原因是________。
【答案】(1) 石灰水 增加盐的浓度，利于水油分层 无水硫酸钠
(2) 用一片大小相同的无菌滤纸蘸取等量的蒸馏水贴于含菌平板上 排除无
关变量对实验结果的影响，增强实验结果的可信度 违背平行重复原则，每个
实验组中的样本太少；实验组精油的含量没有遵循等量原则
(3)橘皮精油的有效成分在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解
【分析】 1、玫瑰精油的提取：水蒸气蒸馏→油水混合物→（加入NaCl）分离油层→
（加入无水Na2SO4）除水→（过滤）得到植物精油。
2、提取橘皮精油：石灰水浸泡→漂洗→压榨→过滤→静置→再次过滤→橘皮油。
【详解】（1）新鲜柑橘皮中含有大量的果蜡、果胶和水分，如果直接压榨，出油率较
低，为了提高出油率，需要将柑橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡。为了将水油分层，
只需加入氯化钠，增加盐浓度，就会出现明显的分层，再用分液漏斗将这两层分开。
分离的油层还会含有一定的水分，一般可以加入一些无水硫酸钠吸水。
（2）本实验缺乏对照组，无法排除其他无关变量对实验结果的影响，可用一片大小相
同的无菌滤纸蘸取等量的蒸馏水贴于含菌平板上作为对照组。另外，每个实验组中只
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利用了一张无菌滤纸，样本太少，容易出现偶然性误差；而且两个实验组蘸取的精油
没有遵循等量原则。
（3）橘皮精油的有效成分在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解，所以HDO 的抑菌效果
低于CPO。
4．（2022·重庆·统考高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下
乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui 基因，并开展了相
关探索。
步骤I：
步骤II：
(1)花药培养能缩短育种年限，原因是________。在步骤I 的花药培养过程中，可产生
单倍体愈伤组织，将其培养于含________的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I
中能用于制造人工种子的材料是________。
(2)步骤II 中，eui 基因克隆于cDNA 文库而不是基因组文库，原因是________；在构建
重组Ti 质粒时使用的工具酶有________。为筛选含重组Ti 质粒的菌株，需在培养基中
添加________。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I 中的________，以获得转基因
再生植株。再生植株是否含有eui 基因的鉴定方法是________，移栽后若发育为更高且
丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
【答案】(1) 单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分
离 秋水仙素 胚状体
(2) cDNA 文库是由编码蛋白质的mRNA 逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基
因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶
和 DNA 连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA 分子杂交技术
【分析】1、单倍体育种的原理是染色体变异，方法是用花药离体培养获得单倍体植株，
再人工诱导染色体数目加倍；优点是纯合体自交后代不发生性状分离，因而能明显缩
短育种年限。2、cDNA 是指以mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补
DNA。以细胞的全部mRNA 逆转录合成的cDNA 组成的重组克隆群体称为cDNA 文库，
基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA 切割成一定大小的片段，并与合适的载体
重组后导入宿主细胞，进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA 片段的集合，它包
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含了该生物的所有基因。
【详解】（1）单倍体育种过程中，单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代
不会发生性状分离，所以可以明显缩短育种年限。将水稻花粉进行脱分化处理，可产
生单倍体的愈伤组织，秋水仙素能抑制纺锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，
从而引起细胞内染色体数目加倍，故将其培养于含秋水仙素的培养基上，可促进产生
二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。
（2）cDNA 文库又叫部分基因文库，是由编码蛋白质的mRNA 逆转录来的基因导入受
体菌而形成的，而基因组文库包含了本物种全部基因，基因工程中只需转录出编码蛋
白质的基因部分就即可，故选cDNA 文库。在构建重组Ti 质粒时，必须使用限制性核
酸内切酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性未端，之后再用DNA 连接
酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti 质粒中含有抗生素抗性基因，故应
在培养基中添加抗生素，以便对重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入到植物细
胞常用农杆菌转化法，即用含eu 基因的农杆菌侵染愈伤组织，以便将eui 基因导入愈
伤组织，获得转基因再生植株。检测植株是否含有eui 基因，可采取DNA 分子杂交技
术的方法。
5．（2022·江苏·统考高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多
种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体
在有丝分裂中的功能是__________________。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基
因X 进行了PCR 扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓
度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，溶液中添加NaC1 至2．0mo1/L 的目的是
__________________。PCR 扩增时，需在__________________催化下，在引物
__________________端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋
白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载
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体质粒Y，构建Y-M 重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M
（图Ⅱ中融合片段M 中有白
色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物_____________；②PCR 目的产物约为
_____________bp。
确保M 及连接处序列正确，
Y-M 的连接处上游含有Hind
III+EcoR V 的识别序列，下
游含有EcoR V+BamH I 的识
别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序
列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分
别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而
实验组荧光集中在纤毛基部，说明
________________________。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人
基因Z 的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA 作为模板，
PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct
值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环数）。从理论上估算，在
PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。
【答案】(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心）
(2) 溶解DNA 耐高温DNA 聚合酶（Taq 酶） 3'
(3) a、b 1100 Q4 X 蛋白参与中心体的形成
(4) 逆转录 32
【分析】PCR 技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚
合酶（Taq 酶）；PCR 的操作过程：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链
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DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补
链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。
（2）从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离
出来，DNA 在2．0mo1/L 的NaC1 溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA 的
溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1 至2．0mo1/L 的目的是溶解DNA。PCR
扩增时，需在耐高温的DNA 聚合酶（即Taq 聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行
DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
（3）PCR 扩增目的DNA 片段时，在引物的3’端进行DNA 链的延伸，据图可知，应
选择图II 中的引物a 和引物b，PCR 目的产物约为300+800=1100bp。确保M 及连接处
序列正确，Y-M 的连接处上游含有Hind III+EcoR V 的识别序列，下游含有EcoR
V+BamH I 的识别序列，根据题干信息构建Y-M 重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段），
Y-M 的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I 的识别序列，根据EcoR V 识别
位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细胞，
发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X 参
与中心体的组成。
（4）研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病
人基因Z 的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA 作为模板，PCR
扩增结果显示，在总cDNA 模板量相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为
20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环数），说明病人基因Z 表达较弱，
设健康人Z 基因的cDNA 数为x，病人Z 基因的cDNA 数为y，则有x×215=y×220，从
理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
25=32 倍。
6．（2022·河北·统考高考真题）番茄灰霉病菌严重影响番茄生产，枯草芽孢杆菌可以
产生对多种病原菌具有抑制作用的蛋白质。为探究枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病
的生物防治，研究者设计了相关实验。回答下列问题：
(1)检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时，取适量________菌液涂布于固体
培养基上，将无菌滤纸片（直径5mm）在________菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中
心，数秒后取出滤纸片，培养皿倒置培养后测量________大小以判定抑菌效果。
(2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________（填“静置”或“摇床震
荡”）培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用________（填“稀释涂布平板
法”或“显微镜直接计数法”），其原因是________。
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(3)电泳分离蛋白质混合样品的原理是________。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定枯
草芽孢杆菌的抗菌蛋白分子量时，SDS 的作用是________。
(4)枯草芽孢杆菌长期保藏时，常以其________作为保藏对象。
【答案】(1) 番茄灰霉病菌 枯草芽孢杆菌 抑菌圈
(2) 摇床震荡 稀释涂布平板法 用稀释涂布平板法在培养基上看到
的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计
算在内
(3) 利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使
带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离 SDS 带有大
量的负电荷，且能使蛋白质变性成为肽链，使蛋白质的迁移速率只与蛋白质的相对分
子质量有关，而与所带电荷性质无关
(4)菌液
【分析】统计菌落数目的方法：
（1）显微镜直接计数法
原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生
物数量。
（2）间接计数法（活菌计数法）
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中
的一个活菌．通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
【详解】（1）分析题意，要检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用，先把适量
的番茄灰霉病菌菌液涂布于固体培养基上，将无菌滤纸片在枯草芽孢杆菌菌液中浸泡
后覆盖于固体培养基中心，若对番茄灰霉病菌有抑制作用，被覆盖的位置的番茄灰霉
病菌就会被杀死，培养皿倒置培养后会出现抑菌圈，测量抑菌圈大小以判定抑菌效果
强弱。
（2）枯草芽孢杆菌为好氧微生物，采用摇床震荡培养可增大培养液的溶氧量，有利于
枯草芽孢杆菌的生长繁殖。培养过程中要抽样检测活菌数量，应该采用稀释涂布平板
法，用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直
接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内。
（3）电泳分离蛋白质混合样品的原理是：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异
及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中
各种分子的分离。SDS 带有大量的负电荷，且能使蛋白质变性成为肽链，使蛋白质的
迁移速率只与蛋白质的相对分子质量有关，而与所带电荷性质无关。
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（4）长期保藏枯草芽孢杆菌，应该将培养的菌液转移到灭菌好的甘油瓶中，与甘油充
分混合，放在-20℃的冷冻箱中保存。
7．（2022·河北·统考高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某
研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或
共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是________。
(2)________是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的________上，此方法的不足之
处是________。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有
________（写出两点即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的________以鉴定其抗
性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析
________（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，
其原因是________。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生
________。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作
物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是
________（写出两点即可）。
【答案】(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的
(2)#基因表达载体的构建##表达载体的构建#
(3) T-DNA 该方法不适用与单子叶植物
(4)基因--DNA 分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术
(5) 效果 NaPI＋StPinlA
饲喂NaPI＋StPinlA 转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多
(6) 定向改变 由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗
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性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基
因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基
因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入
动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细
胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因；②检测目的
基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正
常消化食物达到抗虫的目的。
（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建。
（3）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且
整合到受体细胞染色体的DNA 上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti
质粒的T-DNA 上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色
体的DNA 上。其不足之处是该方法不适用与单子叶植物。
（4）目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA
是否插入目的基因、是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控
制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--
DNA 分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。
（5）抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以
