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专题18 基因工程
考点
三年考情（2022-2024）
命题趋势
考点1 基因工
程的基本工具
2024·山东、湖南、安徽、河北、山东
2023·重庆、广东、江苏
2022·山东
从近三年全国各地的高考试
题来看，常出现的考点是基因工
程的基本工具、基因工程的基本
操作程序和基因工程和蛋白质工
程的应用，此部分内容集中在非
选择题部分考察。
考点2 基因工
程的基本操作
程序
2024·山东、浙江、吉林、湖南、贵州、北京、
安徽、甘肃、广东、全国
2023·辽宁、湖北、浙江、山西、河北、辽宁、
山东、湖南、广东、全国
2022·辽宁、天津、重庆、江苏、河北、山东、
浙江、全国
考点3 基因工
程和蛋白质工
程的应用
2024·江西、浙江、河北
2023·湖南、天津
2022·浙江、湖南
考点01 基因工程的基本工具
1．（2024·山东）关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
1．A
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同 浓度的
氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出， 从而达
到分离的目的; ②DNA 不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白
质和DNA 进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、在DNA 的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分
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钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A 正确；
B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA 在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B 错误；
C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA 双螺旋结构会发生改变，C 错误；
D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5 分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察
到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D 错误。
故选A。
2．（2024·湖南）某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时，发现DNA 完全没有被酶切，分析可能的原因并提
出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA 甲基化不敏感的限制酶
2．B
【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高
效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA 上的特定位点。
【详解】A、限制酶失活会使DNA 完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A 正确；
B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH 等，调整酶的用量没有作用，B 错
误；
C、质粒DNA 突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C
正确；
D、质粒DNA 上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA 甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对
DNA 甲基化不敏感的限制酶，D 正确。
故选B。
3．（2024·安徽）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低
B．利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA 在不同浓度NaC1 溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA 粗提物
D．将溶解的DNA 粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
3．D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶液，
但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、研磨液有利于DNA 的溶解，换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低，A 正确；
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B、DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B 正确；
C、DNA 在NaCl 溶液中的溶解度随着NaCl 浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl 溶液对DNA 进行
粗提取，C 正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D 错误。
故选D。
4．（2024·河北）下列相关实验操作正确的是（ ）
A．配制PCR 反应体系时，加入等量的4 种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR 产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板
D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
4．B
【分析】PCR 的原理是DNA 复制，DNA 的单体是脱氧核糖核苷酸。琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与
DNA 分子结合，利用添加核酸染料的凝胶对PCR 产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。
【详解】A、PCR 的原理是DNA 复制，DNA 的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR 反应体系时，加入4 种脱
氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A 错误；
B、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA 分子结合，凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为
300nm 的紫外灯下被检测出来，B 正确；
C、将配制的酵母培养基高温灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C 错误；
D、将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死），蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D 错
误。
故选B。
5．（2024·山东）研究发现基因L 能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑
基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI 切点处插入大豆基因L 的向导DNA 序列，将载
体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、
目标基因L 部分序列及相关结果等如图所示。
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(1)用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目标基因L 时，所用的引物越短，引物特异性越 （填
“高”或“低”）。限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI 酶切大
豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI 酶切后，
载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为
了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，部分序列信
息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR 产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用
的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1 株基因L 成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1 条
染色体有T-DNA 插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植
株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
5．(1) 低 256 GTTT CAAT
(2) 卡那霉素 Sac
④
Ⅰ
(3)1/4
【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导
入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
2、PCR 是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基
因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR 可以快速的获取和扩增目的基因。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度
通常为20~30 个核苷酸。由此可知，在利用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目的基因时，所用的引物越
短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，
若用BsaI 酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来
推测，BsaI 切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256 种排列顺序，故答案应为 256。根据
图甲所示的载体信息，经BsaI 酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此
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可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L 的目标序列跟突变序
列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙
及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，并对
PCR 产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac
Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条
带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l 成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经
过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA 插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA 片段上，
因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA
（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为
1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用
于后续的品种选育。
6．（2023·重庆）某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA
片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（
）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
6．B
【分析】E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇
TGCGCAGT-3＇，A 正确；
B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI 切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI 切割形成
的，B 错误；
C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI 和CfoI 进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA 的序
列，切割之后至少获得了2 个片段，C 正确；
D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可
连接黏性末端，D 正确。
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故选B。
7．（2023·广东）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的
是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
7．D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的氯化
钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A 正确；
B、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl 溶液， 将溶液过滤，即可将混合物
中的多糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；
C、DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 纯度，C 正确；
D、将DNA 溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D 错误。
故选D。
8．（2023·江苏）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1 所
示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要
的不同是 。
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(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这
一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
8．(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度
(2)CD
(3)限制性内切核酸酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
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（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻
译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR
扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR 过程需
要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR 反应体系中，模板和引
物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽
量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq
DNA 聚 133 合酶为例，催化DNA 延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小
在 30s~2min 的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能与
AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中的右侧
部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，
由于PCR 产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核
酸酶（限制酶）和DNA 连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落
无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列，
因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
9．（2022·山东）关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA 降解
B．离心研磨液是为了加速DNA 的沉淀
C．在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA 中可能含有蛋白质
9．B
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【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯
化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出，从而达到分
离的目的；②DNA 不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和
DNA 进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、低温时DNA 酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA 降解，A 正确；
B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B 错误；
C、在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色，C 正确；
D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA 一块儿析
