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专题13 基因工程
（基础题+提升题+创新题 三位一体）
1．下列实例与所利用的技术或原理不相符合的是（ ）
A．转基因抗虫棉和单倍体的培育都需要利用植物组织培养技术
B．植物体细胞杂交和动物细胞培养依据的原理都是细胞具有全能性
C．植物原生质体融合和动物细胞融合都利用了细胞膜具有一定的流动性
D．植物愈伤组织的形成和杂交瘤细胞的培养都离不开细胞的有丝分裂
2．（2024·天津·一模）研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx 基因中第226 位碱基
是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点
突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx 基因该位
点碱基是G 或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA 为材料，以Wx 基因片段设计引物如图所示，对PCR
扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1 为5＇-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3＇，两引物之间无另外的
AccI 酶的识别位点。下列叙述正确的是（ ）
A．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同
B．GT 杂合型水稻品种酶切电泳结果为2 条条带
C．若酶切产物只能观察到大约460bp 的DNA 条带，则表明该水稻品种为TT 型
D．该实验中需设计的引物2 为5＇-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3＇
3．（2024·辽宁·一模）下列有关“DNA 粗提取与鉴定”、“PCR 扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙
述中，正确的是（ ）
A．DNA 的粗提取与鉴定实验中可利用DNA 在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA
B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液即可变为蓝色
C．PCR 反应体系中需加入耐高温的DNA 聚合酶，该酶在延伸过程中起作用
D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA 分子结合，便于在紫外灯下观察
4．（2024·辽宁葫芦岛·一模）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有
效方法。下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。
质粒中 lacZ 基因编码产生的酶可以分解培养基中的 X—gal，产生蓝色物质， 使菌落呈现蓝色， 否则菌
落为白色。
1
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(1)图中过程①中有两种选择限制酶的方案，它们分别是 或 。过程②需要先将大肠杆菌用 处理。
(2)PCR 过程每次循环分为3 步，其中发生引物与单链DNA 结合的步骤称为 ，得到的产物一般通过
的方法来鉴定。在 PCR 反应体系中一般需要加入Mg2+，原因是 。
(3)据图可知，该目的基因的具体功能是 。为了使重组质粒中目的基因正常表达， 还需要插入的序列
有 。
(4)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 和 培养一
段时间挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。
5．（2024·天津·一模）为构建肝特异性CD36 基因敲除小鼠模型。研究人员利用Crt-1oxP 系统开展实验。
Cre 可识别DNA 分子中特定的loxP 序列，并将两个loxP 序列之间的DNA 序列剪除，切口连接形成的环化
产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的，如图1 所示。
(1)Cre 的作用类似于基因工程中的 ，DNA 切口环化连接的过程需要 。
(2)图2 显示两类工具鼠，其中A 鼠成对的CD36 基因两侧分别引入一个同向loxP 序列（基因型表示为
L+L+，野生型为L-L-），B 鼠中含一个外源导入的Cre 编码序列（基因型表示为C+C-，野生型为C-C-），
Alb 表示肝脏组织特异性启动子。利用A、B 两类工具鼠作为亲本，选用合适的杂交策略，即可获得肝特
