文档文本内容
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专题十二 基因工程
考情概览：解读近年命题思路和内容要求，统计真题考查情况。
2024 年真题研析：探寻常考要点，真题分类精讲，归纳串联解题必备知识。
近年真题精选：分类精选近年真题，把握命题趋势。
必备知识速记：总结易错易混点。
名校模拟探源：精选适量名校模拟题，发掘高考命题之源。
命题解读
考向
考查统计
本部分的命题以非选择题为
主，属于高考必考内容。题目内容
多，难度往往较大，试题情境新颖，
大多来自大学教材和最新的论文文
献，核心素养侧重对科学思维和科学
探究的考查。
考向一 基因工程的基本工具
2024·湖南·T5
2024·江西·T12
2023·新课标·T6
2021·全国乙
·T38 2021·湖
北·T7
考向二 基因工程的基本操作程序
2024·甘肃·T21
2024·贵州·T21
2023·全国乙
·T38 2023·全
国甲·T38
2023·湖北·T4
2023·广东·T20
考向三 基因工程的应用
2024·河北·T5
2022·河北·T24
2022·广东·T22
2022·全国乙
·T38 2021·河
北·T24
考向四 蛋白质工程的原理和应用
2022·湖南·T22
2021·辽宁·T14
2022·重庆·T3
考向五 DNA 的粗提取与鉴定
2024·湖南·T5
2024·山东·T13
2023·广东·T11
2022·山东·T13
2021·山东·T13
考向六 生物技术的安全性与伦理问题
2024·广东·T18
1
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2023·浙江选考
·T2
2022·北京·T21
试题精讲
考向一 基因工程的基本工具
1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时，发现DNA 完全没有被酶切，分析可能的原
因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA 甲基化不敏感的限制酶
2.（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催
化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S 的L-谷氨
酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株
E．coliB。下列叙述正确的是（ ）
A．上图表明，可以从酿酒酵母S 中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB 发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA 和E．coliB 都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ构建重组质粒
考点解读
限制酶的选择原则
2
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(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限
制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Pst Ⅰ；为避免目的基
因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst Ⅰ和
EcoR Ⅰ两种限制酶。
考向二 基因工程的基本操作程序
1.（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解
效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混
合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高
产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。
(3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状
态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的
原因是 （答出两点）。
生物质原料
降解率（%）
协同系数
酶A
酶B
酶C
混1
混2
混1
混2
小麦秸秆
7.08
6.0
3
8.19
8.61
26.9
8
74.33
114.64
3
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玉米秸秆
2.62
1.4
8
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉米芯
0.62
0.4
8
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
注：混1 和混2 表示三种酶的混合物
2．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A 的野生型（含NV 基
因）、突变体（NV 基因突变）和转基因菌株（转入NV 基因），检测三种菌株NV 酶的生成与培养液中的葡
萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。
检测用菌
株
蔗糖
NV 酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
突变体
+
—
—
转基因菌
株
+
+
+
回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV 基因表达。NV 酶的作用是 。检测NV 酶活性时，需测定
的指标是 （答出1 点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA 随机插入野生型菌株基因组DNA 筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组
DNA 作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV 基因”）配对的引物进行PCR 扩增。若突变体扩
增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基
因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将NV 基因导入 细胞获得的。在构建NV
基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
考点解读
1.将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通