出，故粗提取的DNA 中可能含有蛋白质，D 正确。
故选B。
考点02 基因工程的基本操作程序
10．（2024·山东）制备荧光标记的DNA 探针时，需要模板、引物、DNA 聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA
聚合酶、扩增缓冲液、H2O 和4 种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP 和碱基被荧光标记的dATP）的反应
管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA 区遵循碱基互补配对原则，且
在本实验的温度条件下不能产生小于9 个连续碱基对的双链DNA 区。能得到带有荧光标记的DNA 探针
的反应管有（ ）
反应管
加入的单链DNA
①
5'-GCCGATCTTTATA-3'
3'-GACCGGCTAGAAA-5'
②
5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③
5'-ATTTCCCGATCCG-3'
3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④
5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①②
B．②③
C．①④
D．③④
10．D
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9 个连续碱基对的
双链DNA 区，要能得到带有荧光标记的DNA 探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含
有A。
【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA 可知，①中两条单链DNA 分子之间具有互补的序列，但
双链DNA 区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA 合成，不能得到带有荧光标记的DNA 探针；②中单链DNA
分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9 个连续碱基对的双链DNA 区，故一条
单链DNA 分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA 区，由于DNA 合成的链中不含碱基A，不能得到带
有荧光标记的DNA 探针；③中两条单链DNA 分子之间具有互补的序列，且双链DNA 区之外的3'端有模板和碱基
T，因此进行DNA 合成能得到带有荧光标记的DNA 探针；④中单链DNA 分子内具有自身互补的序列，一条单链
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DNA 分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA 区，且双链DNA 区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行
DNA 合成能得到带有荧光标记的DNA 探针。
综上，能得到带有荧光标记的DNA 探针的反应管有③④。
故选D。
（2024·浙江）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt 基因编码的蛋白，在第
76 位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感
患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt 基因的序列，设计了F1、F2、R1 和R2 等4 种备选引物，用于扩增目的片段，如图
甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA 为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所
示。
11．下列关于引物F1、F2、R1 和R2 的叙述，错误的是（ ）
A．F1-R1 引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2 引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2 为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2 引物可用于特异性地扩增目的片段
12．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6 份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶
ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6 号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A．1 号和6 号
B．2 号和4 号
C．3 号和5 号
D．1 号、2 号、4 号和6 号
11．D 12．B
【分析】引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度通常为
20~30 个核苷酸。
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11．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1 引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A 正确；
B、根据图乙信息可知，F1-R2 引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B 正确；
C、根据图乙信息可知，F1-R1 能扩增目的1 条带，F2-R1 无法扩增目的条带，所以F2 为无效引物，没有扩
增功能，无法使用，C 正确；
D、根据图乙显示可知，F1-R1 引物只扩增出一条片段，F1-R2 引物扩增条带为三条，说明R2 引物无法特异
性的扩增目的条带，D 错误。
故选D。
12．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt 基因编码的蛋白，在第76 位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获
得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组
中具有该酶切位点，因此对6 份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两
条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6 号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2 号和4 号，B 正
确，ACD 错误。
故选B。
13．（2024·吉林）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
13．A
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的原理主要基于DNA 分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶
的特性。
【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA 分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根
据所需分离的DNA 片段大小来选择的。对于较大的DNA 片段，比如基因组DNA 或质粒DNA，通常选择较
低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA 片段，比如PCR 产物或酶
切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A 正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝
胶2/3 处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B 错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA 片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，
DNA 片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，C 错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA 分子需染色后，才可在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来，D 错误。
故选A。
14．（2024·湖南）最早的双脱氧测序法是PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸
（ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加
入ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；
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PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列正
确的是（ ）
A．上述PCR 反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为G
14．AC
【分析】1、PCR 技术：
（1）概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。
（2）原理：DNA 复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自
动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
2、双脱氧测序法的原理：在DNA 聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管
反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA 链合成反应过程中 ddNTP 与dNTP 处于一
种竞争状态，即新合成DNA 链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP 并使新合成链终止延伸。这样在
每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，
但有不同的ddNTP 终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的
DNA 片段，检测DNA 片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链
序。
【详解】A、利用双脱氧测序法时，PCR 反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，
A 正确；
B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B 错误；
C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA 片段）的3'终端的碱基，如
+ddATP 的泳道中出现的条带（DNA 片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止
点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA 序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，
即对应的DNA 片段为长→短，则对应的DNA 测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为
+ddCTP 泳道组的条带，则说明该DNA 片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-
CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C 正确；
D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T，D 错误。
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故选AC。
15．（2024·贵州）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A 的野生型（含NV 基因）、突变
体（NV 基因突变）和转基因菌株（转入NV 基因），检测三种菌株NV 酶的生成与培养液中的葡萄糖含
量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。回答下列问题。
检测用菌
株
蔗糖
NV 酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
突变体
+
—
—
转基因菌
株
+
+
+
(1)据表可推测 诱导了NV 基因表达。NV 酶的作用是 。检测NV 酶活性时，需测
定的指标是 （答出1 点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA 随机插入野生型菌株基因组DNA 筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因
组DNA 作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV 基因”）配对的引物进行PCR 扩增。若
突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建
成功，从基因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将NV 基因导入 细胞获得的。在构建
NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
15．(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或
蔗糖的减少量等）
(2) NV 基因 < T-DNA 插入导致 NV 基因部分序列缺失
(3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞
【分析】基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过
体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物
产品。
【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV 酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基
因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV 酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，
将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。
（2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR
扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组
DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。
而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因的部分序列发生了缺失。这样一来，使用同样的引物进
行扩增时，扩增片段的长度就会小于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度<野生型扩增片
段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因部分序列缺失。
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（3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由
于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导
入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具
有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV
基因的细胞。
16．（2024·北京）学习以下材料，回答（1）～（4）题。筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”
是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子
位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动
子，实际上包含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定
组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕
获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的
增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组
DNA，通过PCR 扩增含有捕获载体序列的DNA 片段。对PCR 产物进行测序后，与相应的基因组序列比
对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，
研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化
是基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA 片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获
载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G 和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的
基因，应检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子
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捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B 所示载体进行了改造，期望
改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突
变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
16．(1) 稳定性差异 选择性表达
(2)C
(3)其他器官细胞中，G 和H 两个基因是否转录出相应的mRNA 或是否翻译出相应的蛋白质
(4)
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功
能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。
（2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增