鉴定其抗性程度。由图可知，NaPI＋StPinlA 转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂
NaPI＋StPinlA 转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多。
（6）在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不
断进化。由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐
增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不
能编码处胰蛋白酶抑制剂。
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8．（2022·北京·统考高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类
物质（E 物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安
全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E 物质受体，且幼体透明。科学
家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E 物质
监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是_______。
(2)为监测E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE 和
酵母来源的UAS 是两种诱导型启动子，分别被E 物质-受体复合物和酵母来源的Gal4
蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1 相比，方案2 的主要优势是_______，
因而被用于制备监测鱼（MO）。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本（X）杂
交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型
斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：____。
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P 生）④使基因仅在肌细胞表达
的启动子（P 肌）
Ⅱ.基因：______
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因
（dg）
(4)SM 不育的原因是：成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后_______造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM 不育的目的是_______。
【答案】(1)显微注射
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(2)监测灵敏度更高
(3) ② D
(4)激活ERE 诱导Gal4 表达，Gal4 结合UAS 诱导dg 表达，生殖细胞凋亡
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目
的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因
导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受
态细胞法。
【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体
导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。
（2）由图可知，方案1E 物质-受体复合物激活ERE，使GFP 基因表达，方案2 E 物
质-受体复合物先激活ERE 获得Gal4 蛋白，然后Gal4 蛋白激活UAS 启动子，使GFP
基因表达，方案2GFP 蛋白表达量大，更灵敏。
（3）MO 和另一亲本（X）杂交获得SM，MO 是方案2 获得，所以亲本X 启动子选择
UAS。要获得SM 是不育个体，MO 是可育的所以X 必须有仅导致生殖细胞凋亡的基
因（dg）。
（4）成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE 诱导Gal4 表达，
Gal4 与UAS 启动子结合诱导dg 表达，使生殖细胞凋亡。
（5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生
物安全问题，需要SM 不育。
9．（2022·海南·统考高考真题）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4 个基因
Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A 的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重
编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS 分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然
后将iPGCs 注射到孵化2.5 天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，
实验流程如图。回答下列问题。
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(1)CEFs 是从孵化9 天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎
后需用___________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添
加______________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
(2)体外获取OSNL 的方法有______________（答出1 种即可）。若要在CEFs 中表达
外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须
有启动子和______________等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它
才能驱动____________________________。
(3)iPS 细胞和iPGCs 细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是______________。
(4)诱导iPS 细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________。
(5)该实验流程中用到的生物技术有________________（答出2 点即可）。
【答案】(1) 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 动物血清
(2) PCR 技术、人工合成法 终止子 RNA 聚合酶 目的基
因转录出mRNA，最终表达出所需要的蛋白质
(3)基因的选择性表达
(4)诱导iPS 细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞
（iPS），再诱导iPS 分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术
是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，
继而发育为动物个体的技术
(5)基因工程、动物细胞培养
【分析】胚胎干细胞（ES 细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、
人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。iPS 细胞技术是借助基因
导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为ES 细胞
样的细胞，即iPS 细胞。
【详解】（1）动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶处理，以获得单细胞悬
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液。动物细胞培养时一般需要在合成培养基中添加血清等天然成分，以满足细胞对某
些细胞因子的需求。
（2）OSNL 为目的基因，体外获取目的基因可通过PCR 技术大量扩增或通过人工合成
法来合成。基因表达载体中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点和标
记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，它是RNA 聚合
酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
（3）据图可知，由iPS 细胞诱导形成iPGCs 细胞经过了细胞分化，该过程遗传物质没
有改变，导致其细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是基因的选择性表达。
（4）诱导iPS 细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞
（iPS），再诱导iPS 分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术
是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，
继而发育为动物个体的技术。
（5）由图可知，该实验流程中将OSNL 基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，
诱导多能干细胞过程利用了动物细胞培养的技术。
10．（2022·湖北·统考高考真题）“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科
研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M 的品系甲
有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工