道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti 质粒
的T－DNA 中→农杆菌→
导入植物细胞→整合到受
体细胞的染色体DNA 上→
将含有目的基因的表
达载体提纯→取卵(受
精卵)→显微注射→受
精卵发育→获得具有
Ca2＋处理细胞→细胞处
于一种能吸收周围环境中
DNA 分子的生理状态→基
4
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表达
新性状的动物
因表达载体导入
2.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti 质粒的T－DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－
DNA 拼接到受体细胞的染色体DNA 上；第一次导入是将含目的基因的Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非
人工操作)是指含目的基因的T－DNA 导入受体细胞。
3．目的基因的检测与鉴定
考向三 基因工程的应用
1.（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造
为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN 疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1 所示。其中GtP 为启动子，若使r2HN 仅在水稻胚
乳表达，GtP 应为 启动子。Nos 为终止子，其作用为 。r2HN 基因内部
不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN 基因与载体进行酶切，用于
表达载体的构建。
(2)利用 方法将r2HN 基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN 表达情况，可通过PCR 技术检测
，通过 技术检测是否翻译出r2HN 蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN 纯
合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。
(4)制备r2HN 疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内
抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的
细胞（细胞毒性T 细胞）水平，结果如图2 所示。据此分析，
获得的r2HN 疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。
5
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(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN 疫苗的优点是 。（答出两点即
可）
考点解读
1．乳腺生物反应器
(1)操作过程
(2)比较乳腺生物反应器与膀胱生物反应器
①乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生
产药用蛋白，二者的优点：产量高、质量好、成本低、易提取，且不会对动物造成伤害。
②乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌
雄动物均可生产药用蛋白。
考向四 DNA 的粗提取与鉴定
1.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低
B．利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA 在不同浓度NaC1 溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA 粗提物
D．将溶解的DNA 粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
2．（2024·山东·高考真题）关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
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B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
3．（2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三
磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加
入ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；
PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述
正确的是（ ）
A．上述PCR 反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为G
考点解读
1．DNA 的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA 分子的断裂，导致DNA 分子不能形成丝状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA 时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加入物质的量浓度为2 mol/L
的NaCl 溶液；在实验组试管中加入DNA 丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看
到加入DNA 丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA 量太少。
2．DNA 片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压
灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需
试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污
染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
考向五 生物技术的安全性与伦理问题
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1.（2024·浙江·高考真题）关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是（ ）