强子是含有特定碱基序列的DNA 片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB
正确；
C、由图C 可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C 错误；
C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D 正确。
故选C。
（3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR 等技术检测其他器官细胞中G 和H 两
个基因是否转录出相应的 mRNA 或是否翻译出相应的蛋白质。
（4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体
中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因
突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研
究某目的基因的功能，需要将增强子插入到目的基因内部。图如下：
17．（2024·安徽）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二
醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X 基因时，PCR 反应中需要使用Taq DNA 聚合酶，原因是 。
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(2)使用BamH I 和 SalI 限制酶处理质粒和X 基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如
图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳
源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH 值下降。兴趣小
组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设
置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳
源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组
不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
17．(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而
Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，
在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
【分析】PCR 反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，复性:
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，延伸:72℃左右时，Taq 酶有最大
活性，可使DNA 新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的
DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩
增X 基因时，PCR 反应中需要使用Taq DNA 聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I 和 Sal I 限制酶处理质粒和X 基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因
保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此
实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素
的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分
子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相
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对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发
酵液的pH 值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3 种，酵母粉浓度也有3 种，
因此理论上应设置3×3=9 组实验。
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进
行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等
方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
18．（2024·甘肃）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某
课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的
协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。
高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。
(3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状
态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异
的原因是 （答出两点）。
生物质原
料
降解率（%）
协同系数
酶A
酶B
酶C
混1
混2
混1
混2
小麦秸秆
7.08
6.03
8.19
8.61
26.98
74.33
114.64
玉米秸秆
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉米芯
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
注：混1 和混2 表示三种酶的混合物
18．(1) 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关
(2)耐高温的DNA 聚合酶
(3) 基因表达载体的构建 限制酶、DNA 连接酶
(4) 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 能吸收周围
环境中DNA 分子
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(5)降解时的温度不同、降解时的pH 不同
【分析】据图可知，①②是利用选择培养基筛选出高产纤维素酶菌株X，③是提取菌株X 基因组，④为基
因工程操作程序中“目的基因的筛选和获取”，⑤为“基因表达载体的构建”，⑥为“将目的基因导入受
体细胞”，⑦为从培养体系中分离得到重组酶。
【详解】（1）选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计
的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素
钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。
刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶
分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透
明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能
力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。
（2）扩增目的基因片段在PCR 仪中进行，因此需要耐高温的DNA 聚合酶。
（3）根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该
过程需要限制酶和DNA 连接酶。
（4）大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行
遗传操作等。
先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态。将重
组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA 分子，完成转化过程。
（5）不同酶的最适温度、最适pH 不同，当温度和pH 改变时，酶促反应速率也会受到影响。
19．（2024·吉林）将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA 转移）和不含有Vir 基因、含
有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻
译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR
表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预
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冷酒精，其目的是 。
(2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。
(3)穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可能
是 。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛选转化
的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
和 。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
19．(1)水解DNA 酶，防止DNA 被分解 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
(2) PCR 技术扩增 人工合成
(3) RNA 聚合酶识别并结合的部位 增强目的基因的表达
(4)HygBR
(5) F3 R2
(6)D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是水解DNA 酶，防止DNA 被分解。提取
过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
（2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR 技术扩增。
（3）穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是RNA 聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个
p35s 启动子，其目的可能是增强目的基因的表达。
（4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基
因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
F3和R2。
（6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，
来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术
属于蛋白质工程，理由是用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-
1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。
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ABC 不符合题意，D 符合题意。
故选D。
20．（2024·广东）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生
物材料，BC 膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其
转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC 膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及
印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可
在气液界面处获得BC 菌膜（菌体和 BC 膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA 聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调
控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启
动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP 识别）。为实现蓝光
控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用
为 （答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC 菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现
只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC 膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。
20．(1)碳源、氮源
(2) PT7、PBAD 和PBAD 基因2 和3 正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1 表达
(3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
(4)该处细胞中T7RNAP 激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
20
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(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核
心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：
根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和
花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法
是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基
的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
（2）题图二a 分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N 端-nMag 与T7RNAP C 端结合，导致无活性的T7RNAP 变
成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA 聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1 转录获得相
应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，
可见基因2 和3 正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1 表达，综合上述分析可知，为实现蓝光
控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素
具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
（4）由小问2 分析可知，细胞中T7RNAP 激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC
菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
（5）由小问2 分析可知，题干信息的设计思路最终BC 膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC 膜，则
需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
21．（2024·全国）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR 扩增目的基因。PCR 的每次循环包括变性、复性、延伸3 个阶段，其中DNA 双链打
开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA 链碱基之间的化学键是 。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c 的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a
单酶切相比，用酶a 和酶b 双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c 单酶切构建
重组质粒时宜选用的连接酶是 。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若
要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。
(4)蛋白E 基因中的一段DNA 编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG 开始，
部分密码子见表。若第一个核苷酸G 缺失，则突变后相应肽链的序列是 。
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
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丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
21．(1) 变性 氢键
(2)避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA 连接酶
(3) 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 利用DNA 分子杂交技术，将大肠杆菌
的基因组DNA 提取出来，在含有目的基因的DNA 片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探
针与基因组DNA 杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
(4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
【分析】1、基因工程基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因
导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）PCR 的每次循环包括变性、复性、延伸3 个阶段，其中DNA 双链打开成为单链的阶段是变性，
引物与模板DNA 链碱基之间的化学键是氢键。
（2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以
避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c 单酶切后形成平末端，需用T4DNA 连