作者做了如下实验；
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果
如下表。
杂交组合
F1表现型
F2表现型
甲×乙
不甜
1/4 甜、3/4 不甜
甲×丙
甜
3/4 甜，1/4 不甜
乙×丙
甜
13/16 甜、3/16 不
甜
【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA 分析，发现基因S 与作物M 的甜度相关。
【实验三】转S 基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti 质粒为表达载体，以品系甲的叶片外
植体为受体，培有出转S 基因的新品系。
根据研究组的实验研究，回答下列问题：
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(1)假设不甜植株的基因型为AAbb 和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因
型有_____种。品系乙基因型为_______。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜
∶不甜比例为_____。
(2)下图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径有___________。
(3)如图是S 基因的cDNA 和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为
了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用
_____________酶切割S 基因的cDNA 和载体。
(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是________。
(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其
他优良性状的育种方法还有___________（答出2 点即可）。
【答案】(1) 7 aabb 1∶5
(2)①③
(3)XbaⅠ、HindⅡ
(4)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞
(5)单倍体育种、诱变育种
【分析】农杆菌转化法：取Ti 质粒和目的基因构建基因表达载体、将基因表达载体转
入农杆菌、将农杆菌导入植物细胞、将植物细胞培育为新性状植株。
杂交育种：杂交→自交→选优；诱变育种：物理或化学方法处理生物，诱导突变；单
倍体育种：花药离体培养、秋水仙素加倍；多倍体育种：用秋水仙素处理萌发的种子
或幼苗；基因工程育种：将一种生物的基因转移到另一种生物体内。
【详解】（1）甲为纯合不甜品系，基因型为AAbb，根据实验一结果可推得乙基因型
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为aabb，丙基因型为AABB，乙、丙杂交的F2 基因型有3×3=9 种，假设不甜植株的基
因型为AAbb 和Aabb，F2 中表现为甜的植株基因型有7 种。若用乙×丙中F2 不甜的植
株进行自交，F3 中不甜比例=1/3+2/3×3/4=5/6，F3 中甜∶不甜比例为1∶5。
（2）不甜植株的基因型为AAbb 和Aabb，只有A 导致不甜，当A 与B 同时存在时，
表现为甜，故选①③。
（3）为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插
入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅡ酶切割S 基因的cDNA 和载体。
（4）用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，可以通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入
植物细胞。
（5）除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的
其他优良性状的育种方法还有单倍体育种、诱变育种。
11．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋
白酶识别并降解，药物A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治
疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P 和FLAG-P△。P△是缺失特
定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨基端，使融合蛋白能与含
有FLAG 抗体的介质结合，但不影响P 或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的
引物需满足的条件是_______、为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应
的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或
“5'端”）。
(2)PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合
基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入
细胞后，融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序
列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同。据图甲分析，出现该问题的原因是
______。修改扩增P 基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修
改方案是______。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A 和UBC 按照图乙中的组合
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方式分成5 组。各组样品混匀后分别流经含FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合的
物质并用UBC 抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P 和FLAG-P△不能降解
UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是______；由②④组或③⑤组的差
异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。
(4)根据以上结果推测，药物A 治疗该病的机理是______。
【答案】(1) 能与P 基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
5'端
(2) P 基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，
导致mRNA 的密码子被错位读取。
在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1 个碱基
(3) 增强FLAG-P 与UBC 的结合 参与P 与UBC 的结合
(4)药物A 通过增强P 与UBC 结合促进P 降解。
【分析】PCR 过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解旋为单链；②
温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合；③延伸：
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4 种脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合酶的作用
下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，
因此设计扩增P 基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。
DNA 聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制
酶识别序列应添加在引物的5'端。
（2）融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列
正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同，说明P 基因翻译时出错。由图可看出，
在转录出的mRNA 中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P 基因对应的第一个碱
基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识
别序列3'端添加1 个碱基，使其碱基数目加上FLAG 的碱基数目为3 的倍数，这样能
保证P 基因转录出的mRNA 上的读码框不改变，能够正常翻译。
（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC 抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC 和
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FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A 和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药
物A 的作用是促进UBC 与FLAG-P 的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用
FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的
特定序列是与UBC 结合的关键序列。
（4）根据（3）的分析推测，药物A 促进UBC 与FLAG-P 的结合，从而促进蛋白P 被
蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分
析方可得出结论。
12．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋
白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提