A．试管动物的培育
B．转基因食品的生产
C．治疗性克隆的研究
D．生物武器的发展和生产
2.（2024·广东·高考真题）遗传性牙龈纤维瘤病（HGF）是一种罕见的口腔遗传病，严重影响咀嚼、语音、
美观及心理健康。2022 年，我国科学家对某一典型的HGF 家系（如图）进行了研究，发现ZNF862 基因突
变导致HGF 发生。
回答下列问题：
(1)据图分析，HGF 最可能的遗传方式是 。假设该致病基因的频率为p，根据最可能的遗传方式，
Ⅳ2生育一个患病子代的概率为 （列出算式即可）。
(2)为探究ZNF862 基因的功能，以正常人牙龈成纤维细胞为材料设计实验，简要写出设计思路： 。
为从个体水平验证ZNF862 基因突变导致HGF，可制备携带该突变的转基因小鼠，然后比较 的差异。
(3)针对HGF 这类遗传病，通过体细胞基因组编辑等技术可能达到治疗的目的。是否也可以通过对人类生殖
细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传病？作出判断并说明理由 。
考向一 基因工程的基本工具
1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有目的基
因的DNA 片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的
是（ ）
8
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A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
2．（2021·湖北·高考真题）限制性内切酶EcoRI 识别并切割
双链DNA，用EcoRI 完全
酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA 片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6
B．250
C．4000
D．24000
3.（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为抗原来
制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原
代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
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考向二 基因工程的基本操作程序
1．（2023·辽宁·高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和转
运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过
程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
2.（2022·湖南·高考真题）中国是传统的水稻种植大国，有一半以上人口以稻米为主食。在培育水稻优良
品种的过程中，发现某野生型水稻叶片绿色由基因C 控制。回答下列问题:
(1)突变型1 叶片为黄色，由基因C 突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死。突变型1 连续自交3 代，F3成
年植株中黄色叶植株占 。
(2)测序结果表明，突变基因C1转录产物编码序列第727 位碱基改变，由5＇-GAGAG-3＇变为5＇-GACAG-3
＇，导致第 位氨基酸突变为 ，从基因控制性状的角度解释突变体叶片变黄的机理
。（部分密码子及对应氨基酸:GAG 谷氨酸;AGA 精氨酸;GAC 天冬氨酸;ACA 苏氨酸;CAG 谷氨酰胺）
(3)由C 突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。从突变型1 叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限
制酶处理后进行电泳（电泳条带表示特定长度的DNA 片段），其结果为图中 （填“I”“Ⅱ”或
“Ⅲ”）。
(4)突变型2 叶片为黄色，由基因C 的另一突变基因C2所致。用突变型2 与突变型1 杂交，子代中黄色叶植
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株与绿色叶植株各占50%。能否确定C2是显性突变还是隐性突变? （填“能”或“否”），用文字说
明理由 。
3．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果
酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1 为
本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中ME 含
量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
考向三 蛋白质工程的原理和应用
1．（2022·重庆·高考真题）将人胰岛素A 链上1 个天冬氨酸替换为甘氨酸，B 链末端增加2 个精氨酸，可
制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（ ）
A．进入人体后需经高尔基体加工
B．比人胰岛素多了2 个肽键
C．与人胰岛素有相同的靶细胞
D．可通过基因工程方法生产
2．（2021·辽宁·高考真题）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利
用蛋白质工程技术在N0的α 和β 亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下
列有关叙述错误的是（ ）
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A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
3.（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，
具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a 是 ，物质b 是 。在生产过程中，物质b 可能不同，合
成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利
用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图
所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导
