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专题14 基因工程
（基础题+验证题+提升题 三位一体）
1．（2024·辽宁·二模）同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但切割后产生相同黏性末端的限制酶，依靠同尾
酶的这种特性，可以根据需要将不同的DNA 片段进行灵活重组。下列叙述正确的是（ ）
A．产生限制酶的生物大多没有核膜包被的细胞核
B．限制酶能识别DNA 和RNA 中特定的核苷酸序列
C．限制酶可为磷酸二酯键水解提供所需活化能
D．同尾酶是一类限制酶，每种限制酶都存在其同尾酶
【答案】A
【详解】A、限制酶主要从原核生物中分离纯化得到，原核生物没有核膜包被的细胞核，A 正确；
B、限制酶识别DNA 分子的特定核苷酸序列，B 错误；
C、限制酶起催化作用，作用机理为降低化学反应所需活化能，但不提供能量，C 错误；
D、DNA 分子经限制酶切割后可形成黏性末端和平末端，产生平末端的限制酶不存在同尾酶，D 错误。
故选A。
2．（2024·仙桃·二模）我国科学家研究发现，真核细胞的核基因表达调节机制——内含子miRNA 通过下
调转录因子来调控基因的表达，图甲和图乙是发生在细胞核内的正向和反向调节机制模式图。请据所学知
识分析，下列叙述错误的是（ ）
A．内含子miRNA 是在转录水平来调控基因的表达
B．内含子miRNA 调控基因的表达存在反馈调节机制
C．形成主基因mRNA 和成熟miRNA 需解旋酶和限制酶的作用
D．该研究为某些疾病如肿瘤提供多个靶点联合治疗
【答案】C
【详解】A、内含子miRNA 是通过抑制转录激活因子或转录抑制因子，来下调转录水平进而调控基因的表
达，A 正确；
第一部分 夯实基础
1
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B、宿主基因转录水平过低或过高，产生过少或过量的内含子miRNA 时，就会反过来促进或抑制基因的表
达，既有正反馈调节机制，也有负反馈调节机制，B 正确；
C、限制酶和解旋酶的作用对象是 DNA，而不是 RNA，形成主基因mRNA 和成熟miRNA 的过程，是对
初始转录产物RNA 进行剪切、拼接和加工，需要相关酶的参与，而不是限制酶和解旋酶，C 错误；
D、该研究对于某些疾病如肿瘤等可通过调控转录及转录后加工等提供多个靶点联合治疗，D 正确。
故选C。
3．（2024·河北石家庄·二模）细胞中NF-κB 蛋白的活性水平与肿瘤的发展呈正相关。为了高效地筛选出以
NF-κB 为靶点的抗肿瘤药物，研究人员利用基因工程构建了NF-κB-GFP 的报告基因载体。具体原理为把已
确定的NF-κB 基因与报告基因GFP（其表达产物荧光蛋白可被实时检测）正确连接，使报告基因能与NF-
κB 基因同步表达，其工作模式见下图1。回答下列问题：
(1)构建NF-κB-GFP 报告基因载体时，首先利用PCR 技术扩增GFP 基因序列，能否准确扩增出GFP 基因的
关键是 。降温至50℃时，PCR 反应体系中完成的反应主要是 。
(2)GFP 基因所在DNA 分子上有3 种限制酶（BamHI、EcoRI、HindⅢ）的识别序列；如下图2 所示。限制
酶BamHI 在碱基G 和G 之间进行切割，画出其切割后产生的黏性末端（体现出限制酶的切割位点）
。应使用限制酶 对GFP 基因所在的DNA 进行切割，再连接到质粒上，该方法的优点是
。最后得到NF-κB-GFP 报告基因载体，该载体中GFP 基因和NF-κB 基因表达时使用的启动子
（填“相同”或“不同”）。
(3)将NF-κB-GFP 报告基因载体导入肿瘤细胞常用的方法是 。体外培养肿瘤细胞需要提供
（答出2 点即可）条件；再放入气体具体组成成分为 的培养箱中进行培养。
(4)将导入成功的肿瘤细胞置于含待检测抗肿瘤药物的培养基中培养一段时间，并检测细胞中GFP 蛋白表达
量的变化。若药物抗肿瘤效果显著，可观测到的现象为 。
【答案】(1) 正确设计引物 引物与两条DNA 单链（模板链）结合
2
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(2)
（或
） BamHI 和EcoRI 避免GFP 基因自身环化，避免GFP 基因
反向）连接 相同
(3) 显微注射法 所需要的各种营养物质，无菌、无毒的环境，适宜的温度、pH 和渗透压
95%空气+5%CO2
(4)添加该药物的培养基中，肿瘤细胞中的荧光强度显著下降
【详解】（1）利用PCR 技术能准确扩增出目的基因的关键是正确设计引物。降温至50℃时，反应体系中
完成的变化主要是引物与两条DNA 单链结合。
（2）限制酶BamHI 在碱基G 和G 之间进行切割，切割后产生的黏性末端为
或
，用
BamHI 和EcoRI 两种限制酶切割GFP 基因序列所在DNA，切割后形成的黏性末端可以避免GFP 基因自身
环化，也可以避免GFP 基因反向连接。GFP 基因和NF-κB 基因要同步表达，因此需要使用相同的启动子。
（3）将外源基因导入动物细胞常用显微注射法。体外培养肿瘤细胞需要提供所需要的各种营养物质、无
菌、无毒的环境，适宜的温度、pH 和渗透压。将含肿瘤细胞的培养基置于37℃恒温培养箱中培养，培养
箱中的气体具体组成成分为95%空气+5%CO2，其中O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养
液的pH。
（4）本研究的目的是高效地筛选出以NF-κB 为靶点的抗肿瘤药物，由于GFP 基因是NF-κB 基因的报告基
因，因此抗肿瘤效果显著的药物使用后会使NF-κB 表达量显著下降，与NF-κB 基因具有相同启动子的GFP
基因表达量也显著下降，因此会观测到肿瘤细胞中的荧光强度显著下降的现象。
4．（2024·上海崇明·二模）生物燃料乙醇是重要的清洁能源。传统的生物乙醇通过高粱、甘蔗等粮食进行
生产，对粮食消耗巨大。高粱等植物的秸秆中含有丰富的半纤维素（主要水解产物是木糖），可以用作染
料乙醇生产的原材料。
酿酒酵母是用作乙醇发酵的重要菌种，但因其本身跨膜转运木糖困难以及缺乏专一性的木糖代谢酶，故不
能直接利用木糖进行乙醇发酵。研究人员通过基因工程手段使酵母细胞超表达木糖转运体，并将木糖代谢
相关的XR 酶和XDH 酶的基因导入野生型的酿酒酵母中，在酵母细胞内建立起了木糖代谢的通路，如图1
中途径I 所示。
3
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(1)木糖转运体能特异性地转运木糖而非葡萄糖，主要取决于木糖转运体蛋白质的___（单选）。
A．氨基酸间的连接方式
B．合成和加工的细胞器
C．两侧木糖和葡萄糖浓度
D．活性中心的空间结构
(2)在合适的发酵条件下发现，重组酵母相对于原菌株对于木糖的利用效率并未得到显著的改善，结合图1
和所学知识分析，以下原因分析合理的有___（多选）。
A．重组酵母的木糖转运体的转运效率不高
B．酒精发酵与木糖代谢竞争NADH
C．导入的XR 酶和XDH 酶的基因无法在酵母细胞中表达
D．酵母胞质内环境与XR、XDH 等酶的最适反应环境不一致
为了提高乙醇的产量，研究人员利用基因工程技术将XK 基因与增强启动子相连，导入受体细胞中，观察
工程菌的乙醇发酵情况，技术路线如图2 所示，其中①～④代表PCR 扩增引物，LEU2 基因是亮氨酸合成
基因，URA3 基因是尿嘧啶合成基因。如表是工程菌a 和工程菌b 在同等适宜条件下分别进行葡萄糖木糖
共底物发酵实验的部分产物检测结果。
木糖利用g/L
乙醇产量g/L
木糖醇产量g/L
工程菌a
12.4
9.4
0.7
4
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工程菌b
5.6
6.9
4.8
(3)为了使XK 基因与载体质粒有效连接，可以通过PCR 技术在XK 基因的上下游引入限制性内切核酸酶
的识别序列，再用对应酶切后通过DNA 连接酶连接。设计的扩增引物位置是图2 中的 （编号选填）。
(4)选出恰当的编号填在下表中，完成工程菌a 和工程菌b 的制备过程（编号选填）。
制备工程菌a
制备工程菌b
导入质粒
重组质粒a+重组质粒b
重组质粒b
受体细胞
（1）
（2）
筛选用培养基
（3）
（4）
①野生型酿酒酵母②亮氨酸缺陷型酿酒酵母③尿嘧啶缺陷型酿酒酵母④葡萄糖为碳源⑤木糖为唯一碳源⑥
缺少亮氨酸⑦缺少尿嘧啶⑧添加青霉素
(5)结合图1、2 和表中数据，分析工程菌a 提高了乙醇产量的原因 。
研究人员还在嗜热细菌中发现了XI 酶。XI 酶能催化木糖直接转化为可被酿酒酵母直接吸收利用的木酮糖。
将XI 酶的相关基因导入野生型的酿酒酵母，建立了图1 中途径II 所示的木糖代谢通路。
(6)导入XI 酶基因的酿酒酵母在实际的葡萄糖木糖共底物发酵实验中并没有表现出比野生型酿酒酵母更优
良的木糖利用率和乙醇产率。请结合题干信息分析原因，并提出一项能够增加乙醇产率的改进策略 。
【答案】(1)D
(2)ABD
(3) Bcl Ⅱ ②③
(4)
②③
③
⑤⑥⑦
⑤⑦
(5)工程菌a 与工程菌b 相比，导入了与增强启动子相连的XK 基因，使得细胞超表达XK 酶，提高了木糖
代谢的中间产物木酮糖转变为X5P 的效率，有利于产物向乙醇发酵转化。由表中数据可知，工程菌a 的木
糖利用率较工程菌b 提高，木糖醇产量大大减少，说明木酮糖的快速代谢也解除了中间产物对前置反应的
抑制作用，加快了木糖的利用和转化
(6)至少能够从木糖转运效率和XI 酶最适反应温度两个角度分析木糖利用率和乙醇产率低的原因。能够运
用定点突变或定向进化的蛋白质工程策略对表达XI 酶的工程菌进行改造
【详解】（1）木糖转运体能特异性地转运木糖而非葡萄糖，主要取决于木糖转运体蛋白质活性中心的空
间结构，因为该部位决定了其转运的物质种类，而所有蛋白质中氨基酸的连接方式都是相同的，即通过肽
键连接，且膜上的转运蛋白质合成和加工的细胞器也是相同的，均为核糖体、内质网和高尔基体；膜两侧
木糖和葡萄糖的浓度不是影响该转运体是否能转运葡萄糖的因素，即D 正确，ABC 错误。
故选D。
（2）A、重组酵母的木糖转运体的转运效率不高，因而无法提高木糖的利用率，A 正确；
B、结合图示可知，酒精发酵与木糖代谢竞争NADH，因而不能高效利用木糖，B 正确；
C、结合图示可知，导入的XR 酶和XDH 酶的基因在酵母细胞中表达了，并起到相应的作用，C 错误；
D、酵母胞质内环境与XR、XDH 等酶的最适反应环境不一致进而导致酶活性下降，因而木糖的利用效率
5
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低，D 正确。
故选ABD。
（3）为了使XK 基因与载体质粒有效连接，可以通过PCR 技术在XK 基因的上下游引入限制性内切核酸
酶Bcl Ⅱ的识别序列，之所以这样设计是因为在质粒的启动子和终止子之间只有该限制酶的识别序列，因
此为了实现目的基因和载体的连接，需要在引物的5’端添加上该限制酶的识别序列，再用对应酶切后通过
DNA 连接酶连接。由于引物的作用是在DNA 聚合酶的催化下，在引物的3’端连接上脱氧核苷酸，因此，
设计的扩增引物位置是图2 中的②③。
（4）制备工程菌a 导入的是质粒a 和质粒b，其中含有的是亮氨酸合成酶基因和尿嘧啶合成酶基因，因此
所用的受体细胞是②亮氨酸缺陷型酿酒酵母、③尿嘧啶缺陷型酿酒酵母；制备工程菌b 导入的是质粒b，