异性CD36 基因敲除目标小鼠。
2
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①目标小队的基因型应为 。
A．
B．
C．
D．
②选择合适的杂交策略，目标小鼠最早可出现在子 代。
(3)取鼠尾细胞通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代1～8 号小鼠的基因型，结果如图3。已知A 鼠、B 鼠的基因型
检测结果分别与图3 中子代6 号、1 号小鼠相同，则图3 中代表目标小鼠的是 号。
(4)对目标小鼠不同组织细胞基因检测，请将预期结果填在下面的表格中。（＋表示存在，－表示缺失）
细胞类型
Cre 编码序列
CD36 基因
肝脏细胞
心肌细胞
6．（2024·辽宁·一模）目前科学家可利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素，下图是利用基因工程生
产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。据图回答下列问题
(1)构建基因表达载体时，为了满足需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或
抑制 。图中的质粒在构建基因表达载体时，除插入目的基因外还需具备的结构有 。
3
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(2)为获得更多的目的基因，可利用PCR 技术进行扩增，该技术需要设计引物，引物与DNA 结合发生在
PCR 的 阶段；PCR 第四次循环时需要消耗 对引物。为保证目的基因与载体的正向连接，在设
计PCR 引物时，应在引物的 （填“3′”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据
上述信息，写出上游引物的15 个碱基序列：5′- -3′。
(3)Ʋ-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gaⅠ产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青
霉素和X-gaⅠ的培养基上应选择白色的菌落，原因是 （答出2 点）。
7．（2024·江苏泰州·一模）ThTC 指的是经基因编辑技术改造后失去成瘤能力，但能自主分泌干扰素β
（IFNβ）的一种新型治疗性肿瘤活疫苗，它能发挥阻断肿瘤生长且引起机体免疫反应等效用，其制备过程
及作用机理如下图。相关叙述正确的有（ ）
A．为避免ThTC 被自身分泌的干扰素β 攻击，需去除ThTC 的干扰素β 受体
B．ThTC 分泌的干扰素β 等细胞因子使肿瘤细胞坏死，从而阻断肿瘤生长
C．死亡的肿瘤细胞暴露抗原，可能被APC 呈递给T 细胞进而促进抗肿瘤免疫应答
D．可设置ThTC 自毁机制，使其在完成抗肿瘤使命后于特定激活条件下被清除
8．（2024·黑龙江·一模）石斛是具有重要的药用价值的兰科植物。利用分子生物学技术对石斛DNA 分子
进行鉴定，能更有效保证石斛的用药安全，而石斛DNA 的有效提取是成功开展分子鉴定的前提。某团队
利用3 种方法(M1、M2、M3)对铁皮、霍山两种石斛叶进行提取DNA 的实验，并检测DNA 提取样品液在
230、260、280nm 处的吸光度。A₂₆₀ 用于计算DNA 浓度，A₂₆₀/A₂₈₀(图1)反映DNA 提取液中蛋白质等杂质
的浓度，A₂₆₀/A₂₃₀(图2)反映DNA 提取液中无机盐等小分子杂质的浓度。A₂₆₀/A₂₈₀、A₂₆₀/A₂₃₀ 比值越大,DNA
越纯。下列有关叙述,错误的是（ ）
4
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A．与蛋白质、无机盐等杂质相比，DNA 对260nm 光吸收值最大
B．用鲜叶提取DNA，两种石斛宜用M2 法
C．用霍山石斛冻叶提取DNA，最好用M3 法
D．可以用PCR 技术对提取的DNA 进行分子鉴定
9．（2024·黑龙江·一模）研究表明：γ-氨基丁酸(GABA)是人体大脑皮层主要的抑制性神经递质，在疾病治
疗方面具有重要的应用价值。谷氨酸脱羧酶(GadB)可以催化L-谷氨酸反应合成γ-氨基丁酸，但来源于野生
型的菌株的内源性GadB 的活力均较低。磷酸吡哆醛合酶基因SNO 1(675bp)和SNZ 1(894bp)的蛋白质产物
具有催化合成磷酸吡哆醛的能力。当SNO 1 和SNZ 1 同时表达时，能够形成复合物，从而提高GadB 活性，
单独表达时不能形成相应的复合物。某研究小组通过以下实验步骤，尝试实现γ-氨基丁酸的高效生产。回
答下列问题：
步骤1：利用原始质粒A 构建重组质粒B 和重组质粒C(图1)
注:NcoⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ为限制酶切位点
(1)已知Gad B 基因(1400bp)的α 链为转录的模板链，测得该链首端到末端的序列为5'-