高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a 是_______，物质b 是_______。在生产过程中，
物质b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、
__________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是
____________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝
血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的
______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是
______________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝
血活性差异，简要写出实验设计思路________________________________________。
【答案】(1) 氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性
(2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合
成 DNA 双链复制
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(3) 种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋
白空间结构有不同程度破坏
(4)取3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物
和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的
血液加入1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质
的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列；
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基
因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的
生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二
代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
【详解】（1）据分析可知，物质a 是氨基酸序列多肽链，物质b 是mRNA。在生产过
程中，物质b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即
一种氨基酸可能有几个密码子。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文
库中获取目的基因、通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。
PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链复制。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量
随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲
处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着
酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性
最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶
解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭
蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗
凝血活性差异，实验设计思路为：取3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的
水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物
（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统
计三支试管中血液凝固时间。
13．（2022·湖南·高考真题）黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发
酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。
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EC 主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC 含量有严格的限量标准。回答下列
问题:
(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a 是_______，工艺b 是_______
（填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b 的目的是____________________。
(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定
分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳
定性和利用效率提高，固定化方法有_________________________（答出两种即可）。
(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果
如图所示。推测________是决定工程菌L 高脲酶活力的关键因素，理由是
__________________。
(4)某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC 含量超标。简要写出利用微生物降低该
黄酒中EC 含量的思路_____________________________。
【答案】(1) 酵母菌 消毒
目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期
(2) 酚红 化学结合法、包埋法、物理吸附法
(3) pH 两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，而维持pH 在6.5 不变与pH
从6.5 降为4.5 相比较而言，酶活力值始终要高
(4)方案一：配置一种选择培养基，筛选出产生EC 降解酶的细菌，从细菌中分离得到
EC 降解酶，纯化的EC 降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。
方案二：配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯
化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
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【分析】由于细菌分解在尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基
碱性增强，pH 升高，所以可以用检测pH 的变化的方法来判断尿素是否被分解，可在
培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后产生氨，pH 升高，指示剂变红。
【详解】（1）制造果酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，加入的菌种a 是酵母菌。过滤能
除去啤酒中部分微生物，工艺b 是消毒，目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长
其保存期。
（2）由于细菌分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增
强，pH 升高，所以可以用检测pH 的变化的方法来判断尿素是否被分解，故在以尿素
为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌。固定化酶实质上是将相
应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶稳定性，酶的各项特性
（如高效性、专一性和作用条件的温和性）依然保持。固定化酶的方法包括化学结合
法、包埋法、物理吸附法等。
（3）对比两坐标曲线，两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，说明培养时间不
是决定因素；而维持pH 在6.5 不变与pH 从6.5 降为4.5 相比较而言，酶活力值始终要
高，说明pH 为6.5 时，有利于酶结构的稳定，故pH 是决定工程菌L 高脲酶活力的关
键因素。
（4）从坐标图形看，利用脲酶消除其前体物质尿素可降低该黄酒中EC 含量。配置一
种选择培养基，筛选出产生EC 降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC 降解酶，纯化的
EC 降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。或者配置一种选择培养基，筛选出产生
脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流
程的发酵环节中加入。
14．（2022·全国·统考高考真题）化合物S 被广泛应用于医药、食品和化工工业、用菌
株C 可生产S，S 的产量与菌株C 培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验
比较不同碳源对菌体生长和S 产量的影响，结果见表。
碳源
细胞干重（g/L）
S 产量（g/L）
葡萄糖
3.12
0.15
淀粉
0.01
0.00
制糖废液
2.30
0.18
回答下列问题。
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有
______（答出2 点即可）。
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(2)由实验结果可知，菌株C 生长的最适碳源是______；用菌株C 生产S 的最适碳源是