质粒b 中含有尿嘧啶合成酶基因，因此，所用的受体细胞是③尿嘧啶缺陷型酿酒酵母；由于受体菌中导入
了重组质粒a 和b，因而成功导入的工程菌应该具有合成亮氨酸和尿嘧啶的能力，同时也可利用木糖，因
此可在培养基中加入⑤木糖为唯一碳源、⑥缺少亮氨酸、⑦缺少尿嘧啶将工程菌a 筛选出来；工程菌b 中
由于导入了重组质粒b，因此具有利用木糖的能力和自身合成尿嘧啶的能力，即需要用作筛选的培养基中
加入⑤木糖为唯一碳源、⑦缺少尿嘧啶。
（5）工程菌a 与工程菌b 相比，导入了与增强启动子相连的XK 基因，使得细胞超表达XK 酶，提高了木
糖代谢的中间产物木酮糖转变为X5P 的效率，有利于产物向乙醇发酵转化。由表中数据可知，工程菌a 的
木糖利用率较工程菌b 提高，木糖醇产量大大减少，说明木酮糖得快速代谢也解除了中间产物对前置反应
的抑制作用，加快了木糖的利用和转化，因而工程菌a 的使用能提高乙醇的产量。
（6）导入XI 酶基因的酿酒酵母在实际的葡萄糖木糖共底物发酵实验中并没有表现出比野生型酿酒酵母更
优良的木糖利用率和乙醇产率，其可能的原因是酵母体内并不能为木糖转运过程和XI 酶活性提供最适的
反应温度，因而导致乙醇产量低，为此可以运用定点突变或定向进化的蛋白质工程策略对表达XI 酶的工
程菌进行改造，设法提高乙醇的产量。
5．（2024·上海虹口·二模）利用生物工程生产宫颈癌疫苗
人乳头瘤病毒（HPV）是一类DNA 病毒，持续感染高危型HPV 可能引发宫颈癌。感染HPV 后，人体内发
生的部分生理过程如图1 所示，其中，Ⅰ~Ⅳ表示免疫细胞；L1 为HPV 病毒表面抗原，E6 和E7 皆为HPV
病毒内部蛋白；p53 蛋白和pRb 蛋白皆为抑癌蛋白。
6
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(1)人体感染HPV 后，图1 中细胞Ⅱ的功能是 。（多选）
A．分泌免疫活性物质 B．清除被病毒入侵的细胞I
C． 清除被病毒入侵的上皮细胞 D．识别靶细胞抗原肽-MHC 分子复合体
(2)图1 中细胞Ⅲ参与的免疫应答属于 。（多选）
A．非特异性免疫 B．特异性免疫
C． 体液免疫 D．细胞免疫
(3)据图1 分析，长期感染高危型HPV 诱发宫颈癌的原因可能是HPV 的 。（多选）
A．E7 蛋白降解pRb 蛋白，促进上皮细胞DNA 的复制
B．E7 蛋白与pRb 蛋白结合，促进上皮细胞由G1 期进入S 期
C． E6 蛋白与p53 蛋白结合，抑制上皮细胞DNA 聚合酶的合成
D．E6 蛋白激活p53 蛋白，促进上皮细胞纺锤体相关蛋白的合成
注射HPV 疫苗是预防宫颈癌的有效手段。制备预防型HPV 疫苗的部分流程如图2 所示，其中，Ⅰ~Ⅳ表
示过程；kb 表示1000 碱基对；AbAr为真菌类抗生素（AbA）的抗性基因；α-半乳糖苷酶基因表达的酶蛋
白可将一种无色化合物（X-α-gal）水解成蓝色产物；pMD 上仅在α-半乳糖苷酶基因的两端存在BamHI 和
XhoI 的酶切位点。
7
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(4)据图2 判断，基因工程生产预防型HPV 疫苗所需要的工具酶有 。（编号选填）
BamHI
①
MboI
②
XhoI
③
DNA
④
连接酶
(5)据图1、2 推断，基因工程制备预防型HPV 疫苗的目的基因是 。（编号选填）
L1
①
基因 ② E6 基因 ③ E7 基因 ④ MHC
(6)图2 中过程Ⅳ所用的选择培养基需在通用液体培养基的基础上添加 。（编号选填）
① 琼脂 ② 生长因子 ③ 水
AbA
④
X-α-gal
⑤
⑥无机盐
(7)据图2 判断，将 （蓝色/白色）菌落中的pMD-HPV 分子用过程Ⅱ中的限制性内切核酸酶完全酶切
后，理论上凝胶电泳上出现的条带的长度为 kb。
(8)为提高HPV 疫苗对免疫系统的激活能力，据相关信息及已学知识推测，可采取的做法有 。（多
选）
A．利用定向进化技术获得新型抗原蛋白
B．利用定点突变技术获得天然抗原蛋白
C． 避免接种期间使用免疫抑制剂类药物
D．根据年龄、感染风险等制定接种方案
【答案】(1)ABCD
(2)BC
(3)BD
(4)①②③④
(5)①
(6)①④⑤
(7) 白色 1.6 和2.7
(8)CD
【详解】（1）图1 中细胞Ⅱ为被激活的细胞毒性T 细胞，在发挥细胞免疫作用额过程中，可通过特异性识
别靶细胞抗原肽-MHC 分子复合体，识别并亲密接触被病毒侵染的细胞Ⅰ和被病毒侵染的宫颈上皮细胞，
8
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通过释放穿孔素、颗粒酶等免疫活性物质，诱导靶细胞裂解凋亡，ABCD 正确。
故选ABCD。
（2）由图可知，细胞Ⅲ增殖分化形成了细胞Ⅳ，细胞Ⅳ能产生抗体，则细胞Ⅳ为浆细胞，细胞Ⅲ为B 细
胞。B 细胞参与的免疫反应属于特异性免疫中的体液免疫，BC 正确，AD 错误。
故选BC。
（3）由图可知，长期感染高危型HPV 后，通过病毒的E6 蛋白激活p53 蛋白，是p53 蛋白降解，解除了宫
颈上皮细胞周期中S 期进入G2期的抑制作用，使细胞进行G2期的代谢活动，合成分裂过程中必须的蛋白
质，比如与纺锤体相关的蛋白质；同时，病毒的E7 蛋白与pRb 蛋白结合，解除了对宫颈上皮细胞周期中
G1期进入S 期的抑制，促进上皮细胞由G1期进入S 期，开启DNA 复制过程。BD 正确，AC 错误。
故选BD。
（4）由图可知，目的基因左端的限制酶识别序列为
，是限制酶MboⅠ，右端的限制酶
识别序列为
，是限制酶XhoⅠ。根据题干信息，载体pMD 上仅在α-半乳糖苷酶基因的
两端存在BamHI 和XhoI 的酶切位点，虽然目的基因两端的限制酶种类与载体的种类有差异，但限制酶
MboⅠ与BamHI 可切割出相同的黏性末端，因此可选用MboⅠ与XhoⅠ切割目的基因，用BamHI 和XhoI 切
割载体，得到相同的黏性末端后使用DNA 连接酶连接形成重组DNA 分子。故选①②③④。
（5）据图1 可知，HPV 病毒的表面抗原是L1 蛋白，刺激机体产生特异性免疫反应的蛋白质是L1，因此制
作疫苗的过程中，应用L1 基因作为目的基因，故选①。
（6）在通用液体培养基的基础上，过程Ⅳ需要对工程菌进行筛选和分离，因此需要固体培养基，应添加
凝固剂琼脂；因将目的基因导入受体细胞的成功率并非100%，此步骤之后的酵母菌可能有普通酵母菌和
导入成功的酵母菌。又因基因表达载体的构建成功率并非100%，导入受体细胞的可能为普通质粒和含有
目的基因的重组质粒。综上所诉，培养的酵母菌具有以下类型：导入不成功的酵母菌，不具AbA 抗性；导
入普通质粒的酵母菌，具有AbA 抗性，且能表达α-半乳糖苷酶蛋白，能使无色化合物（X-α-gal）水解成
蓝色产物；导入含有目的基因的重组质粒，具有AbA 抗性，不能表达α-半乳糖苷酶蛋白，不能使无色化合
物（X-α-gal）水解成蓝色产物。因此未筛选出成功导入含有目的基因的重组质粒的酵母菌，还需添加AbA
和X-α-gal。选项中无机盐、水在通用培养基中含有，受体细胞为酵母菌，在通用培养基额基础上不需要特
别添加生长因子。故选①④⑤。
（7）具(6)题分析可知，白色的菌落可能为成功导入基因表达载体的酵母菌，因此因选白色菌落中的pMD-
HPV 分子，用过程Ⅱ中的限制性内切核酸酶完全酶切，用酶MboI 切目的基因和用酶BamHI 切质粒后获取
了相同的黏性末端，用DNA 连接酶连接后的序列不能再被酶BamHI 识别并切割，但因酶MboI 的识别序
列只有四对碱基对，切割位点鸟嘌呤脱氧核苷酸的5‘端不限定脱氧核苷酸种类，因此重组质粒能被酶XhoI
9
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和酶MboI 分别切割一次，一个环状重组质粒被切割为两个链状DNA 片段，变为原有的目的基因以及酶切
后的质粒，目的基因长度为1.6kb，则另一个DNA 片段为2.7kb。
（8）A、疫苗的作用为刺激机体产生免疫反应获得记忆细胞和抗体，当相同抗原再次刺激机体时，能诱发
二次免疫，获得更快更强的免疫反应，达到预防疾病的目的，因此抗原蛋白应该是HPV 病毒原本的抗原蛋
白，不需要获得新型抗原蛋白，A 错误；
B、指导合成天然抗原蛋白的基因在自然界中存在，不需要利用定点突变技术获得，B 错误；
C、接种疫苗期间使用免疫抑制剂类药物，则接种疫苗后很难激活机体的免疫系统，获得的记忆细胞与抗
体效果不佳，因此应避免接种期间使用免疫抑制剂类药物，C 正确；
D、个体年龄不同，机体免疫能力不同，感染HPV 的风险等级不同，因此应根据年龄、感染风险等制定接
种方案，达到最佳接种效果，D 正确。
故选CD。
6．（2024·安徽·二模）科学家为了提高某种果实的储藏时间，从该植物体内提取Ers1 基因（乙烯受体基
因），按照图示流程将 Ers1 基因重新导回该植物，致使该植物原有Ers1 基因翻译受抑制。已知限制酶
Hpal 切割后为平末端， Xhol 和 BamH1 切割后露出的黏性末端碱基序列不同，据图分析，提取的目的基
因两端需添加的限制酶的识别序列为（ ）
注：LB、RB 分别为T-DNA 的左边界、右边界
A．目的基因A 端添加Hpal 的识别序列， B 端添加Xhol 的识别序列
B．目的基因A 端添加Xho1 的识别序列，B 端添加Hpal 的识别序列
C．目的基因A 端添加Xhol 的识别序列，B 端添加BamH1 的识别序列
D．目的基因A 端添加Hpol 的识别序列， B 端添加Hpol 的识别序列
【答案】B
【详解】由于质粒的启动子内有 BamHI 的切割位点， 所以目的基因两端不能添加BamHI 的识别序列；
若要使插入的目的基因能抑制原有 Ersl 基因的表达，该目的基因应反向插入 T-DNA 中，使其转录的
mRNA 与细胞中原有 Ersl 基因转录的mRNA 互补而抑制其翻译，再结合目的基因的转录方向，可确定目
的基因A 端添加 XhoI 的识别序列，B 端添加Hpa I 的识别序列；目的基因 A 端添加 Hpa I 的识别序列，
B 端添加Hpa I 的识别序列， 不能确保目的基因反向插入T-DNA 中， ACD 错误，B 正确。
故选B。
10
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7．（2024·湖南怀化·二模）抗菌肽是一类具有广谱抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,细菌不易对其产生耐
药性且无残留等,被认为是理想的抗生素替代品。为了突破抗菌肽在畜禽养殖业广泛应用的瓶颈，我国研究
人员运用小分子泛素蛋白（SUMO）融合技术将含有重组抗菌肽LLv 基因的质粒导入大肠杆菌，表达融合
蛋白SUMO-LLv,并优化了表达条件,从而能高效获得重组抗菌肽 LLv。所用质粒含有卡那霉素抗性基因
(KanR)、LacZ 基因及SacⅠ、XhoⅠ酶切位点等，其结构和构建重组质粒的过程如图1 所示。据此分析回答以
下问题：
注：LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
(1)扩增LLv 基因时，PCR 反应体系中含有的酶有 ；已知该基因序列不含图1 中限制酶的识
别序列，为了使其能与已被酶切的质粒连接，需根据 设计引物。
(2)LLv 基因以a 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'。该基因内部没有SacⅠ、XhoⅠ这
两种酶切位点。图1 中酶切位点1 和2 所对应的酶分别是 。