致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要
写出实验设计思路 。
考向四 DNA 的粗提取与鉴定
1．（2022·山东·高考真题）关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA 降解
B．离心研磨液是为了加速DNA 的沉淀
C．在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA 中可能含有蛋白质
2．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤
液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对含量较高的白色丝状
物的处理方式是（ ）
A．加入适量的木瓜蛋白酶
B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟
C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精
D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L
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1.限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限
制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Pst Ⅰ；为避免目的基
因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst Ⅰ和
EcoR Ⅰ两种限制酶。
2.启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
本质
DNA
DNA
mRNA
mRNA
位置
目的基因上游
目的基因下游
mRNA 首端
mRNA 尾端
功能
RNA 聚合酶识别和结
合的部位，驱动基
因转录出mRNA
使转录在所需要
的地方停下来
翻译的起始信号
(编码氨基酸)
翻译的结束信号
(不编码氨基酸)
3．PCR
(1)原理：DNA 半保留复制。
(2)条件：DNA 模板、2 种引物、耐高温的DNA 聚合酶和4 种脱氧核苷酸。
(3)扩增过程
过程
说明
图解
变性
温度超过90 ℃时，双链DNA 解聚为
单链
复性
温度下降到50 ℃左右时，两种引物
通过碱基互补配对与两条单链DNA 结
合
延伸
温度上升到72 ℃左右时，溶液中的
4 种脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合
酶的作用下，根据碱基互补配对原则
合成新的DNA 链
(4)PCR 过程的两点提醒
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①复性不一定均为引物与DNA 模板结合。复性时，引物与DNA 模板的结合是随机的，也存在DNA 解开的两
条链的结合。
②PCR 反应的结果不都是所需的DNA 片段。因为第一次循环得到的DNA 片段只有一种引物，比所需的DNA
片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA 片段，这样的片段存在两种引物。
4.将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通
道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti 质粒
的T－DNA 中→农杆菌→
导入植物细胞→整合到受
体细胞的染色体DNA 上→
表达
将含有目的基因的表
达载体提纯→取卵(受
精卵)→显微注射→受
精卵发育→获得具有
新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞处
于一种能吸收周围环境中
DNA 分子的生理状态→基
因表达载体导入
5.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti 质粒的T－DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－
DNA 拼接到受体细胞的染色体DNA 上；第一次导入是将含目的基因的Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非
人工操作)是指含目的基因的T－DNA 导入受体细胞。
6．蛋白质工程
(1)目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
(2)操作手段：改造或合成基因。
(3)设计流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变
相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
7．DNA 的粗提取与鉴定的注意事项
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA 分子的断裂，导致DNA 分子不能形成丝状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA 时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加入物质的量浓度为2 mol/L
的NaCl 溶液；在实验组试管中加入DNA 丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看
到加入DNA 丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA 量太少。
8．DNA 片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压
灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需
试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污
染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
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(5)观察DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
1．（2024·湖北·三模）CRISPR-Cas9 基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA 修饰的技术。利用
CRISPR-Cas9 技术可以使红眼基因B 突变获得果蝇突变体，如图为技术原理图。下列相关叙述正确的是（
