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专题10 生物技术工程
命题点
真题在线
常见设问/关键词
微生物的选
择培养和计
数
2023·山东·T15 2023·广东·T10 2023·北京·T16 2022·全国甲·T37
2022·全国乙·T37 2022·广东·T21 2021·江苏·T18
设问关键词：限制酶
的选择、目的基因的
鉴定、PCR 过程
植物体细胞
杂交技术
2023·广东·T12 2023·江苏·T13 2023·浙江1 月选考·T24 2021·福
建·T11
2020·北京·T13 2020·山东·T13
动物细胞融
合和单克隆
抗体的制备
2023·北京·T12
2023·湖北·T22 2022·山东·T15 2022·福
建·T13
2021·山东·T15 2021·江苏·T11 2020·全国Ⅰ·T38
基因工程的
基本操作程
序
2023·全国乙·T38 2023·全国甲·T38 2023·湖北·T4 2023·广东
·T20
2021·广东·T22
DNA 片段的
扩增与电泳
鉴定
2023·江苏·T22 2023·山东·T25 2023·浙江6 月选考·T19 2022·辽
宁·T12 2022·江苏·T24 2021·山东·T25 2021·全国甲·T38
几种不同
PCR 的应用
2023·江苏·T22 2023·山东·T25 2022·江苏·T24 2022·山东·T25
2021·全国甲·T38 2021·山东·T25 2020·北京·T12 2020·江苏·T33
命题预测
基因表达载体的构建；标记基因的选择
本节导航
模板01 酶切位点的选择-既要相同又要不同
模板02 双标记筛选金标准—二去其一是为真
识·命题特点 明命题特点、窥命题预测
明·答题模板 答题要点
+ 答题技巧
+ 模板运用
练·高分突破 模板综合演练，快速技巧突破
1
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关键技巧
目的基因和载体的酶切和连接是设计的核心；根据题目的具体信息判断保留和破坏的标记
基因的类型
模板01 酶切位点的选择-既要相同又要不同
【核心】相同黏性末端，正确连接方向
酶切位点的选择实际上有许多需要考虑的逻辑，但核心点是两个：
要保证质粒和目的基因的黏性末端相同，才能让质粒和目的基因的黏性末端相互连接。
要保证基因的头对着启动子，尾对着终止子，才能保证正确的转录。
除这两个原则之外，很多题目还会有额外的信息，如基因中间或质粒其他位置存在相同酶切位点、同尾酶
等，要根据题目信息具体判断。
【基本知识】
（1）限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
（2）限制酶的选择
2
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1.不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
2.保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽
量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些
标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的
“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
3.善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的
基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即
“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA 连接
酶连接后形成的重组DNA 分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA 聚合酶的移动方向”)必
须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
4.巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，
可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
技巧
01
酶切位点的选择
- 既要相同又要不同
研究人员为寻求炎症性疾病的高敏感检测方法，以重组S100A8 蛋白作为免疫抗原，制备了抗S100A8 蛋白
的单克隆抗体。下图是重组S100A8 蛋白的制备过程，结合下表4 种相关限制酶的识别序列和切割位点，可
知切割质粒的限制酶为（ ）
（注：S100A8 蛋白是炎症反应时高度表达的一种蛋白质，可作为炎症性疾病诊断的重要标志物。）
HindⅢ
NcoⅠ
BglⅡ
XhoⅠ
3
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5＇-A↓AGCTT-3＇
5＇-C↓CATGG-3＇
5＇-A↓GATCT-3＇
5＇-C↓TCGAG-3＇
A．Hind III 和NcoⅠ
B．BglⅡ和XhoⅠ
C．NcoⅠ和XhoⅠ
D．HindⅢ和BglⅡ
【技巧点拨】【核心】相同黏性末端，正确连接方向-要保证质粒和目的基因的黏性末端相同，才能让质粒
和目的基因的黏性末端相互连接；要保证基因的头对着启动子，尾对着终止子，才能保证正确的转录。
【思路详解】依据题干信息，S100A8 蛋白基因经切割后所产生的黏性末端为5'CATG3'、5'TCGA3'，依据表
格中限制酶的识别序列，可知，HindⅢ产生的黏性末端为5'AGCT3'，NcoⅠ产生的黏性末端为
5'CATG3'（与目的基因一端的粘性末端能碱基互补），BglⅡ产生的黏性末端为5'GATC3'，XhoⅠ产生的黏
性末端为5'TCGA3'（与目的基因另一端的粘性末端能碱基互补），为了确保目的基因和质粒的正向连接，
防止自身环化，故应选择两种能产生不同的黏性末端的限制酶，所以可选NcoⅠ和XhoⅠ进行切割质粒，
C 正确，ABD 错误。
【答案】C
研究人员用酶
和酶
两种限制酶同时处理某DNA 分子和质粒，得到的DNA 片段如图所示。图中DNA 片
段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是（ ）
A．该DNA 分子和质粒上均含有酶
的一个切割位点和酶
的一个切割位点
B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C．用T4D NA 连接酶或E.coli DNA 连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA 分子
模板02 双标记筛选金标准—二去其一是为真
4
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【核心】失去一个标记基因的载体才是好载体
双标记让载体具有两个标记性状，如四环素抗性和青霉素抗性，在基因表达载体的构建中会破坏其中一个，
如破坏四环素抗性，含有目的基因的基因表达载体此时只有青霉素抗性，而空载体依然具有四环素抗性和
青霉素抗性，通过在培养基中添加四环素，可以区分出含有目的基因的载体和空载体。
1. 标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的
能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能抵抗相
应抗生素，所以在受体细胞的培养基中加入该种抗生素就可以只保留成功转入载体且抗生素抗性基因表达
的受体细胞。
2. 双标记原理