(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，需用CaCl2处理大肠杆菌，其目的是 。
(4)为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal 等成分的培养基中进
行接种，结果如图2，该同学采用的接种方法是 。图2 中出现的 菌落即成功导入重组
质粒的大肠杆菌菌落，判断的理由是 。
【答案】(1) 耐高温的 DNA 聚合酶 LLv 基因两端的部分核苷酸序列和 Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ的识别序
列
(2)Xho Ⅰ、Sac Ⅰ（二者顺序不可调换）
(3)使大肠杆菌变为感受态细胞，便于从周围环境吸收 DNA 分子
(4) 稀释涂布平板法 白色 目的基因（或 LLv 基因）的插入破坏了 LacZ 基因的结构，使
其不能正常表达形成β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不会被分解
【详解】（1）PCR 技术的基本原理是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于TaqDNA
聚合酶的酶促合成反应，即扩增LLv 基因时，PCR 反应体系中含有的酶有耐高温的 DNA 聚合酶。PCR 过
程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。目的基因需要与质粒进行连接，
但已知LLv 基因序列不含图1 中限制酶（ Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ）的识别序列，为了使LLv 基因能与已被酶切的
质粒连接，需要根据LLv 基因两端的部分核苷酸序列和 Sac Ⅰ、 Xho Ⅰ的识别序列设计引物。
（2）LLv 基因以a 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'，DNA 模板被转录方向是从
11
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3→5′，即图1 中酶切位点1 对应的酶为Xho Ⅰ，酶切位点2 对应的酶为Sac Ⅰ。
（3）将目的基因导入微生物细胞，常用Ca2+处理微生物，使微生物细胞处于感受态，便于从外界环境吸收
DNA 分子。
（4）分析菌落分布可知，采用的接种方法是稀释涂布平板法。为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选
出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal 等成分的培养基中进行接种，目的基因（ LLv 基因）的插入破坏
了 LacZ 基因的结构，使其不能正常表达形成β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不会被分解，使菌落为白色，因
此图2 中出现的白色菌落即成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落。
8．（2024·重庆·二模）人血清白蛋白（
）是血浆蛋白的主要成分，具有维持血浆渗透压和进行物质
运输的功能。科学家利用转基因技术获得转
基因的大肠杆菌，通过发酵工程，实现
的大量生产，
下图表示
基因。下列叙述错误的（ ）
A．
过程每次循环分为3 步，其中温度最低的一步是第二步
B．扩增出
基因并用于表达载体的构建，应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ
C．在
反应缓冲液中加入
的作用是激活耐高温的
聚合酶
D．用
方法检测大肠杆菌是否导入
基因，预变性过程可促进模板
边解旋边复制
【答案】D
【详解】A、PCR 过程每次循环分为变性、复性和延伸3 步，其中温度最低的一步是第二步复性，A 正确；
B、引物结合在模板链的3'端，使子链从5'→3'延伸，扩增出HSA 基因并用于表达载体的构建，应选择引
物Ⅱ和引物Ⅲ，B 正确；
C、在PCR 反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA 聚合酶，C 正确；
D、用PCR 方法检测大肠杆菌是否导入HSA 基因，与细胞内DNA 复制不同，预变性过程可促进模板DNA
全部打开，不是边解旋边复制，D 错误。
故选D。
9．（2024·广东湛江·二模）通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身的细胞在体外诱导发育成特定的组
织器官，然后再移植回患者体内。图1 和图2 表示利用自身细胞进行器官移植的两种方法，其中诱导多能
干细胞（iPS 细胞）类似于人类的胚胎干细胞。下列叙述正确的是（ ）
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A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2
培养箱中
B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者的完全相同，因此移植后不会发生免疫排斥
反应
C．可利用农杆菌转化法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox 基因、c-Myc 基因和Klf 基因导入成纤维
细胞
D．图2 中卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可整个注
入去核的卵母细胞中
【答案】D
【详解】A、两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有 95%空气和5%CO2的混合气体
的CO2培养箱中，A 错误；
B、图1 所示方法导入了 Oct3/4 基因、Sox 基因、c-Myc 基因和Klf 基因，图2 中提供质遗传物质的卵母
细胞的来源未知，因此两种方法所获得的组织器官的遗传物质均可能和患者的不完全相同，B 错误；
C、将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的
方法，C 错误；
D、核移植的过程中，卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，
可将整个供体细胞注入去核的卵母细胞中，D 正确。
故选D。
10．（2024·惠州·二模）诱变育种和基因工程育种均为实验室常用的生物育种手段。已知玉米的抗虫性状
由一对等位基因调控，为了得到抗虫玉米植株，某实验室对野生型玉米种子进行了不同方法的处理后得到
目的植株。回答下列问题：
(1)该实验室对野生型玉米种子进行了诱变处理，进行培育、筛选后得到突变植株，该植株自交，后代中抗
虫植株约占1/4，说明诱变引起的突变为 （填“隐性”或“显性”）突变。进一步研究发现，该
突变是由野生型某个基因发生一个碱基由G 到A 的替换导致的，则野生型基因和抗病基因的碱基序列长
度 ，碱基序列 。（后两空填“相同”或“不同”）
(2)该实验室利用农杆菌转化法将外源抗虫基因（cry）转入野生型玉米细胞得到转化细胞，并将其培育成植
株X，过程如图1 所示，其中1、2 代表染色体，抗氨苄青霉素基因（AmpR）为标记基因。已知该品种玉
米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换。
第二部分 效果验证
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①忽略抗虫基因和抗性基因的区别，仅根据两个基因在染色体上位置，除图1 中的转化细胞种类外，请在
图2 中画出还可能得到的其他种类的转化细胞 。
②研究表明，标记基因的产物对细胞具有一定的毒害作用，因此为了得到抗虫性状稳定遗传且不含标记
基因产物的优良植株，可将植株X 进行自交从而获得预期目的的植株。为达到该目的，是否可以将cry 基
因和AmpR基因用同一个 Ti 质粒进行转运？ （填“可以”或“不可以”），原因是 。
【答案】(1) 隐性 相同 不同
(2)
不可以 若将
cry 和AmpR 用同一个 Ti 质粒进行转运，则cry 基因和AmpR基因会位于同一条染色体上，由题意可知，
该品种玉米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换，因此无法获得不含标记基因，只含目的基因的优
良植株
【详解】（1）植株自交，后代中抗虫植株约占1/4，说明抗虫为隐性性状，即说明诱变引起的突变为
隐性突变。研究发现该突变是由野生型某个基因发生一个碱基由G 到A 的替换导致的，说明该突变的实质
是发生了碱基对的替换，因此野生型基因和抗病基因的碱基序列长度相同，碱基序列不同。
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（2）①cry 基因和AmpR基因可能均位于1 号（或2 号）染色体的同一条染色体上，也可能分别位于1 号
染色体的两条染色体上，或者分别位于1 号和2 号染色体上，故其他种类的转化细胞下图：
。
②抗虫性状稳定遗传且不含标记基因产物的优良植株的细胞中，两个cry 基因应该分别位于1 号（或2
号）染色体的两条染色体上。若将cry 基因和AmpR基因用同一个Ti 质粒进行转运，则cry 基因和AmpR基
因会位于同一条染色体上，由题意可知，该品种玉米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换，因此无
法获得不含标记基因，只含目的基因的优良植株，所以不可以将cry 基因和AmpR基因用同一个 Ti 质粒进
行转运。
11．（2024·广东茂名·二模）融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与
其他蛋白融合而产生的新型蛋白，常用于亲和蛋白质纯化和抗体药物的研发。图是原核细胞融合蛋白基因
表达载体，科研工作者在启动子Pc 下游插入了两个与分离纯化有关的编码序列——谷胱甘肽转移酶基因
（GST 基因）及凝血蛋白酶切割位点的编码序列。
回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，需要用到的工具有 。上述融合表达载体中启动子Ptac 的作用是
。
(2)当外源基因插入后，可表达出由 （填“二”或“三”）部分序列组成的融合蛋白。
(3)GST 对谷胱甘肽有很强的结合能力。将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白
的全细胞提取物通过层析柱时， 将吸附在树脂内，其他细胞蛋白先被洗脱出来。接着用含游离
的还原型谷胱甘肽的缓冲液将融合蛋白洗脱。最后用 切割融合蛋白，即可获得纯化的目的蛋白。
(4)Fc 融合蛋白由某种具有生物学活性的功能蛋白分子与抗体恒定区的Fc 片段融合而成。该类融合蛋白不
仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体的性质，如长效半衰期。抗原在血浆中游离时
间越久，越容易被蛋白酶降解。
①利用哺乳动物细胞表达Fc 融合蛋白比在原核细胞中表达更具优势的理由是 。