接酶连接。
（3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA
分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA 分子
杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA 提取出来，在含有目的基因的DNA 片段上用放射性同位素等作标记，
以此作为探针，使探针与基因组DNA 杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）蛋白E 基因中的一段DNA 编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与
mRNA 互补，因此mRNA 上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G 缺失，则mRNA 上的序
列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
22．（2024·全国）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维
素的菌株（B2）。该小组在含有N 基因的质粒中插入B1基因组的M1 与M2 片段；再经限制酶切割获得
含N 基因的片段甲，片段甲两端分别为M1 与M2；利用CRISPR/Cas9 基因组编辑技术将片段甲插入B1
的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，
→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
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(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N 基因能在菌株B2 中表达，在构建片段甲时，应将M1 与
M2 片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。
(2)CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1 基因组中与向导RNA 结合的DNA。向导RNA 与B1基因组DNA 互补
配对可以形成的碱基对有G－C 和 。
(3)用引物P1 和P2 进行PCR 可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板
与引物P3 和P4 进行PCR，实验结果是 。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2 点即可）。
22．(1) 磷酸二酯键 不破坏N 基因，且能保证N 基因正常表达
(2)C-G、A-T、U-A
(3) N 基因的两条链 不能扩增出目的基因
(4)不污染环境、增加土壤养分
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的
5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原因是
DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1 与M2 片段分别插入质粒的
Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N 基因，且能保证N 基因正常发表达。
（2）RNA 的碱基组成有A、U、G、C，DNA 的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA 与B1 基因组DNA 互补配
对可以形成的碱基对有G-C 和C-G、A-T、U-A。
（3）用引物P1 和P2 进行PCR 可扩增N 基因，验证片段甲插入了细菌B1 基因组，所用的模板是N 基因的
两条链；用该模板与引物P3 和P4 进行PCR，因为P3 不能与N 基因模板链结合，实验结果是不能扩增出
DNA 片段。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
23．（2024·浙江）小鼠毛囊中表达F 蛋白。为研究F 蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了
F 基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f 小鼠，突变基因用f 表示。f 小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表
现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f 杂合子基因型用+f 表示）
回答下列问题：
(1)F 基因敲除方案如图甲。在F 基因的编码区插入了一个DNA 片段P，引起F 基因产生 ，导致
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mRNA 提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还
可以对该基因的特定碱基进行 和 。
(2)从野生型、f 杂合子和f 小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA
探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f 小鼠和f 杂合子对应的DNA 片段分别位
于第 泳道和第 泳道。
(3)g 小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f 小鼠相同。f 基因和g 基因位于同一条常染色体上。f 杂合
子小鼠与g 小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g 和f 是非等位基因；若杂交结果是 ，则g 和
f 是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g 杂合子基因型用+g 表示）
(4)确定g 和f 为等位基因后，为进一步鉴定g 基因，分别提取野生型（++）、g 杂合子（+g）和g 小鼠
（gg）的mRNA，反转录为cDNA 后用（2）小题同样的DNA 探针和方法检测，结果如图丙。g 小鼠
泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g 杂合子表达F 蛋白，g 小鼠不表达F 蛋白，
因此推测F 蛋白具有的作用 。
23．(1) 编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失
(2) 3 2
(3) 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1
(4)基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长
【分析】基因分离定律实质：在杂合子细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；
当细胞进行减数分裂，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子当中，独立地随配子
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遗传给后代。
【详解】（1）依据题意，在F 基因的编码区插入了一个DNA 片段P，引起F 基因产生编码序列错位，从而
导致mRNA 提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定
功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA 片段引起的，除此之外，还可以缺失或者
替换基因中的碱基，从而导致基因突变。
（2）从图中看出，野生型基因和f 基因都含有2 个限制酶HindⅢ的识别序列，但f 基因中含有P 片段，因
此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f 基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f 基因切出来
能与探针结合的片段较长，DNA 分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1 泳道中
只有野生型基因，第2 泳道中既有野生型基因，又有f 基因，第3 泳道中只有f 基因，因此f 小鼠和f 杂合
子对应的DNA 片段分别位于第3 泳道和第2 泳道。
（3）据题意可知，野生型基因用++表示，g 小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg 表示，f 杂合子小鼠基因
型用+f 表示，f 基因和g 基因位于同一条常染色体上，如果g 和f 是非等位基因，f 杂合子小鼠（+f/++）与g
小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g 和+f/+g，全是野生型；如果g 和f 是等位基因，f 杂合子小鼠（+f）与g
小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。
（4）据图可知，野生型基因突变成g 基因以后，启动子随着一部分DNA 片段丢失，无法转录出 mRNA，
也无法形成cDNA，PCR 时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g 小鼠泳道没有条带。g 小
鼠表型与f 小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g 杂合子表达F 蛋白，g 小鼠不表达F 蛋白，即没有
F 蛋白，表现出长毛，说明F 蛋白在毛发生长中起抑制作用。
24．（2024·浙江）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中
Zn2+的功能。为研究该植物2 种锌转运蛋白M 和N 与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N 基因基
础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
(1)锌转运蛋白基因M、N 克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序
列信息设计引物进行PCR 扩增，PCR 每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物
体内 的作用效果。PCR 产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA 分子因为含 而带负电荷，凝胶点
样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2 个PCR 产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2 个条
带之间的距离会 。回收DNA 片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N 基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利
用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR 快速验证重组转化是否成功。此反应
可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至
液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N 基因在受体细
胞中的表达水平，无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N 基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌
液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006 和0.0006，然后各取10μL 菌液用涂布器均匀涂布在固
体培养基上，培养2 天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转
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运蛋白M 和N 中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600 为波长600nm 下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M 或N 基因的
表达载体。
24．(1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长
(2) DNA 连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA 外溢
(3) 划线分离 振荡培养
(4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N 基因的这组酵母菌数量数量多
【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N 基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相
近，转入N 基因的这组酵母菌数量数量多，说明N 转运Zn2+能力更强。
【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植
物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA 解螺旋，相当于生物体
内解旋酶的效果。DNA 分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着
时间的推移，不同分子量的DNA 分子速度不同，时间越长，距离差越大。
（2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA 连接酶进行连接。由于RCR 过程中热变性使大肠杆菌内的
DNA 外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR 快速验证重组转化是否成功。
（3）冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养
基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
（4）由题意可知，菌液稀释后OD600 为0.06、0.006 和0.0006，说明其进行10 指数的梯度稀释。由图可
知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N 基因的这组
酵母菌数量数量多，说明N 转运Zn2+能力更强。
25．（2023·辽宁）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，
将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的
关键步骤是除去（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
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25．B
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记
基因等。
【详解】为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因
都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163 基因转录形成的mRNA 中不能出现终止
密码子，否则红色荧光蛋白RFP 基因转录形成的mRNA 不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼
接过程的关键步骤是除去CD163 基因中编码终止密码子的序列，B 符合题意，ACD 不符合题意。
故选B。
26．（2023·湖北）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如
图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），
并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
26．D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI 和PvuI 的酶切位点，四环素抗性基因
（TetR）内含有HindIII、SphI 和SalI 的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A 正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的
菌落，不一定含有目的基因，B 正确；
C、DNA 凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA 片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构
建成功与否，C 正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因
（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet 的培养
基中不能形成菌落，D 错误。
故选D。
27．（2023·浙江）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3 基
因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-
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GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩
增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
27．B
【分析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复
制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可以使
GEP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时
先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只有
小片段，是野生型，C 错误；
D、用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，无法区分杂合子和纯合子，因为二者扩增后只得到小片段，D 错误。
故选B。
28．（2023·山西）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将目的基因（两端
含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割
位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
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28．C
【分析】DNA 连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外
T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；
B、质粒用酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；