______。菌株C 的生长除需要碳源外，还需要______（答出2 点即可）等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C 不能生长，其原因是______。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S 的最适碳源浓度，某同学进行了相关
实验。请简要写出实验思路：______。
(5)利用制糖废液生产S 可以实现废物利用，其意义是______（答出1 点即可）。
【答案】(1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌
(2) 葡萄糖 制糖废液 氮源、无机盐、水
(3)缺少淀粉酶
(4)分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其
他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S 的产量，S 产
量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S 的最适碳源浓度
(5)减少污染、节省原料、降低生产成本
【分析】1、实验室常用的灭菌方法：（1）灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种
环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地
灭菌；（2）干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养
皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌；（3）高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在
盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温
度为121℃的条件下，维持15～30 min。
2、培养基的营养构成：各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和
无机盐；不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
【详解】（1）通常在实验室培养微生物时，为防止实验用的玻璃器皿等物品中原有的
微生物污染培养物，需要使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢
和孢子，即对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿常用的灭菌的方法有干热灭菌、高
压蒸汽灭菌等。
（2）由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C 的细胞干
重最大，说明最适于菌株C 生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C
生产S 的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，说明最适于生产S 的碳源是制糖废液。
微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氧
气以及特殊营养物质的要求，故菌株C 的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、
水等营养物质。
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（3）分析题图表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C 不能生长，原因可能
是菌株C 不能合成淀粉酶或菌株C 不能分泌淀粉酶，因而不能利用淀粉。
（4）要测定生产S 的最适制糖废液为碳源的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可
分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他
条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S 的产量，S 产量
最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S 的最适碳源浓度。
（5）利用制糖废液生产S 可以实验废物利用，既有利于减少污染、节省原料，又能降
低生产成本。
15．（2022·全国·高考真题）某同学从被石油污染的土壤中分离得到A 和B 两株可以
降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个
菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B 菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B 菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、
乙两孔。
回答下列问题。
菌
株
透明圈大小
平板
Ⅰ
平板
Ⅱ
A
+++
++
B
++
-
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是____________。培养基中NH4NO3的作用是为
菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成____________（答出2 种即可）等
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生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A 细菌，繁殖n 代后细
菌的数量是____________。
(3)为了比较A、B 降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，
结果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“-”表示无透明圈），
推测该同学的实验思路是__________。
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的
菌株是____________，理由是___________。
【答案】(1) 石油 DNA、RNA、蛋白质
(2)N0•2n
(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A 菌液和B 菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，
平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔
处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比
较A、B 降解石油的能力
(4) A A 菌株降解石油的能力高于B 菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能
生长
【分析】培养基对微生物具有选择作用。配置培养基时根据某一种或某一类微生物的
特殊营养要求, 加入某些物质或除去某些营养物质，抑制其他微生物的生长，也可以
根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性，在培养基中加入某种化学物质,从而筛
选出待定的微生物。这种培养基叫做选择培养基。
【详解】（1）培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含
化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N 元
素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。
（2）由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的种群数量呈J 型曲线增长，由于细
菌进行二分裂，细菌每繁殖一代就是上一代的2 倍，根据公式Nt=N0•λt，λ=2，繁殖n
代后细菌的数量是N0•2n。
（3）分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A 菌株降解石油的能力高于B
菌株；在平板Ⅱ上，A 菌株仍然能降解石油，而B 菌株不能降解，根据实验的单一变
量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A 菌液和B 菌
液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件
下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解
能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B 降解石油的能力。
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（4）由表格数据可知，在平板Ⅱ（无氮源的培养基）上，A 菌株仍然能降解石油，而
B 菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A 菌株，因为A 菌
株降解石油的能力高于B 菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
16．（2022·辽宁·统考高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N
蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N 蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N 蛋白胞外段抗原制备，流程如图1
(1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是
___________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在
脂质体___________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
(2)质粒在包装细胞内组装出由___________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而
表达并分离、纯化N 蛋白胞外段。