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②目前疫苗设计的关键在于有效活化抗原呈递细胞（APC），APC 表面能够表达Fc 受体，常利用抗原—
Fc 融合蛋白作为抗原运载工具，其原因是 。
【答案】(1) 限制酶、DNA 连接酶、载体 与RNA 聚合酶结合，驱动转录
(2)三
(3) 融合蛋白 凝血蛋白酶
(4) 真核生物能对基因转录后的mRNA 进行剪接加工，而原核生物不能进行；真核细胞具有内质网、
高尔基体，能对表达产生的蛋白质进行糖基化等修饰。 借助Fc 片段靶向结合APC，缩短抗原在血浆
中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的呈递。
【详解】（1）构建基因表达载体时，需要用到的工具有限制酶、DNA 连接酶、载体。融合表达载体中启
动子Ptac 的作用是与RNA 聚合酶结合，驱动转录。
（2）当外源基因插入后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。
（3）将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，
融合蛋白将吸附在树脂内，其他细胞蛋白先被洗脱出来。接着用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液将融合
蛋白洗脱。最后用凝血蛋白酶切割融合蛋白，即可获得纯化的目的蛋白。
（4）①真核生物能对基因转录后的mRNA 进行剪接加工，而原核生物不能进行；真核细胞具有内质网、
高尔基体，能对表达产生的蛋白质进行糖基化等修饰，则哺乳动物细胞表达F℃融合蛋白比在原核细胞中
表达更具优势。
②常利用抗原—Fc 融合蛋白作为抗原运载工具的原因是借助Fc 片段靶向结合APC，缩短抗原在血浆中的
游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的呈递。
12．（2024·安徽宣城·二模）干扰素是人体细胞产生的一种免疫活性物质，其化学本质是糖蛋白，具有广
泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性。某研究小组欲通过基因工程，以酵母菌和CHO 细胞系（由中国仓
鼠的卵巢细胞转化而来）作为受体细胞分别生产人干扰素，并比较两种表达系统生产的产物特点，请回答
下列问题：
第一步：培养基的制备及灭菌。
(1)第二步：酵母菌的诱变和筛选：为获得增殖能力强的酵母菌，将高浓度的酵母菌种进行紫外线诱变后，
用移液管取 的酵母菌液0.1mL 加到固体培养基上进行涂布，以保证获得菌落数为30～300 的平
板。为了使涂布均匀，通常进行的操作 。
(2)第三步：制备CHO 细胞系：经过多次传代培养后获得，由于这种细胞系仍保留 的特性，因此细胞
的增殖随细胞密度增加而逐渐停止。
(3)第四步：转基因操作过程：
①目的基因常用PCR 扩增大量获取。构建PCR 扩增体系需要加入引物、模板、4 种脱氧核苷酸、H2O，除
此之外，还需加入 （至少写出2 个）。
②构建重组DNA 分子。
③将重组DNA 导入酵母菌和CHO 细胞中，筛选后进行培养获取目标产物。
(4)第五步：两者相比较，CHO 表达系统有很多优点：第一，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特
性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子；第二，具有重组基因的高效复制和表达能力，从而能获得较
多数量的 和大量目标蛋白产物：第三，CHO 细胞属于改造的成纤维细胞，很少产生自身蛋白
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质，利于目标蛋白的 。
【答案】(1) （梯度）稀释 边涂布边转动培养皿
(2)接触抑制
(3)耐高温的DNA 聚合酶（Taq 酶）、Mg2+、缓冲液
(4) 目的基因 分离和纯化
【详解】（1）用稀释涂布平板法进行接种时，需要用移液管取样，取梯度稀释的酵母菌液0.1mL 加到固
体培养基上进行涂布；为了使涂布均匀，通常进行的操作是边涂布边转动培养皿。
（2）经过多次传代培养后，获得的细胞系仍保留接触抑制的特性，依然存在细胞的增殖随细胞密度增加
而逐渐停止的现象。
（3）目的基因常用PCR 扩增大量获取。构建PCR 扩增体系需要加入引物、模板、4 种脱氧核苷酸、
H2O，除此之外，还需加入耐高温的DNA 聚合酶（Taq 酶）、Mg2+（激活DNA 聚合酶）、缓冲液（维持
pH）。
（4）两者相比较，酵母菌相对简单，而CHO 为动物细胞转化而来，CHO 表达系统有很多优点，包括以下
方面：具有重组基因的高效扩增（复制）和表达能力，从而能获得较多数量的目的基因和大量目标蛋白产
物；CHO 细胞属于改造的成纤维细胞，很少产生自身蛋白质，利于干扰素的分离和纯化。
13．（2024·上海嘉定·二模）近年来随着甲醇工业产能过剩的情况日益严重，研究人员通过构建甲醇工程
菌来有效利用甲醇。RuMP 途径是目前研究较多的甲醇同化途径之一，其中MDH 酶是同化甲醇的关键酶
之一，现科学家利用下图质粒构建表达载体，制备可利用甲醇的大肠杆菌。
(1)为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载体，需在目的基因的两端加上 的碱基序列。
（编号选填）
EcorR I
Kpn I
Acc65 I
①
②
③
Bgl Ⅱ
④
(2)结合上述信息，以下叙述正确的是 。
A．受体细胞应选取氨苄青霉素敏感型
B．可以使用Ca2+处理大肠杆菌，使重组质粒能够被其吸收
C．培养受体细胞的培养基必须加入甲醇
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在培养基上生长
(3)待培养12h 后，挑取单菌落分离DNA 进行PCR 扩增，若扩增后的DNA 样品电泳结果显示有968bp 和
1566bp 两个片段，则下图（深色部分为目的基因区段）中对应两个片段的引物组合分别为 和
。（请用图8 中编号选填）
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(4)检测上述构建的甲醇工程菌，其MDH 的表达量远高于一般大肠杆菌，但仍无法确定是否成功构建能同
化甲醇能力较强的工程菌。下列叙述中能支持该观点的是 。
A．尚未对工程菌合成的相关蛋白的活性进行测定
B．尚未对工程菌分解甲醇的能力进行鉴定
C．尚未在个体生物学水平进行抗原-抗体杂交
D．尚未对目的基因进行碱基序列的测定和比较
(5)利用DNA 探针（单链DNA）能与待测样本中mRNA 互补结合形成双链复合杂交体，从而可确定受体细
胞中是否含有目的基因。检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因，原因可能是表达过程中的
过程受阻；现拟对原因做出进一步的精准判断，请简要写出实验思路和预期结果： 。
【答案】(1)①④
(2)AB
(3)
②④
⑤⑦
(4)AB
(5) 转录或翻译
实验思路：用目的基因的一条链设计成探针，对目的基因的转录产物mRNA 进行分子杂交，检测是否出现
杂交带
预期结果：如果出现杂交带，说明出现这种现象的原因是由于翻译过程受阻导致的；如果没有出现杂交带，
说明出现这种现象的原因是转录过程受阻导致的。
【详解】（1）由题图可知，KpnⅠ的酶切位点在Ampr之中，Acc65Ⅰ识别的序列与 KpnⅠ识别的序列相同，
因此不能选择KpnⅠ和Acc65Ⅰ，否则会破坏Ampr，因此为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载
体，需在目的基因的两端加上EcorRⅠ和BglⅡ的碱基序列，即选择 ①④；
（2）A、要使目的基因能在受体细胞内稳定存在并表达，所选择的受体细胞应为氨苄青霉素敏感类型，A
正确；
B、用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，能使其吸收重组质粒，B 正确；
C、培养受体细胞的培养基不能加入甲醇，C 错误；
D、目的基因成功表达的标志是能利用甲醇，而不是受体细胞能在培养基上生长，D 错误。
故选AB。
（3）由图可知，若扩增后的DNA 样品电泳结果显示有968bp 片段则为②④组合，如果是1566bp 片段，则
对应两个片段的引物组合分别为⑤⑦；
（4）检测上述构建的甲醇工程菌，其MDH 的表达量远高于一般大肠杆菌，但仍无法确定是否成功构建能
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同化甲醇能力较强的工程菌。可能是原因是尚未对工程菌合成的相关蛋白的活性进行测定及尚未对工程菌
分解甲醇的能力进行鉴定，故选AB；
（5）检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因，原因可能是表达过程中的转录或翻译过程受阻；
要对原因做出进一步的精准判断，可以用目的基因的一条链设计成探针，对目的基因的转录产物mRNA 进
行分子杂交，检测是否出现杂交带，如果出现杂交带，说明出现这种现象的原因是由于翻译过程受阻导致
的；如果没有出现杂交带，说明出现这种现象的原因是转录过程受阻导致的。
14．（2024·麻城·二模）研究表明miR160（一类内源非编码单链小RNA），主要通过影响基因的表达来参
与细胞分化、生长和发育等多种生物学调控，并在小麦抵抗低温胁迫时具有重要作用。图1 为冷害胁迫下
miR160 和对应靶基因(TaARF11-7A)的表达水平。
为进一步探究miR160 的作用，研究人员利用短串联靶标模拟技术（STTM）构建了miR160 沉默小麦，其
原理见图2，图2 中过程④是miRNA 的作用机理，过程③是短串联靶标模拟技术（STTM）沉默miRNA 的
作用机理。
(1)据图1、2 分析，miR160 对TaARF11-7A 基因表达的影响是 （促进/抑制）。
(2)图2 中，存在A—U、C—G 碱基互补配对的过程有 。（请用图2 中编号选填）
(3)根据图2 的过程③、④、⑤、⑥，阐述科研人员利用短串联靶标模拟技术（STTM）构建miR160 沉默小
麦的思路。 。
低温胁迫会增加小麦活性氧（ROS）的产生，导致次生氧化损伤。超氧化物歧化酶（SOD）可清除ROS，
丙二醇（MDA）的含量可反映出细胞内氧化损伤的程度。图3 为常温和冷害胁迫下两组小麦存活率、SOD
酶活性、MDA 含量，其中“*”表示两组数据存在显著差异。
(4)根据上述信息分析，关于小麦抵抗冷害胁迫的机制说法正确的是 。
A．冷害胁迫会增加miR160 的表达量
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B．冷害胁迫后，TaARF11-7A 基因发生突变而改变了碱基序列
C．miRNA 影响靶基因的表达是通过直接与靶基因mRNA 结合所致
D．TaARF11-7A 的表达量下降，可能会导致细胞中SOD 酶活性上升
E．TaARF11-7A 的表达量下降，可能会导致细胞中MDA 含量上升
F．miR160 基因沉默小麦的耐寒性下降可能与ROS 清除能力的下降有关
某研究小组发现部分二倍体野生型小麦经历严冬之后会变异为四倍体小麦，并对四倍体小麦做了抗寒实验，
发现其更适应寒冷环境。