C、质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因在
质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；
D、若用酶2 和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少
标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。
故选C。
29．（2023·河北）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶
（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对
非转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，
样品1 为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含
量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定
以比较在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
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ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞
内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即
可）
29．(1)溶解度
(2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME 基
因”）
(3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME 基因序列整合
到硅藻细胞基因组中”）
(4) 增加 细胞数量
(5)有氧呼吸生成的ATP 增多
(6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生
产”）
【分析】1、PCR 的含义：PCR 是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在生物体
外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、PCR 原理：DNA 半保留复制。
3、PCR 基本条件：DNA 模板、4 种脱氧核苷三磷酸、2 种引物、耐高温的DNA 聚合酶、缓冲液。
【详解】（1）DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA 和蛋白质。
因此，根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的
粗提DNA 可以作为PCR 扩增目的基因的模板。
（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有
特殊序列结构的DNA 片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸
酶（ME）基因。
（3）PCR 是一项根据DNA 半保留复制原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基
因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA 作为PCR 模板，
而在实验组中以转ME 基因的硅藻细胞基因组DNA 作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间
的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME 基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。
（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3 分析
可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B 的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定
硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A 与B 的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高
产生物柴油的优良硅藻细胞品系。
（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B 线粒
体中ME 含量显著高于品系A。据此分析可知，ME 基因的超表达导致线粒体中的NADH 水平升高，NADH
进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。
（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、
30
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不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
30．（2023·辽宁）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀粉酶基因，
并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热
性明显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载
体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同
大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确
连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模
板。
30．(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
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方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测
目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ
酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA 为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
31．（2023·山东）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图
甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结
构有 （答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J
基因的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表
达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
31．(1) RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a 链
(3) J-V5 融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧
光蛋白基因或产物能显色的基因。
32
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【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此
RNA 聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；
②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是
安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具
备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连接到
质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b 是
模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是
3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯
定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b
链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。抗
J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上的融
合的J 基因表达的。
32．（2023·湖南）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后
发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可
将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。
家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1 和1-2 生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是
。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR 扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为
）酶切检
测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6 个碱基即
可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1 的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：
该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
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(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低
NTDs 的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1 个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量
为0.4~1.0mg.d-1，NTDs 生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推
荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
32．(1) 常染色体隐性遗传病 1/32
(2) 5'-ATTCCA-3' 8、302 和310
(3)4
【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，
位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中。随配子独立遗传给后代，
同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合
【详解】（1）由遗传系谱图可知，由于I-1 与I-2 均表现正常，他们关于甲病的基因型均为+/-，而他们的
女儿Ⅱ-4 患病，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传病，由I-1、I-2 和Ⅱ-3 关于
乙病的基因可以推出乙基因突变导致的遗传病也是常染色体隐性遗传病，所以I-1 和I-2 生出一个甲和乙突
变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
（2）本题研究甲基因突变情况，二代1 为杂合子，兼有正常甲基因和突变甲基因。目的基因为甲基因，扩
增引物应与两基因共有的TAAGGT 片段结合，应为ATTCCA。可扩增出大量正常甲基因和突变甲基因供后续
鉴定。此时酶切，正常甲基因酶切后片段为8 和2+293+7=302bp，突变甲基因无法被酶切，大小为
310bp。后续可通过电泳等手段区分开，达到检测甲基因突变情况的目的。
（3）女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险，虽然二代1 号在三代2 号未出生前表现型上没有NTDs
生育史，但是三代2 号基因型为- -，从基因型上看，这就是NTDs 生育史，因为乙基因的纯合会增加胎儿
NTDs 的风险，推荐叶酸补充剂量为4mg·d-1。
33．（2023·广东）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一
株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替换，突变
后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植
株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶将
两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多
个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一
步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
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①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表
示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %
的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）
所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即
为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基
因片段，再使用限制性核酸内切酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，
在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。
33．(1)野生型
(2)载体（基因表达载体） 启动子和终止子
(3)DAI 基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是
细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI 基因为显性基因，因此采用农
杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小
应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR 技术扩增DAI 基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI 基因和运载体进行切割，再用
DNA 连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾
端，因此为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA 上含有DAI 基因和卡那霉素抗
性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能
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够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI 基因和卡那霉素抗
性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI 基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位
点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当
于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3 1∶的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，
因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基
上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转
基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X 的切
割位点，而突变型的基因有限制酶X 的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有
150bp，突变型有50bp 和100bp，如图：
。
34．（2023·全国）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因为材料，利用基
因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP
基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构
建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为
，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿
色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变
基因进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光
蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
34．(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生
物的不同的基因
(2) 终止子 启动子 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否
含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(3)密码子具有简并性
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(4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP 基因）导入酵母菌中进行表达
【分析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA 上相邻的3 个碱基。
②种类：64 种，其中有3 种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用
性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含