Ⅱ．N 蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2
(3)用N 蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用___________酶处理，
制成细胞悬液，置于含有混合气体的___________中培养，离心收集小鼠的B 淋巴细胞，
与骨髓瘤细胞进行融合。
(4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔板，
进行___________培养。用___________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N 蛋白
胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集
___________，提取单克隆抗体。
(5)利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成___________，实现特异性治疗。
【答案】(1) 检测目的基因是否成功导入受体细胞 双分子层中
(2)蛋白质外壳和含N 蛋白胞外段基因的核酸
(3) 胰蛋白酶或胶原蛋白 CO2 培养箱
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(4) 克隆化 抗原抗体杂交 细胞培养液
(5)抗体-药物偶联物##ADC
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从
小鼠脾脏中获取已经免疫的B 淋巴细胞；诱导B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培
养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行
克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获
取单克隆抗体。
2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②
筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
【详解】（1）构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选
用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞
需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。
（2）由于目的基因为N 蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N
蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化
N 蛋白胞外段。
（3）进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细
胞悬液，置于含有95%空气和5%的CO2 混合气体的CO2 培养箱中培养。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔
板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能
产生N 蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收
集细胞培养液，提取单克隆抗体。
（5）利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治
疗。
17．（2022·浙江·统考高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者
进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下：
(1)取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠
获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇
溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提
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高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。
(2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm 和505nm 波
长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选
用505nm 波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。
(3)生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这
属于废弃物的无害化和__________处理。
（二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其
是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。
(4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA 为模板，利用__________酶
合成DNA，经PCR 扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异
的杂交分子则核酸检测为阳性。
(5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病
毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA 插入腺病毒基因
组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特
异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的
____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。
(6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的
____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的
杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素
和____________。
【答案】(1) 无菌水 活化 离心 破碎
(2) 其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液
(3) 灭菌 资源化
(4) 逆转录 核酸探针
(5) 抗原 载体 使腺病毒失去复制能力
(6) 脾 动物血清
【分析】1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、
煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微
生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活
菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面
连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
【详解】（1）防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获
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得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为
红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细
胞内的红曲色素释放出来。
（2）用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm 波长测定
的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是
用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。
（3）生产上提取红曲色素后的残渣，经灭菌处理残渣后，作为饲料添加剂或有机肥，
这属于废弃物的无害化和资源化处理。
（4）RNA 做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR 扩增，然后在扩增产物中加入特异
的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
（5）腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基
因为模板合成的DNA 插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内
表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作
为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能
力。
（6）单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使
其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细
胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。
【点睛】本题考查微生物的分离与培养等相关知识，要求考生识记培养基的成分、无
菌技术、微生物分离的过程，能正确理解图形和表格中隐含的知识和结论。
18．（2023·北京西城·统考一模）人β 防御素（由H 基因编码）是一种抗菌肽，科研
人员欲利用酵母对其进行生产。
(1)获得H 基因的序列信息后，可以其cDNA 为模板通过_____方法获得该基因。
(2)由于人β 防御素会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H 的酵母菌最大种群数
量偏低，限制了最终产量。科研人员在酵母菌基因组DNA 中插入Р 和S 基因，使质粒
上H 基因的表达受到红光控制。红光调控H 基因表达的原理如图1 所示。