(5)以下是二倍体小麦和四倍体小麦细胞分裂的模式图，其中为四倍体小麦次级精母细胞的图是 。
A．
B．
C．
D．
(6)四倍体小麦和二倍体小麦并非是同一物种，原因是它们 。
A．基因完全不同
B．存在地理隔离
C．存在生殖隔离
D．蛋白质完全不同
(7)推测寒冷环境下四倍体小麦更适应寒冷环境的原因是其 。
A．miR160 含量更多
B．SOD 酶活性更强
C．MDA 含量更多
D．TaARF11-7A 基因数更多
【答案】(1)抑制
(2)①③⑥
(3)野生型小麦中miRNA 正常表达后，能与AGO 蛋白结合形成RNA 诱导沉默复合体，该复合体通过与靶
基因mRNA 结合，阻碍其转录过程。miR160 沉默小麦由于导入了STTM 且与miRNA 结合，解除miRNA
对靶基因mRNA 翻译的抑制，靶基因mRNA 能正常表达。
(4)ADF
(5)A
(6)C
(7)AB
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【详解】（1）据图1，miR160 增多，TaARF11-7A 相对表达水平较低，图2miR160 与AGO 蛋白形成RNA
诱导沉默复合体，抑制TaARF11-7A 基因表达。
（2）图2 中，存在A—U、C—G 碱基互补配对的过程有①转录、③STTMRNA 与miRNA 配对、
⑥miRNA 与靶基因mRNA 结合。
（3）科研人员利用短串联靶标模拟技术（STTM）构建miR160 沉默小麦的思路为野生型小麦中miRNA 正
常表达后，能与AGO 蛋白结合形成RNA 诱导沉默复合体，该复合体通过与靶基因mRNA 结合，阻碍其转
录过程。miR160 沉默小麦由于导入了STTM 且与miRNA 结合，解除miRNA 对靶基因mRNA 翻译的抑制，
靶基因mRNA 能正常表达。
（4）根据图3 分析，miR160 基因沉默小麦体内TaARF11-7A 的表达量上升，在冷害胁迫下，存活率下降，
SOD 酶活性下降，MDA 含量上升。
A、冷害胁迫会增加miR160 的表达量，减少TaARF11-7A 的表达量，A 正确；
B、冷害胁迫并未使TaARF11-7A 基因发生突变，B 错误；
C、miRNA 影响靶基因的表达是需miR160 与AGO 蛋白形成RNA 诱导沉默复合体，诱导沉默复合体与靶
基因mRNA 结合所致，C 错误；
D、TaARF11-7A 的表达量下降，可能会导致细胞中SOD 酶活性上升，D 正确；
E、TaARF11-7A 的表达量下降，可能会导致细胞中MDA 含量下降，E 错误；
F、miR160 基因沉默小麦的耐寒性下降，细胞中SOD 酶活性下降，可能与ROS 清除能力的下降有关，F
正确。
故选ADF。
（5）四倍体小麦次级精母细胞处于减数分裂Ⅱ时期，前期中期含有两个染色体组，且每条染色体含有两
个DNA，后期着丝粒分裂，姐妹染色单体分开，据此A 正确，BCD 错误。
故选A。
（6）能相互交配并产生可育后代的为同一物种，四倍体小麦和二倍体小麦并非是同一物种，原因是它们
存在生殖隔离，C 正确，ABD 错误。
故选C。
（7）A、冷害胁迫会增加miR160 的表达量，减少TaARF11-7A 的表达量，寒冷环境下四倍体小麦miR160
含量更多，更适应寒冷环境，A 正确；
B、寒冷环境下四倍体小麦SOD 酶活性更强，清除ROS，更适应寒冷环境，B 正确；
C、MDA 含量更多，细胞氧化损伤的程度更高，C 错误；
D、TaARF11-7A 基因数更多，更不利于适应寒冷环境，D 错误。
故选AB。
15．（2024·恩施·二模）图甲为某种棉花的酶D 基因及拟南芥叶绿体膜上的转运肽基因，图乙为Ti 质粒。
为增加油菜种子的含油量，可将酶D 基因与转运肽基因相连，导入油菜叶片细胞并获得高产转基因油菜品
种。下列叙述正确的是（ ）
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A．用限制酶ClaI 和DNA 连接酶处理图甲两种基因后，可使A、C 端相连
B．图乙的Ti 质粒被限制酶切割一次后，会产生4 个游离的磷酸基团
C．将目的基因插入图乙T-DNA 中构建重组质粒，其不可能在农杆菌中表达
D．将农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到的即为高产转基因油菜
【答案】C
【详解】A、用限制酶ClaI 切割图甲两种基因后，会使A、D 端产生相同的粘性末端，再用DNA 连接酶可
使A、D 端相连，A 错误；
B、图乙的Ti 质粒被限制酶切割一次后，会产生2 个游离的磷酸基团，B 错误；
C、将目的基因插入图乙T-DNA 中构建重组质粒，其可能在农杆菌中表达，C 错误；
D、普通的质粒也含有四环素抗性基因，故将农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到的不一定为高
产转基因油菜，D 错误。
故选C。
16．（24·武汉·二模）为研究拟南芥植株E 基因的功能，科研人员将T-DNA 插入到E 基因中，导致其发生
突变，突变后的基因记为e。为验证某拟南芥植株的基因型，科研人员根据基因E 和T-DNA 的序列，设计
了三种引物，引物的结合位置如图所示。已知完整的E 基因和T-DNA 整合后，因片段长度过大，不能完成
整个融合基因的PCR 扩增。科研人员提取该植株的总DNA，分别用引物“I+III”组合及“II+III”组合进行
PCR，两种引物组合均能完成扩增。拟南芥植株的基因型为（ ）
A．Ee
B．EE
C．ee
D．EE 或Ee
【答案】A
【详解】根据题干“已知完整的基因E 和T-DNA 整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的
PCR 扩增”，且e 的产生是T-DNA 插入到基因E 中，因此当拟南芥的基因型为EE 时，用引物“Ⅱ+Ⅲ”组
合，可以获得PCR 产物，但用引物“I+Ⅲ”组合时，不能获得PCR 产物；当拟南芥的基因型为Ee 时，用引
物“Ⅱ+Ⅲ”组合和引物“I+Ⅲ”组合时，都能获得PCR 产物；当拟南芥的基因型为ee 时，用引物“Ⅱ+Ⅲ”
组合，不能获得PCR 产物，但用引物“I+Ⅲ”组合时，能获得PCR 产物；即该拟南芥植株的基因型为Ee，
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BCD 错误，A 正确。
故选A。
17．（2024·黑龙江齐齐哈尔·二模）利用基因工程方法构建HPV-L1 重组微环DNA，即重组质粒（PP）。
图1 所示为HPV-L1 重组片段的PCR 及重组质粒（PP）的构建过程，HPV-L1 重组微环DNA 包含HPV（人
乳头瘤病毒）的L1 基因片段、编码信号肽的序列以及标签区，将其作为核酸抗原直接免疫产蛋鸡可获得
卵黄抗体，该卵黄抗体可用于HPV 的预防和治疗。利用重叠延伸PCR 技术进行定点突变可以实现对HPV-
L1 基因进行合理性改造，引物b 和引物c 为互补重叠序列，其过程如图2 所示。回答下列问题：
(1)组成质粒ZY781 载体的单体是 ，作为载体除了需要具备复制原点以及一至多个限制酶识别
和切割位点，还需具有 等结构。
(2)HPV-L1 重组片段的PCR 过程中，需要在引物A 和引物B 的5'端分别连接 ，若标签区序列
为
，引物B 的序列为，3'CAGCTGGTAGTAGTGGTAGTGGTA5'，
则引物B 的设计 （填“正确”或“不正确”），理由是 。
(3)图2 的PCR1 过程中，产物AB 是依赖引物对 扩增的结果，②过程首先使用热稳定性DNA
聚合酶进行延伸，再使用引物对 进行PCR 扩增。
(4)L1 基因片段编码HPV 的主要抗原蛋白，将编码信号肽的序列与L1 基因片段连接一起构建重组微环
DNA 的目的是 。
(5)利用质粒ZY781 构建重组质粒（PP）时，选用限制酶BglⅡ和SalI 切割质粒后，需借助电泳等技术回收
大片段。琼脂糖凝胶电泳结果中，若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是
（答出一点即可）。
【答案】(1) 脱氧(核糖)核苷酸 启动子、终止子和标记基因(答全给分)
(2) 限制酶BglⅡ和Sal I 的识别序列 不正确 Sal I 的识别序列未连接在引物的5’端
(3) a、b b、c
(4)利用信号肽将L1 基因片段表达的抗原蛋白引导到内质网进行加工
(5)引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高
等
【详解】（1）质粒的本质是一种DNA 分子，所以组成质粒ZY781 载体的单体是4 种脱氧核糖核苷酸。载
体除了需要具备复制原点以及一至多个限制酶识别和切割位点，还需具有启动子、终止子和标记基因等结
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构，基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
（2）HPV-L1 重组片段的PCR 过程中，需要在引物A 和引物B 的5'端分别连接限制酶BglⅡ和Sal I 的识别
序列 ，若标签区序列为5'CATCATCACCATCACCAT3'，3'GTAGTAGTGGTAGTGGTA5'，引物B 的序列
为3'CAGCTGGTAGTAGTGGTAGTGGTA5'，由于Sal I 的识别序列未连接在引物的5'端，所以引物B 的设
计不正确；
（3）利用重叠延伸PCR 技术进行定点突变对HPV-L1 基因进行合理性改造的过程中，据图可知，PCR1 过
程的产物AB，一条单链的一端是依赖引物a，另外一条单链的另外一端是依赖引物b，进而扩增出来的。
②过程是AB 上链和CD 下链延伸配对的结果，首先使用热稳定性DNA 聚合酶进行延伸，再根据突变位点
处引物b 和引物c 为互补重叠序列，使用引物对b、c 可以进行PCR 扩增；
（4）L1 基因片段编码HPV 的主要抗原蛋白，将编码信号肽的序列与L1 基因片段连接一起构建重组微环
DNA 的目的是利用信号肽将L1 基因片段表达的抗原蛋白引导到内质网进行进一步的加工，使抗原蛋白活
性更高一些；
（5）利用质粒ZY781 构建重组质粒(PP)时，选用限制酶BglⅡ和Sal I 切割质粒后，需借助电泳等技术回收
大片段，琼脂糖凝胶电泳结果中,若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，说明在PCR
过程中可能出现了异常，根据PCR 技术特点，可能是引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补
或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高等原因。
18．（2024·湖南衡阳·二模）某科研小组欲用图1 所示的质粒构建人胰岛素基因表达载体，让其在大肠杆
菌中表达出人胰岛素前体物质，对人胰岛素基因所在的DNA 片段进行测序，发现其两端附近无限制酶
EcoRI、BamHI 的酶切位点。已知人胰岛素基因表达时以②链为模板，且其3'端存在启动子，图1 所示质
粒上的ampR为氨苄青霉素抗性基因，telR为四环素抗性基因。请回答下列问题：
(1)可采用 来获得人胰岛素基因，这一方法需要先针对人胰岛素基因两端的序列来设计引物对。这
一方法获得的产物一般通过 进行鉴定，若鉴定发现其中有许多种相对分子质量比人胰岛素基因