有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的
转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，
位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需
要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选
出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP 突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分
析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP
基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP 基因能在真核细胞中表达，反之则不
能在真核细胞中表达。
35．（2023·全国）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，
降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得
的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞
中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体
中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行
DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
35．(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
(2) 筛选 RNA 聚合酶
(3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA 片段
(4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA 是否翻译形成蛋白质
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和
人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目
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的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效
的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因-DNA 分子杂交技术②检测目的基
因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平
上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒
遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA 聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否
转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
36．（2022·辽宁）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安
全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
36．B
【分析】PCR 过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA 解旋为单链；②复性，当
温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合；③延伸，温度上升到72℃左
右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】A、预变性是使模板DNA 充分变性，A 错误；
B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增
更加充分，B 正确；
C、延伸过程需引物参与，C 错误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D 错误；
故选B。
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37．（2022·天津）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1 导入谷氨酸棒杆菌，
以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB 两个标记
基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇
∕3＇）端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含
（EcoR
∕Hind
∕Xho
Ⅰ
Ⅲ
Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2 构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那
霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA
片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
37．(1) 1 4 5＇
(2)XhoⅠ
(3)卡那霉素
(4)B
(5)PCR
【分析】PCR 反应过程:变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，复
性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，延伸：72℃左右时，Taq 酶
有最大活性，可使DNA 新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基因），需要引物1 和
4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1 和4。PCR 时，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端
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开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此在引物的5'端引入XhoⅠ酶识别
序列。
（2）据图可知，载体4 中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载体3 中不含XhoⅠ酶
识别序列，如果将载体2 和载体3 连接形成高效筛选载体4 时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。
（3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5 中含有RpsL（链霉
素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉素
敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
（4）据题意可知，载体5 导入的是链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌
中P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片段全部丢失，因此该菌的表型为
卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B 正确，ACD 错误。
故选B。
（5）通过PCR 技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA 中或目的基因是否转录出了
mRNA，因此可采用PCR 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。
38．（2022·重庆）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人
员克隆了可显著增高和增产的eui 基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
(1)花药培养能缩短育种年限，原因是 。在步骤I 的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，
将其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I 中能用于制造人工种子的材料
是 。
(2)步骤II 中，eui 基因克隆于cDNA 文库而不是基因组文库，原因是 ；在构建重组Ti 质粒时使
用的工具酶有 。为筛选含重组Ti 质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌
菌株经鉴定后，应侵染I 中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui 基因的鉴定
方法是 ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
38．(1)单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体
(2)cDNA 文库是由编码蛋白质的mRNA 逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基因工程中只需要转录出编
码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶和 DNA 连接酶 抗生素 愈伤组织
DNA 分子杂交技术
【分析】1、单倍体育种的原理是染色体变异，方法是用花药离体培养获得单倍体植株，再人工诱导染色
体数目加倍；优点是纯合体自交后代不发生性状分离，因而能明显缩短育种年限。2、cDNA 是指以mRNA
为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。以细胞的全部mRNA 逆转录合成的cDNA 组成的重组克隆
群体称为cDNA 文库，基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA 切割成一定大小的片段，并与合适的载
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体重组后导入宿主细胞，进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA 片段的集合，它包含了该生物的所有
基因。
【详解】（1）单倍体育种过程中，单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离，
所以可以明显缩短育种年限。将水稻花粉进行脱分化处理，可产生单倍体的愈伤组织，秋水仙素能抑制纺
锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，从而引起细胞内染色体数目加倍，故将其培养于含秋水仙素
的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。
（2）cDNA 文库又叫部分基因文库，是由编码蛋白质的mRNA 逆转录来的基因导入受体菌而形成的，而基
因组文库包含了本物种全部基因，基因工程中只需转录出编码蛋白质的基因部分就即可，故选cDNA 文库。
在构建重组Ti 质粒时，必须使用限制性核酸内切酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，
之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti 质粒中含有抗生素抗性基因，故应在
培养基中添加抗生素，以便对重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，
即用含eu 基因的农杆菌侵染愈伤组织，以便将eui 基因导入愈伤组织，获得转基因再生植株。检测植株是
否含有eui 基因，可采取DNA 分子杂交技术的方法。
39．（2022·江苏）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作
用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的
功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进行了PCR 扩
增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出
来，溶液中添加NaC1 至2．0mol/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在
催化下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，
可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M 重组质粒
（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
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分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M
（图Ⅱ中融合片段M 中有白
色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR 目的产物约为 bp。
确保M 及连接处序列正确，
Y-M 的连接处上游含有Hind
III+EcoR V 的识别序列，下游
含有EcoR V+BamH I 的识别序
列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是
（选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质
粒Y-M 分别导入细胞，发现对照组整个细胞
均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基
部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量相
等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循
环数）。从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
倍。
39．(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心）
(2) 溶解DNA 耐高温DNA 聚合酶（Taq 酶） 3'
(3) a、b 1100 Q4 X 蛋白参与中心体的形成
(4) 逆转录 32
【分析】PCR 技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）；PCR
的操作过程：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自
动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。
（2）从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，DNA 在2．
0mol/L 的NaC1 溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA 的溶解度均会下降，因此实验过程中添加
NaC1 至2．0mol/L 的目的是溶解DNA。PCR 扩增时，需在耐高温的DNA 聚合酶（即Taq 聚合酶）的催化下，
在引物的3’端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
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（3）PCR 扩增目的DNA 片段时，在引物的3’端进行DNA 链的延伸，据图可知，应选择图II 中的引物a 和
引物b，PCR 目的产物约为300+800=1100bp。确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连接处上游含有Hind
III+EcoR V 的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I 的识别序列，根据题干信息构建Y-M 重组质粒（在EcoRⅤ
位点插入片段），Y-M 的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I 的识别序列，根据EcoR V 识别位点，
应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有
绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X 参与中心体的组成。
（4）研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量相等的条件
下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环数），说明病
人基因Z 表达较弱，设健康人Z 基因的cDNA 数为x，病人Z 基因的cDNA 数为y，则有x×215=y×220，从理论
上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32 倍。
40．（2022·河北）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂
（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列
问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上，此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有 （写出
两点即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。下图为
三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析 （填“NaPI”或“StPinlA”
或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是 。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致
昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有
了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是 （写出两点即可）。
40．(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的
(2)基因表达载体的构建/表达载体的构建
(3)T-DNA 该方法不适用于单子叶植物
(4)基因--DNA 分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术
(5)效果 NaPI＋StPinlA 饲喂NaPI＋StPinlA 转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多
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(6)定向改变 由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而