P 和S 基因应为_____（填“组成型表达”或“红光诱导表达”）。
(3)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F 蛋白可使酵母
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细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统（图2），在酵
母菌基因组中插入了2 个E 基因，使F 基因的表达受到蓝光控制（图3）。
图3 中两个E 基因作用分别是_____。
(4)工程菌泄露到环境中可能引发环境问题。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T 和
L）和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N 的表达，进
而诱导工程菌死亡（图4）。
图4 中①②应选用的启动子为：①_____，②_____。
A．Jub B．ACT C．CYC
图4 中③④处结合的阻遏蛋白为：③_____，④_____。
a、T 蛋白 b、L 蛋白
(5)写出利用该工程菌发酵生产人β 防御素的步骤。_____
【答案】(1)PCR
(2)组成型表达
(3)左侧E 基因：照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E 蛋白，进而激活F 基因
表达
右侧E 基因：使细胞中始终含有少量E 蛋白，保持接受蓝光信号的能力
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(4) ①C ②A ③a ④b（或①A ②C ③a ④b）
(5)
第1 步
黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适
第2 步
红光照射至人β 防御素在培养液中达到适宜浓度
第3 步
蓝光照射至工程菌凝集，回收发酵产物
第4 步
红光蓝光同时照射，杀死工程菌
【分析】引 物 是 一 小 段 能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
用于PCR 的引物长度通常为20〜30 个核苷酸。引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端
开始连接脱氧核苷酸。
【详解】（1）已知基因序列信息后，可制作引物，其cDNA 为模板通过PCR 技术获
得目的基因。
（2）组成型表达即持续表达，从图1 分析，S 蛋白与启动子结合，当存在红光时P 蛋
白与S 蛋白结合导致H 基因表达，说明P 和S 蛋白一直存在，是否结合会影响H 基因
的表达，P 和S 基因是组成型表达。
（3）左侧E 基因的启动子是CYC，照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E 蛋
白，进而激活F 基因表达；右侧E 基因的启动子是ACT，为组成型表达的弱启动子，
使细胞中始终含有少量E 蛋白，保持接受蓝光信号的能力。
（4）从图中分析，蓝光照射时可使CYC 启动子后续基因表达，红光照射时可使Jub
启动子后续基因表达，①②位置选择这两种启动子可保证酵母细胞在红光和蓝光同时
照射时才激活致死基因N 的表达，①②位置这两种启动子位置可颠倒。为了保证酵母
细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N 的表达，当④位置是L 蛋白结合位点、
③位置是T 基因结合位点时，红光和蓝光同时照射时T 基因表达的T 蛋白与③位点结
合，阻止了L 基因的表达，使N 基因可以表达而致死。
（5）根据题目信息，红光照射使产物增多，蓝光照射使产物凝集，红蓝光同时照射使
工程菌死亡，故第一步应在黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适，第二步红光
照射至人β 防御素在培养液中达到适宜浓度，第三步蓝光照射至工程菌凝集，回收发
酵产物；第四步红光蓝光同时照射，杀死工程菌。
19．（2023·天津河西·统考一模）赤霉素与其受体GID 结合后，可以促进植物茎秆伸
长。蓝光能够激活蓝光受体CRY，抑制赤霉素的作用，为探究该机理，研究者分别构
建了含有His-CRY 和GST-GID 融合基因的表达载体，表达出相应的融合蛋白。His 和
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GST 均为短肽，它们与其他蛋白形成的融合蛋白能与His 或GST 抗体结合，且不影响
其他蛋白的结构和功能。
(1)构建含上述融合基因的表达载体。
①结合图1 分析，欲使His 短肽连在CRY 的氨基酸序列前面（氨基端），则应在
___________（填“F 引物”或“R 引物”）的5'端加上His 短肽的编码序列。
②为使融合基因能与载体相连接，还需在F 引物和R 引物上添加相应的酶切位点序列，
该序列应该位于His 短肽编码序列的___________（填“5'”或“3'”）端。
③用同样的方法扩增CST-GID 融合基因，并构建相关表达载体。
(2)将两个表达载体同时导入拟南芥细胞，一段时间后裂解细胞，将含有His 抗体的磁
珠加入裂解液中，充分孵育后收集磁珠，将磁珠上的蛋白（磁珠蛋白）分离下来，进
行抗原抗体杂交，结果如图2。
①对细胞裂解液蛋白进行抗原—抗体杂交的目的是确定His-CRY 和GST-GID 这两个融
合基因在拟南芥细胞已正常_________________。对磁珠蛋白进行His 抗体检测的目的
是确定磁珠上的His 抗体可以结合_________________。
②图示结果说明，蓝光的作用机理是光激活CRY 后，CRY 与______________结合，使
赤霉素无法发挥作用，从而抑制赤霉素的作用。
【答案】(1) F 引物 5'
(2) 表达 His 短肽 赤霉素受体GID
【分析】基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目
的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因工程至少需要三种工具：限制性
核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、载体。
【详解】（1）①由图1 可知，欲使 His 短肽连在 CRY 的氨基酸序列前面(氨基端)，
即获得“ 3’—His 短肽—CRY 基因—5’ ”的基因表达载体，由图可知CRY 基因的
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3’端对应的为F 引物，即要将 His 短肽加在 CRY 的氨基端，应在 CRY 基因模板链
的 3’端上加 His 短肽编码序列，对应的是 F 引物；而且加上的 His 序列不与 CRY
转录模板配对，所以只能加在 F 引物 5’端，才能保证引物与模板配对后可以正常延
伸。
②为使融合基因能与载体相连接，酶切位点序列应该位于F 引物的3’ 端，His 短肽编
码序列的5’端。
（2）①为确定 His-CRY 和 GST-GID 这两个融合基因在拟南芥细胞中已正常表达，
应对细胞裂解液蛋白进行抗原-抗体杂交，并且为了确定磁珠上的 His 抗体可以结合
His 短肽，对磁珠蛋白进行 His 抗体检测。
②由题意可知，蓝光可以激活蓝光受体CRY，抑制赤霉素的作用，分析图2，对细胞
裂解液蛋白进行抗原-抗体杂交，无论黑暗或蓝光条件下，均具有条带，但含有His 抗
体的磁珠蛋白组，黑暗条件下没有检测到GST 条带，但蓝光组出现了GST 条带，说明
蓝光激活 CRY 后，CRY 与赤霉素受体 GID 结合，使赤霉素无法发挥作用，从而抑
制赤霉素的作用。
20．（2023·山西·校联考模拟预测）URA3 是酵母菌V 号染色体上的一个基因，能编码
相关酶参与酵母菌RNA 嘧啶核苷酸的合成。实验人员利用甲基磺酸乙酯（EMS）对酵
母菌进行诱变处理，获得酵母菌尿嘧啶营养缺陷株，并对其进行了筛选。回答下列问
题：
(1)实验小组为了检测EMS 诱变的致死率，将酵母菌液离心后收集细胞，再将悬浮细胞
置于加入EMS 的无菌磷酸缓冲液中，对照组的处理为______，一段时间后利用
________法将菌液接种到平板上，并统计对照组和诱变组的菌落数，EMS 诱变的致死
率的公式可表示为_______。
(2)为了筛选尿嘧啶缺陷酵母菌，实验小组将完全培养基中的诱变组菌落用无菌牙签分
别在尿嘧啶缺陷型极限培养基和完全培养基中进行点接，前后位置及编号一一对应，
两培养基的菌落情况如图所示，则图中编号为______的菌株为尿嘧啶缺陷酵母菌，判
断理由是_______。
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(3)现有多株尿嘧啶缺陷型酵母菌、含有URA3 基因的重组载体YE 等材料，试设计实
验验证这些菌株为尿嘧啶缺陷型菌株_______。重组载体YE 中的URA3 基因可起到标
记基因的作用，标记基因在基因工程中的作用是________。
【答案】(1) 将（等量的）悬浮细胞置于不含EMS 的无菌磷酸缓冲液中 稀
释涂布平板 致死率=（对照组菌落数-诱变组菌落数）÷对照组菌落数×100%
(2) b、c b、c 菌落在完全培养基上能繁殖，但是不能在尿嘧啶缺陷型极限培养基
上繁殖
(3) 将尿嘧啶缺陷型酵母菌随机均分为甲、乙两组，将含有URA3 基因的重组载体
YE 导入甲组菌株，将不含URA3 基因的载体导入乙组菌株，结果发现甲组菌株能在尿
嘧啶缺陷培养基上繁殖，乙组菌株不能在尿嘧啶缺陷培养基上繁殖 用于重组
质粒的筛选和鉴定
【分析】根据题意分析，实验组为将悬浮细胞置于加入EMS 的无菌磷酸缓冲液中，故
应将（等量的）悬浮细胞置于不含EMS 的无菌磷酸缓冲液中作为空白对照组。
【详解】（1）根据题意分析，实验组为将悬浮细胞置于加入EMS 的无菌磷酸缓冲液
中，欲计算EMS 诱变处理的致死率，应将（等量的）悬浮细胞置于不含EMS 的无菌
磷酸缓冲液中作为空白对照组。由于要统计菌落的数目，因此要用稀释涂布平板法将
菌液接种到平板上，并统计对照组和诱变组的菌落数。致死率的计算公式为：致死率=
（对照组菌落数-诱变组菌落数）÷对照组菌落数×100%。
（2）根据图中的实验结果可知，由于b、c 菌株能在完全培养基上繁殖，但是不能在
尿嘧啶缺陷型极限培养基上繁殖，故菌株b 和c 是尿嘧啶缺陷酵母菌。
（3）为了验证该菌株是否为尿嘧啶缺陷型菌株，基本思路是将尿嘧啶缺陷型酵母菌随
机均分为甲、乙两组，将含有URA3 基因的重组载体YE 导入甲组菌株，将不含URA3
基因的载体导入乙组菌株，结果发现甲组菌株能在尿嘧啶缺陷培养基上繁殖，乙组菌
株不能在尿嘧啶缺陷培养基上繁殖，说明这些菌株为尿嘧啶缺陷型菌株；重组载体YE
中的URA3 基因可起到标记基因的作用，标记基因的作用是用于重组质粒的筛选和鉴
定。
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