小的DNA 片段，则原因可能是 （答出一点）。
(2)为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI 和BamHI 处理的图1 所示质粒上，且利用表达载体上
的启动子在受体菌中以②链为模板进行转录，则应在配对到①链的引物5'端添加6 个碱基，序列为5'-
-3'。
(3)图1 质粒上的ampR和tetR一般充当基因表达载体上的标记基因，其作用是 。利用质粒上的标记
基因，结合微生物的培养，可以淘汰只转入质粒的大肠杆菌而获得被成功转入人胰岛素基因表达载体的受
体菌，则应将重组载体导入 （填“不抗氨苄青霉素”“不抗四环素”或“不抗氨苄青霉素和四环
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素”）的受体大肠杆菌中。
【答案】(1) PCR 技术 琼脂糖凝胶电泳 胰岛素基因纯度不够
(2)GGATCC
(3) 用以检测目的基因是否导入受体细胞 不抗氨苄青霉素和四环素
【详解】（1）可采用PCR 技术来获得人胰岛素基因，这一方法需要先针对人胰岛素基因两端的序列来设
计引物对。这一方法获得的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，若鉴定发现其中有许多种相对分子质
量比人胰岛素基因小的DNA 片段，则原因可能是胰岛素基因纯度不够。
（2）人胰岛素基因表达时以②链为模板，且其3'端存在启动子，图1 所示质粒上的ampR为氨苄青霉素抗
性基因，telR为四环素抗性基因，为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI 和BamHI 处理的图1
所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以②链为模板进行转录，应在配对到①链的引物5'端
添加BamHI 识别序列，添加的6 个碱基序列为5'-GGATCC-3'。
（3）图1 质粒上的ampR 和tetR 一般充当基因表达载体上的标记基因，其作用是用以检测目的基因是否导
入受体细胞。利用质粒上的标记基因，结合微生物的培养，可以淘汰只转入质粒的大肠杆菌而获得被成功
转入人胰岛素基因表达载体的受体菌，则应将重组载体导入不抗氨苄青霉素和四环素的受体大肠杆菌中。
19．（2024·河南新乡·二模）研究开发镉污染土壤的清洁技术是改良和恢复被镉污染的土壤、合理利用土
壤资源的重要途径。植物具有富集土壤中镉元素的能力。科研人员将酵母液泡镉转运蛋白（YCF1）基因
导入受试植物，拟提高植物对镉污染土壤的修复能力，过程如图所示。回答下列问题：
(1)镉是人体的非必需元素，一般不影响人体健康。当环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集，通过
（填途径）进入人体，引起慢性中毒。
(2)扩增YCF1 基因时，一般要向PCR 反应缓冲溶液中添加Mg2+，目的是 。扩增YCFI 基因选用的引物
组合是 ，不选用其他引物的原因是 。
(3)已知A 位点是起始密码子对应的碱基序列，b 链为转录的模板链，用限制酶SamI 和PstI 同时切割含
YCFl 基因的DNA 片段。为了使YCFI 基因按照正确的方向与质粒连接，需要在A 位点相应引物的 （填
“3′”或“5′”）端添加限制酶 的识别序列。与其他方法相比，将YCF1 基因导入质粒T-DNA 的特点是
。
第三部分 强化提升
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(4)由愈伤组织细胞发育成幼苗，要经历过程③的 阶段。检测后发现土壤中的镉浓度下降，能不能说明
已经成功构建具有镉污染土壤高修复能力的转基因植物？请判断并说明理由： 。
【答案】(1)食物链
(2) 激活DNA 聚合酶，使PCR 反应顺利进行 引物2 和引物3 两个引物应分别和目的基因两
条链的3＇端结合
(3) 5′ PstI T-DNA 能将目的基因转入受体细胞染色体的DNA 上
(4) 再分化 不能；缺少对照，植物自身具有富集土壤镉的能力
【详解】（1）环境受到镉污染后,镉可在生物体内富集,通过食物链进入人体,引起慢性中毒。环境污染物通
过食物链的转移并逐级增大在生物体内的浓度，使在高营养级生物体内的浓度比在低营养级生物体内的浓
度增加很多倍。
（2）真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2+激活，因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+，使
PCR 反应顺利进行。引物2 和引物3 都与模板链的3′端序列结合，引物只能使DNA 聚合酶从引物的3′端连
接脱氧核苷酸，因此选用引物2 和引物3。
（3）b 链为转录的模板链，A 位点是起始密码子对应的碱基序列，应和启动子就近链接，据此判断需要在
A 位点相应引物的5′端添加限制酶PstI 的识别序列，便于剪切后正确插入到质粒的T-DNA 中。T-DNA 能将
目的基因转入受体细胞染色体的DNA 上。
（4）②表示脱分化，③表示再分化，由愈伤组织细胞发育成幼苗，要经历过程③的再分化阶段。检测后
发现土壤中的镉浓度下降，不能说明已经成功构建具有镉污染土壤高修复能力的转基因植物，植物具有富
集土壤中的镉元素的能力，与对照植物组相比，若转基因植物组土壤的镉浓度较低，才能说明已经成功构
建具有镉污染土壤高修复能力的转基因植物。
20．（2024·青海海东·二模）S 蛋白是新冠病毒（单链RNA 病毒）感染机体的关键组分，也是研制新冠疫
苗的关键起点。我国科学家以缺失E1基因（E1基因是腺病毒基因组复制的关键基因）等的人复制缺陷腺病
毒为载体研制新冠疫苗的部分流程如图所示，其中HEK 细胞是一种特殊的人胚胎肾细胞。回答下列问题：
(1)构建质粒Ⅰ需要的工具酶是 。将图中质粒导入HEK 细胞常用的方法是 。质粒Ⅰ和质粒Ⅱ可在相
关酶的作用下获得含S 蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒，该过程主要利用了 的生物学原理。
(2)HEK 细胞在体外培养时，所需的气体环境为 。为防止HEK 细胞在培养时受到外界环境的污染，可采
用 （答出2 点）等措施。
(3)新冠病毒易发生基因突变，原因是 。该疫苗对变异后的该病毒仍具有免疫作用，原因可能是 。
【答案】(1) 限制酶和DNA 连接酶 显微注射法 基因重组
(2) 95％空气和5％CO2 对培养液和所有培养用具进行灭菌处理、在无菌环境下进行操作
(3) 新冠病毒为单链RNA 病毒，单链RNA 结构不稳定，容易发生基因突变 变异病毒发生突变后
表达出的S 蛋白与疫苗的S 蛋白结构差异不大，人体注射疫苗后产生的抗体或记忆细胞仍能识别并清除该
病毒，疫苗仍有保护作用
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【详解】（1）质粒Ⅰ为含新冠病毒蛋白基因的质粒，故构建质粒Ⅰ需要的工具酶是限制酶和DNA 连接酶。
HEK 细胞是一种特殊的人胚胎肾细胞，将图中质粒导入HEK 细胞常用的方法是显微注射法。质粒Ⅰ和质
粒Ⅱ可在相关酶的作用下获得含S 蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒，该过程主要利用了基因重组（广义上
的）的生物学原理。
（2）HEK 细胞（动物细胞）在体外培养时，所需的气体环境为95％空气和5％CO2。为防止HEK 细胞在
培养时受到外界环境的污染，可采用对培养液和所有培养用具进行灭菌处理、在无菌环境下进行操作等措
施。
（3）新冠病毒易发生基因突变，原因是其为单链RNA 病毒，单链RNA 结构不稳定。疫苗对变异后的该
病毒仍具有免疫作用，原因可能是：变异病毒发生突变后表达出的S 蛋白与疫苗的S 蛋白结构差异不大，
人体注射疫苗后产生的抗体或记忆细胞仍能识别并清除该病毒，疫苗仍有保护作用。
21．（2024·常州·二模）选择性剪接是指一个基因的转录产物可通过不同的拼接方式形成不同的mRNA 的
过程。如图表示鼠的降钙素基因的表达过程，下列叙述错误的是（ ）
注|：CGRP 表示降钙素基因相关肽；外显子是真核生物基因编码区中编码蛋白质的序列。
A．当RNA 聚合酶移动到终止密码子时，过程①停止
B．过程②中，被转运的氨基酸与tRNA 的
端结合
C．题中鼠降钙素基因表达的调控属于转录后水平的调控
D．相同基因的表达产物不同，这有助于蛋白质多样性的形成
【答案】A
【详解】A、分析图示可知，过程①表示转录，过程②表示翻译。转录（即进行过程①）时，DNA 双链解
开，RNA 聚合酶识别并结合启动子，驱动基因转录，移动到终止子时停止转录，A 错误；
B、一种tRNA 只能转运一种氨基酸， 特定的tRNA 分子与特定的氨基酸相连，是靠一类活化酶的催化来
完成的，这些活化酶叫作"氨酰tRNA 合成酶"。翻译（即进行过程②）时，tRNA 的3＇端（——OH）与被
转运的氨基酸结合，B 正确；
C、题图基因表达的调控属于转录后水平的调控，C 正确；
D、图中降钙素基因可以控制合成降钙素和CGRP，即相同基因的表达产物不同，这有助于蛋白质多样性
的形成，D 正确。
故选A。
22．（2024·福州·二模）乳腺癌化疗的药物在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，为降低药物
对患者的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体一药物偶联物（ADC），过程如图
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所示。下列相关说法正确的是（ ）
A．对①过程形成的杂交细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可以获得能分泌所需抗体
的细胞
B．ADC 通常由抗体、接头和药物三部分组成，ADC 起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后
释放药物
C．经步骤③筛选得到的杂交瘤细胞具有的特点是能准确识别抗原的细微差异并能大量制备
D．ADC 能降低乳腺癌治疗药物的副作用，原因是药物能特异性地作用于乳腺癌细胞，避免其他细胞
受损
【答案】B
【详解】A、经过程①形成的融合细胞有同种核两两融合和不同核融合细胞，需要经过特定的选择性培养
基筛选，A 错误；
B、抗体一药物偶联物（ADC）通常由负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有
效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子三个部分组成，ADC 起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被
分解后释放药物，B 正确；
C、步骤③是抗体检测，得到的杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生专一性抗体，C 错误；
D、ADC 能降低乳腺癌治疗药物的副作用，原因是抗体能特异性地作用于乳腺癌（靶）细胞，避免其他细
胞受损，D 错误。
故选B。
23．（2024·陕西咸阳·二模）多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸，为解决猪肉中PUFAs 含量不