ATCTACGCGCTCATCCG……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。利用PCR 获取目的基因时,PCR 反应体系需要
加入缓冲液、模板DNA、引物、 等物质。某同学设计了如下4 种PCR 引物，其中可选用的引
物是 (填序号)。
5'-CGGATGAGCGCGTAGAT-3'
5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
①
②
5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
③
④
(2)据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因时，设计Gad B 的引物时，需要在引物 (填序号)的5'端
添加限制酶 识别序列，在引物 (填序号)的5'端添加限制酶 识别序列，
从而可以更好的构建重组质粒B，并确保Gad B 基因的正确连接。
步骤2：利用单酶切法结合凝胶电泳初步鉴定重组质粒是否构建成功
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(3)利用NcoⅠ切割3 种质粒后，琼脂糖凝胶电泳结果如图2 所示。据图2 结果分析，图示中泳道3 是质粒
(填“A”“B”或“C”)的单酶切结果。
步骤3：4 个菌株发酵产γ-氨基丁酸能力的比较
实验中所用到的菌株如下：R1(原始菌株)，R2(某些特定基因敲除菌株)，R3(将重组质粒B 导入R2 的重组
菌株)，R4(将重组质粒C 导入R2 的重组菌株)。
(4)通过高效液相色谱法检测4 个菌株发酵液中γ-氨基丁酸含量，数据显示基因敲除菌(R2)的发酵液中γ-氨
基丁酸的含量相对于原始菌株R1 提高了4.2 倍。据此推测，敲除的基因的功能是 。
(5)结果显示4 个菌株中产γ-氨基丁酸能力最强的是菌株R3，菌株R4 发酵液中γ-氨基丁酸的含量低于菌株
R3，从物质和能量分配的角度推测可能的原因是：虽然SNO 1 和SNZ 1 的表达能够提高磷酸吡哆醛的含量，
进而提高谷氨酸脱羧酶GadB 的活性，但是 ，导致γ-氨基丁酸生产能力下降。
10．（2024·贵州贵阳·一模）靛蓝是最早发现的天然染料之一。研究人员将靛蓝色素酶基因（IDG）与启动
子PTL12 相连以构建基因表达载体（如图，KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶
的位置为其对应的酶切位点），并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。请据图
回答下列问题：
(1)图中所示是基因工程操作步骤中的 ，该过程用到 种酶。
(2)本研究中将IDG 与启动子PTL12 结合的主要目的是 。
(3)过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是 ，过程③使用的Ti 质粒中的T-DNA 内部至少应含有的限
制酶是 。
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(4)利用农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞的过程：首先将 转入农杆菌，然后通过农杆菌侵染植
物细胞将 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
11．（2024·安徽合肥·一模）某同学在家里进行了提取花椰菜DNA 的实验。取绿色的花芽部分，充分研磨
获得匀浆；再加入含有中性洗涤剂的浓度约为2mol/L 的盐水，其作用是[甲]，以释放细胞核和细胞器[乙]
中的DNA；静置10min 后过滤，然后将滤液轻轻倒入[丙]溶液中，出现白色絮状物。下列选项中，甲、乙、
丙对应的内容，正确的是（ ）
选项
甲
乙
丙
A
破坏膜结构
核糖体、内质网
植物油
B
使膜蛋白变性
线粒体、叶绿体
清水
C
破坏膜结构、溶解DNA
线粒体、叶绿体
预冷的酒精
D
破坏细胞壁
高尔基体、叶绿体
预冷的酒精
A．A
B．B
C．C
D．D
12．（2024·广东深圳·一模）番茄在种植过程中容易发生虫害。研究人员将双价抗虫载体转入番茄中，获
得具有抗虫特性的转基因番茄。图为所用载体的部分结构示意图，其中Bar 为除草剂抗性基因，Cry1Ac 为
苏云金杆菌毒蛋白基因，Pta 为半夏凝集素基因。
回答下列问题：
(1)双价抗虫载体中的P1、P2和P3是属于基因表达载体中的 ，其作用是 。
(2)构建的载体通常用 法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，并在培养基中添加 用
于筛选转基因番茄。
(3)为验证Pta 基因是否转入番茄基因组中，研究人员使用 技术筛选转基因番茄中的Pta 基因，再进