提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了
mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗
虫的目的。
（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建。
（3）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色
体的DNA 上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti 质粒的T-DNA 上，通过农杆菌的转化作用，
就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA 上。其不足之处是该方法不适用于单子叶植物。
（4）目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因、
是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗
虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--DNA 分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。
（5）抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以鉴定其抗性程度。
由图可知，NaPI＋StPinlA 转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂NaPI＋StPinlA 转基因的虫体质量最小、棉
铃数量最多。
（6）在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫
发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂
的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂。
41．（2022·山东）某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶识别并降解，药物A 可通过
影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白
FLAG-P 和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨基端，使
融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介质结合，但不影响P 或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物需满足的条件
是 、为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识
别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，
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其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA 序
列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同。据图
甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P 基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决
该问题，具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A 和UBC 按照图乙中的组合方式分成5 组。各组
样品混匀后分别流经含FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC 抗体检测，检测结果
如图丙所示。已知FLAG-P 和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是
；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A 治疗该病的机理是 。
41．(1) 能与P 基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端
(2) P 基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA 的密
码子被错位读取。 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1 个碱基
(3) 增强FLAG-P 与UBC 的结合 参与P 与UBC 的结合
(4)药物A 通过增强P 与UBC 结合促进P 降解。
【分析】PCR 过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解旋为单链；②温度下降到50℃左右
时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4 种
脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P 基
因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA 聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加
到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。
（2）融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的
氨基酸序列与P 不同，说明P 基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA 中，限制酶识别序列对应
的最后两个碱基与P 基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，
可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1 个碱基，使其碱基数目加上FLAG 的碱基数目为3 的倍数，这样能保
证P 基因转录出的mRNA 上的读码框不改变，能够正常翻译。
（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC 抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC 和FLAG-P，出现杂交带；
③组添加UBC、药物A 和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A 的作用是促进UBC 与FLAG-P 的结合。由
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②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此
推测P△中缺失的特定序列是与UBC 结合的关键序列。
（4）根据（3）的分析推测，药物A 促进UBC 与FLAG-P 的结合，从而促进蛋白P 被蛋白酶识别并降解，达
到治疗的目的。
42．（2022·浙江）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于
80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后
涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径
比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、
等技术获得。
（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生
长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，
因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对
培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，
也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长
短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
42．(1) 无菌水 水浴 杀死不耐热微生物
(2) 分离 KI-I2
(3) 人工诱变 原生质体融合
(4) 农杆菌 过低 敏感性
(5) 再生 细胞核 形态特征和数量
(6) 培养时间 受精卵
【分析】（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培
养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
（二）农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。根据农杆
菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti 质粒的T-DNA 上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整
合到植物细胞中染色体的DNA 上。转化过程：目的基因插入Ti 质粒的T-DNA 上农杆菌→导入植物细胞→目
的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
【详解】（1）产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水
制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。
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（2）将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离
枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为
能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，
比值大的说明该菌株产酶性能较高。
（3）要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选
才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产
淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。
（4）野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA 中插入一种抗生素抗性基
因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农
杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA 中抗性基因的细胞能
在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因
此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。
（5）转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性
较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通
过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，
分析染色体组型是否改变。
（6）植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时
间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表
达能力最高。
43．（2022·全国）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问
题。
(1)新冠病毒是一种RNA 病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR 法。这种方法的基本原
理是先以病毒RNA 为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR 技术扩增相应的
DNA 片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR 引物时必须依据新冠病毒RNA 中的 来进行。
PCR 过程每次循环分为3 步，其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果
为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1 种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均
为阳性，说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）
的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程
的基本操作流程是 。
43．(1)逆转录酶/反转录酶
(2) 特异性核苷酸序列 退火/复性
(3) 曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者
(4)获取S 蛋白基因→构建S 蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测
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受体能否产生S 蛋白）
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术；过程：①高温变
性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：
引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR 法需要先得到cDNA，由RNA 到DNA
的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。
（2）PCR 过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠
病毒核酸检测的准确性，在设计PCR 引物时必须依据新冠病毒RNA 中的特异性核苷酸序列来进行；PCR 过
程每次循环分为3 步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的
一步是复性（或退火）。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说
明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，
但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均
为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经
感染新冠病毒，为患者。
（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基
因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S 蛋白，故具体流
程为：获取S 蛋白基因→构建S 蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
（检测受体能否产生S 蛋白）。
考点03 基因工程和蛋白质工程的应用
44．（2024·江西）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨
酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S 的L-谷氨酸脱羧酶
基因（gadB）导入生产菌株E．coliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．
coliB。下列叙述正确的是（ ）
A．上图表明，可以从酿酒酵母S 中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB 发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA 和E．coliB 都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
48
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44．A
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法；
（4）目的基因的检测与鉴定：包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】A、题意显示，研究人员采用如图方法将酿酒酵母S 的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株
E．coliA，说明可以从酿酒酵母S 中分离得到目的基因gadB，A 正确；
B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．
coliB 中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB 发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的
作用不是供能，B 错误；
C、E．coliA 中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB 中含有该酶的基因，因
而能高效降解γ-氨基丁酸，C 错误；
D、图中质粒上含有NcoⅠ和KpnⅠ的酶切位点，因而不可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，
D 错误。
故选A。
45．（2024·浙江）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代
谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次
生代谢产物X 的研发流程如下：
筛选高产细胞→细胞生长和产物X 合成关系的确定→发酵生产X
回答下列问题：
(1)获得高产细胞时，以X 含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通
过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。
(2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗
传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X 含量，将微生物菌体或其产物作为
诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。
(3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的
模型分为3 种，如图所示。若X 只在细胞生长停止后才能合成，则X 的合成符合图 （填“甲”
“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X 的方法。