足的问题，研究者从线虫中获得控制PUFAs 合成的必需酶基因fat1。培育转fat1 基因猪，操作过程如图所
示。图中GFP 基因表达出绿色荧光蛋白。据图回答下列问题：
(1)用PCR 技术在体外扩增目的基因时，PCR 扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、 （至少答两点）等。
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(2)从图中可知，在构建基因表达载体时，为克服目的基因自身环化（即线性DNA 的末端相互连接，变圆
环），以及便于目的基因与载体的连接，切割含目的基因的DNA 和载体的限制酶应选用 。
(3)构建的基因表达载体中，GFP 基因的作用是 。
(4)猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期 ，以防止细胞代
谢产物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为
，操作时首先用 等处理成细胞悬液。
(5)经检测，fat1 基因成功整合在猪基因组DNA 后，若想获得该转基因动物，需经过胚胎移植过程，该过
程需对受体进行 处理，移植胚胎后需要对受体进行是否 的检查。
【答案】(1)引物、4 种脱氧核苷酸（原料）、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）
(2)EcoRI 和BamHI
(3)标记基因（使相关细胞发出绿色荧光方便进行筛选）
(4) 更换培养液 传代培养 胰蛋白酶（胶原蛋白酶）
(5) 同期发情 妊娠
【详解】（1）PCR 是一项体外扩增DNA 的技术，用PCR 技术在体外扩增目的基因时，PCR 扩增仪中要
加入缓冲液、目的基因、引物、4 种脱氧核苷酸（原料）、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）等。
（2）据题图可知，运载体有三种限制酶位点可供选择，目的基因fat1 两侧有EcoRI 和BamHI 两种限制酶
酶切位点，正好运载体上也有这两种限制酶位点，为防止目的基因自身环化使用双酶切，可选用EcoRI 和
BamHI 切割含目的基因的DNA 和载体。
（3）构建的基因表达载体中，GFP 基因的作用是标记基因（使相关细胞发出绿色荧光方便进行筛选）。
（4）猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期更换培养液，以防
止细胞代谢物积累对细胞自身造成的伤害；培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程
称为传代培养；操作时首先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，使组织分散成单个细胞后移至培养瓶
中。
（5）胚胎移植时之前需要进行同期发情处理，以使供受体处于相同的生理状态；移植胚胎后需要对受体
进行是否妊娠的检查。
24．（2024·江苏南通·二模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物
细胞中PA 的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA 结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋
白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA 含量。无缝克隆技
术连接DNA 片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题。
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(1)无缝克隆时，T5 核酸外切酶沿 的方向水解DNA，其目的是形成 。T5 核酸外切酶催化的最适温度
为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性， 。
(2)过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是 ，过程③所需的酶有 。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有___。
A．不受限制酶切位点的限制
B．不会引入多余碱基
C．操作时间短，成功率高
D．有利于多个小片段（小于50bp）连接
(4)PCR 扩增PABD 基因时需依据 设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1 和R2 对应于下表中的
。
1
5'-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3'
2
5'-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3'
3
5'-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3'
4
5'-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3'
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有 的MS 培养基
上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为 ，说明T1为单位点插入的转基因株
系。
(6)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，了解PA 的动态变化。
【答案】(1) 5'→3' 黏性末端 防止过度水解DNA
(2) 过程①形成的黏性末端长度不同 DNA 聚合酶和DNA 连接酶
(3)ABC
(4) PABD 基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列 1、4
(5) 草胺膦 抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1
(6)绿色荧光点的分布
【详解】（1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5 核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末
端。温度能影响酶活性，T5 核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降
低酶活性，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。
（2）过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的
黏性末端长度不同，因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA 链的补齐，可以看作DNA 分
子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到子链3′-OH 末端）和DNA 连
接酶（将两个DNA 片段进行连接）。
（3）传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA 连接酶对目的基因
和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切
位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段（小于50bp）连接，ABC
正确。
故选ABC。
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（4）用于PCR 扩增的引物是根据一段已知目的基因（PABD 基因）的核苷酸序列来设计的，由图可知，
PABD 基因（目的基因）需要用载体进行连接，因此PCR 扩增PABD 基因时需依据PABD 基因一端的核苷
酸序列和载体一端的核苷酸序列引物R1。由重组DNA 图可知，GFP 基因和PABD 基因进行连接，PCR 扩
增GFP 基因时需根据GFP 基因一端的核苷酸序列和PABD 基因一端的核苷酸序列引物R2，而设计引物F1
仅需根据PABD 基因一端的核苷酸序列，因此引物F1 的碱基序列比引物R2 的碱基序列短，因此扩增目的
片段的引物F1 对应于下表中的1。PCR 扩增GFP 基因时需根据GFP 基因一端的核苷酸序列和PABD 基因
一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2 的一部分能与引物F1 进行碱基互补配对，综上所述，R2 对应于下
表中的4。
（5）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA 上，农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可
转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获
得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS 培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入
的转基因株系，假设抗性基因用A 表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2代幼苗的
基因型及比例为A_:aa= 3：1，因此抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1。
（6）由题意“将高度专一的PA 结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监
测细胞PA 变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA 含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色
荧光点的分布，了解PA 的动态变化。
25．（2024·福建三明·二模）1965 年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合
成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB 法是根
据胰岛素A、B 两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA 片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合
自然形成胰岛素；BCA 法是利用胰岛B 细胞中的mRNA 得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两
种方法使用同一种质粒作为载体。回答下列问题：