）
A．细胞内的Cas9 酶在配对区域定点剪切，引起果蝇发生染色体结构变异
B．该过程中，sgRNA 和Cas9 酶共同剪切DNA 的作用类似于限制酶的作用
C．敲除后需要DNA 聚合酶对DNA 上的切口进行修复
D．sgRNA 与红眼基因B 的部分序列配对，不会出现的碱基互补配对方式是A-T
2．（2024·黑龙江哈尔滨·模拟预测）下列关于生物学实验中所使用到酒精的叙述，错误的是（ ）
A．脂肪的检测实验中，用50%的酒精洗去浮色
B．DNA 分子鉴定时使用到95%的冷酒精
C．观察有丝分裂实验中，解离液包含体积分数为95%的酒精
D．低温诱导染色体数目变化的实验中，用95%的酒精冲洗卡诺氏液2 次
3．某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy 融合
基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是（
）
A．利用PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链
B．不能在同一反应体系中进行dsred2 基因和amy 基因的扩增
C．dsred2 基因和amy 基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D．杂交链延伸得到 dsred2-amy 融合基因的过程不需要加引物
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4．（2024·贵州黔南·二模）在生物的各项生命活动中，常涉及到“分离”和“结合”。下列有关“分离”
和“结合”的叙述正确的是（ ）
A．噬菌体侵染细菌的实验中，离心的目的是使噬菌体的DNA 与蛋白质分离
B．DNA 复制过程中，DNA 聚合酶和Taq 酶都可以使DNA 的两条母链分离
C．转录过程中，RNA 聚合酶需要和基因的起始密码子结合才开始合成RNA
D．翻译过程中，氨基酸结合在RNA 的3'端后运输至核糖体上进行肽链延伸
5．（2024·浙江·模拟预测）通过PCR 扩增可得到含有部分未知序列的DNA 片段的扩增产物，具体操作步骤
如下图所示，图中白色为未知片段，黑色为已知片段，M、N 为限制酶的识别序列，下列相关叙述错误的是
（ ）
A．已知片段中没有除了M 之外的其他限制酶的识别序列
B．将最终的PCR 产物进行测序即可知道未知片段的DNA 序列
C．该PCR 过程中所使用的引物应依据a、b 的序列进行设计
D．第一步酶切时可更换限制酶，只要所用限制酶的识别序列在已知片段中不存在即可
6．（2024·山东威海·二模）已知引发某传染病的病原体为RNA 病毒，该病毒表面的A 蛋白为主要抗原，其
疫苗生产和抗体制备的流程如下图所示。下列说法错误的是（ ）
A．过程①需要使用限制酶和DNA 连接酶
B．过程②是基因工程操作的核心步骤
C．过程③可用灭活的病毒诱导
D．抗A 蛋白的单克隆抗体可用于制备该传染病的抗原检测试剂盒
7．（2024·安徽合肥·三模）AK、DHDPS 是玉米中合成赖氨酸的两种关键酶，赖氨酸达到一定浓度就会与两
种酶结合抑制它们的活性，如图所示，因此玉米中赖氨酸含量比较低。将AK 中第352 位苏氨酸变成异亮氨
酸，DHDPS 中第104 位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米叶片和种子内游
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离的赖氨酸分别提高5 倍和2 倍。下列有关分析错误的是（ ）
A．玉米中赖氨酸含量比较低与负反馈调节密切相关
B．要替换AK、DHDPS 中的氨基酸需要通过改造相应基因来实现
C．改造后的AK 和DHDPS 与底物结合能力加强，导致玉米合成赖氨酸的能力增强
D．改造后的AK 和DHDPS 空间结构改变，与赖氨酸结合的能力降低
8．（2024·福建三明·三模）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，
具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。将提取的水蛭
蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。下列叙述错
误的是（ ）
A．水蛭蛋白经两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与其肽含量有关
B．酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露
C．要获得水蛭素的基因，可以从水蛭细胞中提取mRNA，经逆转录获得目的基因
D．上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构
9．（2024·广东·三模）蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时代。如通
过蛋白质工程，将干扰素结构上的两个半胱氨酸改为丝氨酸，就可以使其保存半年，而活性不受影响。下
列关于蛋白质工程的叙述，正确的是（ ）
A．蛋白质工程的操作流程与中心法则的方向相同
B．蛋白质工程需要改造或合成蛋白质的编码基因
C．对干扰素的改造无需考虑其空间结构
D．蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列
10．（2024·河北衡水·三模）真核细胞转座子有逆转录转座子（如图①）和DNA 转座子（如图②）之分，
可在染色体内部和染色体间转移。该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入到DNA
分子的特定位点中，具体机制如下图①和②所示。下列相关叙述正确的是（ ）
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A．转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键
B．转座引起的变异类型有基因突变、基因重组和染色体变异
C．DNA 转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变
D．逆转录转座子通常存在于外显子等不易于转录的区域
11．（2024·吉林长春·模拟预测）“DNA 粗提取与鉴定”的操作步骤为研磨→去杂→析出→鉴定。某研究组
欲探究不同去杂方法对实验结果的影响（如下表）。下列叙述正确的是（ ）
去杂质方式
沉淀质量
（g）
DNA 浓度
（ng·μL-1）
OD260/
OD280
二苯胺鉴定
离心
0.0680
81.50
1.53
蓝色
4℃冰箱静置
0.1028
336.4
1.41
蓝色
注：OD260与OD280的比值可检查DNA 纯度；纯DNA 的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明