行凝胶电泳鉴定，结果如图所示。
图中①为阳性对照，②为阴性对照，③为待测植株，试分析③中出现2 条条带的可能原因是 。
(4)对于成功转化的番茄植株还需进一步进行抗虫鉴定，研究人员选取3 株阳性转基因番茄进行小菜蛾幼虫
抗性实验，结果如下表。
株系编号
CK
1
2
3
幼虫致死率（%）
0
39.8
6.5
48.9
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注：CK 表示对照
由表中可知，株系2 的幼虫致死率较低，推测其可能原因是 。
13．（2024·湖南·一模）土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56 导人不耐盐碱水稻
品种吉粳88 中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar 为抗除草剂基因，
Tetr为四环素抗性基冈，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，①～⑦表示操作过程。
限制酶
BamH I
BclI
Sma l
Saa3A I
识别位点及切割位
点
一G,GATCC
-T↓ GATCA-
-CCC ↓ GGG
-↓GATC-
(1)过程①利用PCR 扩增OsMYB56 基因时加入的酶催化 键的形成，还需要添加引物，应选用下列引物
组合 。
5'-CTTGGATGAT-3'
5'-TAAGTTGTCT-3'
5'-TAGTAGGTTC-3'
5'-ATTCAACAGA-3'
5'-
①
②
③
④
⑤
TCTGTTGAAT-3'
5'- ATCATCCAAG-3'
⑥
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti 质粒中的CaMV35S 功能是 。
基因表达载体中，OsMYB56 基因和bar 基因编码链的方向 （填“相同”或“相反’’）。
(3)过程③应选用限制酶 切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是 （答两
点），切割后需要用 （写具体名称）进行连接才能获得重组质粒。
(4)若要鉴定OsMYB56 基因是否表达，从分子水平上检测的方法有 （答出一种即可）。
14．（2024·安徽合肥·一模）人溶菌酶（hLYZ）是一种具有抑菌活性的蛋白质，因具有抑菌效果显著、结
构稳定且对人体无毒副作用等优点，在食品保鲜、抗菌消炎等方面广泛应用。为提高溶菌酶的产量，研究
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人员利用酵母细胞表达人溶菌酶，构建的重组质粒的部分结构如图1 所示，回答下列问题。
(1)人工合成hLYZ 基因时，改变天然hLYZ 基因的部分碱基，使密码子由酵母菌稀有密码子优化成常用密
码子，从而提高人溶菌酶在酵母细胞中的表达量。此过程中，基因的碱基发生改变，而蛋白质的氨基酸序
列不变的原因是 。
(2)由图1 可知，人工合成hLYZ 基因时，需在基因两端分别引入Xhol 和NotI 两种不同限制酶的识别序列，
这样设计的优点是 ，经过酶切的hLYZ 基因和质粒连接时，可选用 酶。
(3)hLYZ 基因上游的启动子能被 识别并结合，从而开启转录过程。构建的重组表达载体中还应有标
记基因，标记基因的作用是 。
(4)为检测重组人溶菌酶的活性，可进行X 菌的抑菌试验。将X 菌均匀涂布在固体培养基上，放入经不同处
理的无菌滤纸片，在适宜条件下培养36h，观察抑菌圈的直径如图2 所示。检测结果说明 。
15．（2024·贵州·一模）单个B 细胞抗体技术可用于制备高亲和力、高特异性的单抗，其技术流程如下：
①康复者单个B 淋巴细胞的分离和筛选；②利用RT-PCR 获取和扩增抗体基因；③构建基因表达载体；④
将抗体基因导入动物细胞；⑤单抗的筛选和鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．操作①选用单个B 淋巴细胞以保证最终获得纯度较高的单抗
B．操作②使用的PCR 反应体系常添加Mg2+以激活DNA 聚合酶
C．操作③常用两种限制酶切割抗体基因和载体以防止其自身环化
D．操作④前可用Ca2+处理受体细胞促使其主动吸收DNA 分子
16．（2024·江西南昌·一模）HNFlα 基因突变可引发糖尿病等疾病。HNFlα 的第249 位丝氨酸（S249）是
其重要功能位点，为进一步研究S249 的重要性，研究人员将249 位丝氨酸（S）突变为丙氨酸（A），成
功构建了人源HNF1αS249A 转基因小鼠。下图为基因表达载体部分结构示意图，Myc 为标记基因，引物F
和R 之间的序列长度为386bp 碱基对。回答下列问题：
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(1)CMV 位于HNFlαcDNA 上游，据此推测CMV 的功能为 。