(1)用AB 和BCA 法人工合成两种DNA 片段 （填“AB”“BCA”或“AB 和BCA”）法获取的
目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2)图中是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确
连接，在设计PCR 引物时可添加限制酶 的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，
需要通过PCR 技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引
物设计的序列是5＇- -3＇。
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(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal 产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。据此简述筛选工
程菌的过程： 。
(4)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。
写出获取赖脯胰岛素的流程： 。
【答案】(1)AB 和BCA
(2) XhoⅠ和MunⅠ － CTCGAGCCTTTCAGCTCA－
(3)经钙离子处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-
gal 的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌
(4)从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对于的脱氧核苷酸
序列
【详解】（1）结合题干BCA 法是通过从人体胰岛B 细胞中的mRNA 得到胰岛素基因，以及题干“AB 法
是根据胰岛素A、B 两条肽链的氨基酸序列人工合成两种 DNA 片段”，而在基因的结构中，启动子在非
编码区，是不会被转录和翻译的，故AB 和BCA 法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
（2）根据题图，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因中间，会破坏目的基因，则在引物设
计时不能选择这两种限制酶，那么只能在XhoⅠ和MunⅠ和EcoRⅠ中选择，同时质粒上EcoRⅠ的其中一个作
用位点在标记基因上，所以只能选择XhoⅠ和MunⅠ两种限制酶，则需要在设计PCR 引物时可添加限制酶
XhoⅠ和MunⅠ的识别序列；
已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，在设计引物时需要添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ
的识别序列，根据两种酶在质粒上的位置上可知，XhoⅠ识别序列需要添加在目的基因的左侧，MunⅠ的识
别序列需要添加杂目的基因的右侧，其中一种引物设计的序列是胰岛素基因左端①处的碱基序列为-
CCTTTCAGCTCA-，由于DNA 合成时，新链的延伸方向为5′→3′，即其中一种引物与模板链3′（①处互补
的位置）碱基互补配对，所以其中一种引物设计的序列为5′－ CTCGAGCCTTTCAGCTCA－3′。
（3）已知：β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal 产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合
题干题图，目的基因的插入破坏了lacZ 基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β-半乳糖苷酶，底物
X-gal 不会被分解，故简述筛选工程菌的过程为：经钙离子处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间
后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal 的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌。
（4）科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起
效快。获取赖脯胰岛素基因的流程为：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨
基酸序列→找到相对于的脱氧核苷酸序列。
26．（2024·辽宁·二模）胃幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp 的Ipp20 基
因能指导合成其特有的Ipp20 蛋白，科研人员培育出转Ipp20 基因山羊（将Ipp20 基因导入山羊受精卵）利
用乳腺生物反应器制备Hp 疫苗。所用质粒和Ipp20 基因两端序列以及相关限制酶识别序列如下图所示，已
知Ipp20 基因内部不含MfeI 酶切序列而外部两端含有，回答下列问题：
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限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
HindⅢ
MfeI
识别序列和切割位点（5'—3'）
G↓AATTC
G↓GATCC
A↓AGCTT
C↓AATTG
(1)获取Ipp20 基因的常用方法是PCR 技术，PCR 反应缓冲溶液中添加Mg2+的作用是 。
(2)构建基因表达载体时，如果选择MfeI 对目的基因和质粒进行切割，缺点是 ，如果选择EcoRI 和
HindⅢ，利用PCR 扩增Ipp20 基因时，需要在两种引物上分别添加两种限制酶的识别序列，从而扩增出两
端带有两种限制酶识别序列的Ipp20 基因。依据图中已知碱基序列，在PCR 扩增仪中加入的引物的碱基序
列为5'— —3'，和5'— —3'。
(3)转Ipp20 基因山羊利用乳腺生物反应器制备Hp 疫苗，构建基因表达载体时需要选择 启动子，其目的
是 。
(4)重组质粒导入山羊受精卵内，对受精卵有无性别要求并说明理由 。
【答案】(1)激活（耐高温的）DNA 聚合酶
(2) 目的基因和载体可能自身环化以及反向连接 GAATTCATGGGC AAGCTTCTAGTG
(3) 山羊乳腺细胞中特异性表达的基因的启动子（乳腺蛋白基因的启动子） 从山羊的乳汁中提取
获得p 疫苗
(4)有，转基因山羊必须是雌性，才能分泌乳汁获得Ipp20 蛋白
【详解】（1）PCR 反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+，因为真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2+激
活。
（2）同种限制酶切割目的基因和质粒，会使目的基因两端的黏性末端和切割后质粒两端的黏性末端都相
同，而发生目的基因和载体的自我环化以及反向连接。Ipp20 基因两端没有EcoRI 和HindⅢ识别序列，设
计引物时需要在引物的5'端加上限制酶识别序列，以便PCR 扩增目的基因后能够被切割质粒的同种限制酶
酶切出相同的黏性末端，结合图中目的基因转录的方向和限制酶识别序列的方向，图中目的基因左侧为
5'的单链做模板时引物结合在模板链的3'端，与模板碱基配对的引物序列为5'-ATGGGC-3'，5'端加上限制
酶识别序列5'-GAATTC-3'，最终为5'-GAATTCATGGGC-3'，同理，目的基因上面那条链做模板时引物结合
在模板链的3'端，与模板碱基配对的引物序列为3'-GTGATC-5'，5'端加上限制酶识别序列5'-AAGCTT-3'，
最终为5'-AAGCTTCTAGTG-3'。
（3）乳腺生物反应器需使目的基因在雌性山羊乳腺中表达出蛋白质，所以需要选择山羊乳腺细胞中特异
性表达的基因的启动子，其目的是从乳汁中获得目的蛋白。
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（4）乳腺生物反应器的个体必须是雌性，才能分泌乳汁获得Ipp20 蛋白。
27．（2024·西安·二模）水稻种子中70%的磷以植酸形式存在。植酸易同铁、钙等金属离子或蛋白质结合
排出体外，是多种动物的抗营养因子，同时，排出的大量磷进入水体易引起水华。
(1)磷元素除了形成植酸外，还可以出现在下列______分子或结构中。
A．细胞膜
B．ADP
C．核糖体
D．脱氧核糖
(2)种植芦苇能有效抑制水华的发生，表明芦苇与引起水华的藻类的种间关系是 。
(3)植酸酶可降解植酸，在谷物类饲料中添加植酸酶可提高饲料的营养成分利用率。为从根本上解决水稻中
的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。
据图回答：
①图中基因组文库 （小于/等于/大于）cDNA 文库。
B
②
过程需要的酶是 ；然后，用基因工程的工具 处理cDNA 和克隆载体，形成重组DNA 分子，
再将其导入受体菌中，可构建cDNA 文库。
③我们可以从基因文库中获取目的基因，然后构建表达载体对水稻进行转化，培育低植酸转基因水稻。转
化是指 。相对于②中的重组DNA 分子，表达载体还要具有 。
注：克隆载体仅有复制和筛选功能
【答案】(1)ABC
(2)竞争关系
(3) 大于 逆转录酶 限制酶和DNA 连接酶 转化就是指目的基因导入受体细胞内，并在
受体细胞内维持稳定和表达的过程 启动子、终止子
【详解】（1）A、磷元素进入细胞后参与磷脂的合成，磷脂构成细胞膜的基本支架。因此，磷元素可以出
现在细胞膜中，A 符合题意；
B、ADP 是腺苷二磷酸，含两分子磷酸基团。因此，磷元素可以出现在ADP 中，B 符合题意；
C、核糖体由蛋白质和rRNA 构成，其中rRNA 中含磷。因此，磷元素可以出现在核糖体中，C 符合题意；
D、脱氧核糖是五碳糖，含有C、H、O 三种元素。因此，磷元素不会出现在脱氧核糖中，D 不符合题意。
故选ABC。
（2）芦苇与引起水华的藻类关都吸收水体中的N、P 等元素，表明芦苇与引起水华的藻类关系是竞争关系，
所以种植芦苇能有效抑制水华的发生。
（3）①基因组文库包含某种生物所有的基因，而cDNA 文库是由mRNA 经逆转录形成的基因组成的，由
于基因的选择性表达，cDNA 文库只包含某种生物部分基因，所以基因组文库大于cDNA 文库。
B
②
过程是以mRNA 为模板生成DNA 的过程，是逆转录过程，需要逆转录酶催化。cDNA 和克隆载体形成
重组DNA 分子时需要用到限制酶和DNA 连接酶。
③转化是指目的基因导入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。基因表达载体要在细胞内
维持并表达，则应该包括标记基因、目的基因、复制原点、启动子及终止子。因此，相对于②中的重组
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DNA 分子，表达载体还要具有控制cDNA 转录的启动子及终止子。
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