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(4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮
培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代
谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程
生产植物的次生代谢产物。
45．(1) 外植体 过滤
(2) 扩大 过量的胸苷 微生物侵害
(3) 丙 将细胞培养至稳定期（即停止生长时期）一定时间后，通过分离提纯获得大量X
(4) 根的水培养 相关基因组成 基因表达过程 基因工程和发酵
【分析】1、植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人
工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。2、植物
组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH 和无菌环境等）；②一定
的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。
【详解】（1）植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行
振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，
离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。
（2）分离获得的单细胞进行扩大培养，并通过添加过量胸苷，（向细胞培养液中加入过量胸苷（TdR），
处于S 期的细胞立刻被抑制，洗去TdR 后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR 影响）或
营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为
诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。
（3）由题可知X 只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X 的方法，是将细胞培养
知稳定期（即停止生长时期）一定时间后，通过分离提纯获得大量X。
（4）由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的
收集，可以对根进行水培。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后
通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的相关基因组成和基因表达过程。
46．（2024·河北）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为
r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN 疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1 所示。其中GtP 为启动子，若使r2HN 仅在水稻
胚乳表达，GtP 应为 启动子。Nos 为终止子，其作用为 。r2HN
基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN 基因与载
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体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用 方法将r2HN 基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN 表达情况，可通过PCR 技术检测
，通过 技术检测是否翻译出r2HN 蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN
纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。
(4)制备r2HN 疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体
内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的
细胞（细胞毒性T 细胞）水平，结果如图2 所示。据
此分析，获得的r2HN 疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN 疫苗的优点是 。（答出两点
即可）
46．(1) 在胚乳中特异性表达的 终止转录 HindIII EcoRI
(2) 农杆菌转化 r2HNmRNA 抗原抗体杂交
(3) 1/4 纯合体自交后代不发现性状分离
(4) 体液 细胞
(5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
【分析】基因工程是一项体外DNA 重组技术，需要借助限制酶、 DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它
的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基
因的检测与鉴定。
【详解】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN 的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的启动子
在水稻胚乳细胞中更容易被RNA 聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos 为终止子，终止子可以终止转录。
r2HN 基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI 破坏了启动子序列不能选用，SacI 位于终止子序列之外不
能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII 和EcoRI 对r2HN 基
因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN 表达
情况，可通过PCR 技术检测转录的r2HNmRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—
抗体杂交检测是否翻译出r2HN 蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植
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株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN 基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状
分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
（4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T 细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过
细胞免疫产生了细胞毒性T 细胞，即r2HN 疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
（5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN 疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优
点。
47．（2023·湖南）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1 蛋白通过调
节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
47．B
【分析】分析题图：AT1 蛋白通过抑制PIP2s 蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2排到细胞外，从而导致植
物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1 蛋白缺陷，可以提高PIP2s 蛋白的磷酸化水平，促进细胞
内的H2O2排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1 蛋白缺陷，可以促进PIP2s 蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜
外，A 正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的
量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B 错误；
C、结合对A 选项的分析可推测，敲除AT1 基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进
而提高其成活率，C 正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D 正确。
故选B。
48．（2023·天津）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计
表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。
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酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其
表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法
同源重组是碱基序列基本相同的DNA 区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过
同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB 短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB 之间，在设计表达载体时，
可采用PCR 技术在外源基因两端分别引入A 和B,获得乙图所示长片段。PCR 时应选用的一对引物为
(从P1~P6 中选)。
(3)标记基因的选择 URA3 是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3 编码的蛋白可将
外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶I 基因的菌株1，需将酶I 基因同URA3 一起插入URA3 缺陷型酿酒酵母基因组
AB 之间，并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3 作为筛选标记，需切除菌株1 的URA3。为此设计表达
载体时，还应向URA3 两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C 和C´,并以下图方式
排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后，需要将菌株1 在 的培养基上培养，存活菌株即为URA3 被成功切除的菌株1´。
(4)表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、
C、C´、URA3 和酶基因应采用下图 的排布方式。
48．(1)外
(2)P1和P6
(3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2 分）
(4)4
【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
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以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA 分子水平上进行
设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
【详解】（1）由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所
在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，
将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6
这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上
培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C 和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，
切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，
如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43 标
记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB 之间，所以A、B 应置于标记基因与目的基因
最 外侧；二是需要利用C、C 片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C 应紧邻URA3
两侧。同时满足上述条件 的只有图4。
49．（2022·浙江）羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc，但不发病。当羊
感染了PrPSc后，PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆
接种到小鼠后，小鼠也会发病。下列分析合理的是（ ）
A．动物体内的PrPSc可全部被蛋白酶水解
B．患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C．产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D．给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc，小鼠不会发病
49．D
【分析】基因敲除是用含有一定已知序列的DNA 片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源
重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA 导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知
的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物
体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
【详解】A、由题干可知PrPSc可将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc在羊体内积累，说明PrPSc不会全部被
蛋白酶水解，A 错误；
B、患病羊体内不存在指导PrPSc合成的基因，但存在指导蛋白质PrPc合成的基因，PrPc合成后，PrPSc将PrPc
不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而使羊发病，B 错误；
C、由题干可知当羊感染了PrPSc后，PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而使羊发病，说明
产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc不具有反馈抑制作用，C 错误；
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D、小鼠的PrPc基因敲除后，不会表达产生蛋白质PrPc，因此小鼠接种PrPSc后，不会出现PrPc转变为
PrPSc，也就不会导致PrPSc积累，因此小鼠不会发病，D 正确。
故选D。
50．（2022·湖南）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好
的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a 是 ，物质b 是 。在生产过程中，物质b 可能不同，
合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和
利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如
图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）
有关，导致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简
要写出实验设计思路 。
50．(1)氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性
(2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合成 DNA 双链复制
(3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过
的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间
【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有
的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列；
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，
对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工
程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
【详解】（1）据分析可知，物质a 是氨基酸序列多肽链，物质b 是mRNA。在生产过程中，物质b 可能不
同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、
通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链
复制。
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（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延
长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血
活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后
的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理
后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间
和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
（4）为比较不同物质的抗凝血活性差异，可以设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲
处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需
要的时间，凝血时间越长，抗凝血 活性越高。
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