（1）单标记的区分问题：仅有一个标记基因时，含有目的基因的载体和空载体都有标记，在筛选时无法
区分。
（2）双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗
性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环
素抗性基因失活。
筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组载体的细菌和含空载体的细菌，
如图中1、2、3、4、5 菌落，再利用灭菌的绒布将上述5 个菌落影印到含有四环素的培养基上，如上图，
能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图中1、5 菌落。
最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5 菌落进行培养。
3. 标记基因的作用：在宏观水平上看到微观分子的变化，例如抗生素抗性基因作为标记基因时，可以用
抗生素筛选出具有抗药性的菌落，从而快速对转基因的结果进行鉴定。标记基因本身也是一个能正常表达
的基因，具有自己的启动子和终止子。
4. 受体细胞不同，标记基因种类也不同：受体细胞为细菌时，标记基因通常是抗生素抗性基因；受体细
5
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胞为真核细胞，尤其是动植物细胞时，抗生素很多时候不能杀死未标记的细胞，无法起到筛选的效果，此
时标记基因通常选择荧光基因等。
技巧02 失去一个标记基因的载体才是好载体
（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质
粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），
并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
【技巧点拨】【核心】失去一个标记基因的载体才是好载体-双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素
抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。
【思路详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A
正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中
的菌落，不一定含有目的基因，B 正确；
C、DNA 凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA 片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构
建成功与否，C 正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因
（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet 的培养
基中不能形成菌落，D 错误。
【答案】D
6
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（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将目的基因
（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切
割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
1．Sau3AI 和BamHI 的识别序列及切割位点如表所示。某DNA 分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，
可形成4 个和2 个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是（ ）
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHI
G↓GATCC
7
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Sau3AI
↓GATC
A．两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同
B．能被Sau3AI 识别的DNA 位点均能被BamHI 识别
C．该DNA 分子上有2 个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点
D．该DNA 分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ共同切割后可形成6 个片段
2．大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在
上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列
关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA 时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶I 和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
3．BamHI、MboI、SmaI 三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5'-G↓GATCC-3'、5'↓GATC-3'、5′-
CCC↓GGG-3'。下图表示某DNA 片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列
叙述正确的是（ ）
A．若用SmaI 完全切割该DNA，则其产物的长度为634bp、896bp、758bp
B．若虚线方框内的碱基对被T-A 替换，则用SmaI 完全切割该DNA 可产生3 种片段
C．若用MboI 和BamHI 切割DNA，可形成相同的黏性末端
D．用SmaI 切割DNA 产生的片段，可用E．coliDNA 连接酶重新将其连接
8
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4．从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所
用的限制酶是（ ）
A．②，BamHⅠ
B．①，EcoRⅠ
C．①，EcoRⅠ和HindⅢ
D．②，EcoRⅠ和HindⅢ
5．如图表示利用新冠病毒包膜表面的S 蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2 是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其
表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n 分别是启动子和终止子。下表
中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（ ）
限制酶
BamHⅠ
NheⅠ
NcoⅠ
SphⅠ
Sau3AⅠ
识别序列和酶切位点
5'-G↓GATCC-3'
5'-G↓CTAGC-3'
5'-C↓CATGG-3'
5'-GCATG↓C-3'
5'-↓GATC-3'
A．过程①所需的酶是逆转录酶和DNA 聚合酶
B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcoⅠ
C．据图推测，目的基因S 转录的模板链最可能是b 链
D．SUC2 可作标记基因，对导入B 的酵母菌进行筛选
6．下列有关实验操作的说法，正确的是（ ）
A．克隆时，用
载体或蛋白酶合成抑制剂激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程
B．电泳时，将PCR 产物与含有染色剂的凝胶载样缓冲液混合后，加入点样孔
C．提取DNA 时，在研磨液中加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液
9
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D．体外受精时，用高浓度的ATP 溶液处理采集到的精子使其获能
7．由于PCR 扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P 将目的基因
接入载体E，图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（ ）
A．构建重组载体P 时，应选择EcoRV 或SmaI 进行酶切，再用T4DNA 连接酶连接
B．要使中间载体P 接入载体E，同时防止自身环化，可选用XhoI 和PstI 进行酶切
C．载体P 不能作为基因表达载体，因为它不含起始密码子和终止密码子
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞
8．如图表示利用新冠病毒包膜表面的S 蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2 是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其
表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n 分别是启动子和终止子。下表
中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（ ）
限制酶
BamHⅠ
NheⅠ
NcoⅠ
SphⅠ
Sau3AⅠ
识别序列和酶切位点
A．过程①所需的酶是逆转录酶和DNA 聚合酶
B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcoⅠ
C．据图推测，目的基因S 转录的模板链最可能是b 链
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D．SUC2 可作标记基因，对导入B 的酵母菌进行筛选
9．转Bt 基因抗虫棉可以有效杀死棉铃虫，其原理是Bt 基因表达的产物Bt 抗虫蛋白能与棉铃虫肠道上皮细
胞表面的特异性受体结合，使细胞膜穿孔，导致棉铃虫死亡。下列相关叙述错误的是（ ）
A．转Bt 基因抗虫棉的培育利用的原理是基因重组
B．Bt 基因在抗虫棉细胞中表达需要经过转录和翻译过程
C．培育转基因抗虫棉时，导入Bt 基因的受体细胞不能是棉花的叶肉细胞
D．若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，可能会影响抗虫效果
10．某科研小组用PCR 扩增酵母菌的rRNA 基因。PCR 包括多个循环，每个循环可以分为变性、退火、延伸
3 个步骤。下列叙述正确的是（ ）
A．设计引物时需知道rRNA 基因的部分序列
B．延伸时间取决于酵母菌基因组DNA 的长度
C．引物浓度大小不会影响PCR 扩增获得酵母菌rRNA 基因的数量
D．PCR 反应前常对微量离心管进行离心以确保反应液分散于管内
11．利用pBR322 质粒将人胰岛素基因导入大肠杆菌（如图1）可进行工业化生产。为检验基因表达载体是
否成功导入，将处理后的大肠杆菌接种在培养基上，长出的四个菌落用无菌纸分别盖印至四种不同的培养
基上（如图2，菌落相对位置不变），菌落生长状况如图所示，则成功导入基因表达载体的菌落是（ ）
A．菌落1、2、3
B．菌落1
C．菌落2、3
D．菌落4
12．乙肝病毒基因工程疫苗的生产和使用流程如图，质粒中LacZ 基因可使细菌能够利用物质X-gal，从而使
菌落呈现蓝色，若无该基因，菌落则呈白色。下列叙述错误的是（ ）
11
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A．过程①中目的基因和载体重组的效率与载体和目的基因的浓度及比例等有关
B．过程②需要在培养基中加青霉素和X-gal 以获得呈蓝色的大肠杆菌菌落
C．大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，可用抗原—抗体杂交法进行检测
D．该基因工程疫苗不会出现乙肝病毒感染和增殖的情况，安全性高
13．在人胰岛素A 链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β-半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端，
插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性β-半乳糖苷酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛
素A 链，回答下列问题：
(1)使用限制酶 和 对质粒和插入DNA 片段进行切割。
(2)在转化大肠杆菌前，一般先用 处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA 分子的生理状态。
(3)重组DNA 分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA 聚合酶首先结合的位点是 。
(4)将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X-gal 的培养基中培养，若观察到 色菌落，可以确
定大肠杆菌成功表达胰岛素A 链，原因是 。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA 分子，在不考虑
突变的情况下，这些菌落不含重组DNA 分子的原因是 。
(5)溴化氰可以在甲硫氨酸残基C 端切割肽链，成熟的人胰岛素A 链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫
氨酸残基C 端切割的目的是 。
14．科研人员利用图1 所示材料构建重组质粒并导入大肠杆菌，以期获得能监测生物组织或环境中四环素
水平的“报警器”。限制酶识别序列及切割位点如下表。TetR 基因是一种转录调节基因，GFp 基因为绿色
荧光蛋白基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori 为复制原点。请回答下列问题：
12
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限制酶
EcoRⅠ
XbaⅠ
SpeⅠ
BamHⅠ
识别序列及切割位点
(1)使用工具酶拼接DNA 片段1 和2，拼接后的片段连接处部分序列为5＇ 3＇（写出6 个碱基），TetR
基因和GFP 基因转录的模板链 （“是”或“不是”）该拼接DNM 的同一条链。
(2)构建重组质粒时，选择 对质粒和拼接的DNA 片段进行酶切，在DNA 连接酶的作用下恢复 键。
再根据 的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。
(3)将重组质粒导入经 理的大肠杆菌后，在含 的固体培养基中筛选出工程菌。
(4)工程菌监测四环素的原理如图2，当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌 （能/不能）发出荧光，
其原因是 。
13