显降低。
A．猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA 的材料
B．对研磨液进行离心的目的是加速DNA 的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．析出时的离心转速明显高于去杂质时
12．（2024·山东青岛·三模）科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD 和
3RBD，探究RBD 的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD 的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质
粒是否构建成功，将重组质粒用Nco I 和Sac I 双酶切处理后电泳，结果如图，其中泳道1 为双酶切
pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp 和2020bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达
产物的检测。下列说法正确的是（ ）
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A．PCR 扩增融合基因时，在引物的3′端添加相应限制酶的识别序列
B．据图可知，融合基因3RBD 的长度为2686bp
C．泳道2 呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149﹣3RBD 后产生的两个片段大小相近
D．从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性
13．（2024·山东济宁·三模）PCR 技术的实用性和极强的生命力其使成为生物科学研究的一种重要方法，极
大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR 技术应用，请根据资料回
答下列问题：
(1)重叠延伸PCR 技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR 扩增，
从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异
基因碱基的互补引物，然后分别与引物a 和引物d 做PCR，这样得到的两个PCR 引物产物都带有变异基因，
并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR 就能得到诱变PCR 产物，如图所示：
①PCR 扩增DNA 的过程中，引物a、b、c、d 中，PCRI 应选择图1 中引物 ，大量扩增突变产物
AD 则应选择引物 。
②重叠延伸PCR 通过 实现定点突变。PCR1 和PCR2 需要分别进行的原因是 。
③若正常基因可被限制酶DpnI 识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnI 识别，请设计实验思路鉴
定上述过程获得的突变产物AD 是否为突变基因： 。
(2)反向PCR 可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA 分子内侧是已知序列，外侧为未知序
列。
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①不直接在图2 中DNA 分子的两端设计引物并进行扩增，原因是 。
②图3 中环状DNA 进行PCR 的过程中，沿引物A 延伸子链的延伸方向是 （填“顺时针”或“逆
时针”），PCR 产物 （填“含有”或“不含”）EcoRI 的酶切位点。
14．（2024·广东·三模）肝纤维化与肝细胞癌的发生密切相关。研究发现活化的人肝星状细胞会大量合成
和分泌Ⅰ型胶原蛋白沉积在肝小叶的窦间隙，大量产生Ⅰ型胶原蛋白是肝星状细胞活化的标志之一。人Ⅰ
型胶原蛋白由4 条肽链组成，其中两条由COL1A1 基因编码。为了建立能直观反映I 型胶原蛋白表达量改变
的细胞模型，本研究旨在通过基因工程技术构建人COL1A1 和绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因表达载体，并
将其导入到LX-2 细胞（永生化的人肝星状细胞）中，为抗纤维化药物研发建立可视化的报告系统。
(1)研究过程中，应将LX-2 细胞置于含 的气体条件下培养。
(2)在构建基因表达载体过程中，所需要的工具酶有 （请写出2 点）；其中Kozak 序列能增强EGFP
基因的表达，已知EGFP 基因的α 链为转录的模板链，则应将图2 中EGFP 基因的 （“A”或“B”）
端与Kozak 序列连接。
(3)已知LX-2 细胞可被细胞因子TGF-β1 活化，激活COL1A1 基因表达，成为肝纤维化研究常见的细胞模型。
科学家为验证LX-2 细胞能通过EGFP 表达来反映表达COL1A1 能力的改变，进而筛选抗纤维化药物。对实验
进行了分组处理，对照组为无诱导处理的LX-2 细胞，模型组为 ，实验组为 （实验材料：LX-2
细胞、TGF-β1、已知具有潜在抗肝纤维化作用的药物青蒿琥酯）。实验结束后，检测各组LX-2 细胞荧光
强度和相关基因（COL1A1 和EGFP）的表达水平，二者相互印证。若实验组的荧光强度均低于模型组的荧光
强度，实验结果说明 。
15．（2024·山东菏泽·一模）酵母是一种能够引发有机源或者动物源物质发酵的真菌，它有许多分类，其
中酿酒酵母是知名度最高，也是与人类关系最广泛的一种酵母。我国是世界上啤酒生产和消费大国，啤酒
是以大麦为主要原料经酵母发酵制成的。请回答下列问题：
(1)为了制备啤酒酵母分离培养基，实验人员将马铃薯去皮切块后高压煮沸，过滤后补加蒸馏水至1L，加
入葡萄糖和琼脂后加热融化。将马铃薯高压煮沸的目的是 ，该培养基的碳源主要包括 ，用
于装培养基的培养皿一般用 法进行灭菌处理。
(2)啤酒在工业化生产过程中，发酵过程分为 两个阶段。第一阶段结束后，发酵液在
的环境下储存一段时间进行第二阶段，形成澄清、成熟的啤酒。
(3)下图所示为用酿酒酵母生产乙肝疫苗的过程图，回答相关问题：
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①研究人员拟用PCR 扩增目的基因片段，已知目的基因的一条链为5'—ATTCCATATC……CCATGCC—3'。在
PCR 反应体系中需加入缓冲液、引物、4 种脱氧核苷酸、含目的基因的DNA 模板以及 。设计了一条
引物为5'—GGCATG—3'，另一条引物为 （写出6 个碱基即可）。
②要形成有效的重组质粒，选择适当的限制酶很重要，根据图乙和图丙可知，选择 最佳，原因是
。
③在添加卡那霉素和四环素的培养基中有少量菌落，说明了 。
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