(2)为保证HNFlαcDNA 准确插入载体，可利用PCR 技术在其两端添加限制酶识别序列 ，应将限制酶
识别序列添加在引物的 （填“5'”或“3'”）端。
(3)获得HNFlαcDNA 后，可利用cDNA 中间序列设计引物实现定点突变目的，从而制备HNFlα-
S249AcDNA．已知HNFlα 中248、249、250 三个氨基酸对应的密码子序列为ACCUCUGUG，丙氨酸对应
的密码子有GCU、GCC、GCG、GCA 四种，为了保证引物与模板的结合效率及突变目的，请设计其中一
个引物： 。
(4)利用上述基因表达载体制备转基因小鼠，请用文字和箭头写出制备流程图 。
(5)提取转基因小鼠DNA 作为模板，利用引物F 和R 进行PCR 技术扩增，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产
物。若出现 结果，初步证明转基因小鼠模型构建成功。
17．（2024·江苏泰州·一模）胆固醇O 酰基转移酶1(SOAT1)与肝癌的发生密切相关，可作为潜在的肝癌生
物标志物。科研人员从肝癌细胞Huh7 中获取SOAT1 基因，经原核表达、蛋白质纯化后免疫小鼠制备单克
隆抗体。请回答下列相关问题：
(1)从肝癌细胞Huh7 中提取 ，通过 获得SOAT1 的cDNA。
(2)根据SOAT 1 的编码序列设计的两个引物如下图1。引物F 加入的EcoR Ⅰ酶切位点位于 端，引
物R 上添加的XhoⅠ酶识别的回文序列的6 个碱基是 。
(3)利用上述引物对SOAT1 基因进行PCR 扩增，该实验设计的扩增程序中热循环次数为30 次，一般PCR
反应中设计的热循环次数不超过40 次，原因是 。PCR 反应结束后，将产物经1%琼脂糖凝
胶 后，对PCR 产物进行胶回收。
(4)将胶回收后的PCR 产物和载体pET32a 分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，加入DNA 连接酶后在冰面上过夜。
在冰面上操作的目的是 。在将重组质粒转化至大肠杆菌前用CaCl2处理大肠杆菌，使其处
于 的生理状态，以提高转化效率。
(5)将测序正确的重组载体诱导表达并进行电泳，实验部分结果见下图2，SOAT 1 重组蛋白的相对分子质量
为50 kD 左右，下图中基本符合要求的条带包括 。
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(6)用纯化的SOAT1 重组蛋白免疫小鼠，利用 技术获得SOAT1 单克隆抗体细胞株以制备单克隆抗
体。
18．（2024·山东泰安·一模）Cre-loxP 系统能实现特定基因的敲除（如图1）。把几种荧光蛋白基因和Cre
酶能识别并切割的序列（loxP1 和loxP2）串在一起，构建表达载体T（如图2）。部分荧光蛋白基因会被
Cre 酶随机“剪掉”，且两个loxP1 之间或两个loxP2 之间的基因，最多会被Cre 酶敲除一次，剩下的部分
得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法错误的是（ ）
A．Cre 酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T（不含Cre 酶），其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T（含Cre 酶），其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T（含Cre 酶），其一个细胞内可能随机出现两种颜色
19．（2023·山东菏泽·一模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静
置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，
电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA 时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
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20．（2024·山东泰安·一模）融合PCR 技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR 产物，通过
PCR 产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA 片段连接起来。其原理如图所示，据图分析正确的
是（ ）
A．上述过程中使用的引物P2 和P3 的碱基需要完全互补配对
B．设计引物的目的是为了能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸
C．融合PCR 的第一步两条链重叠部位可互为另一条链的引物
D．若融合PCR 的第二步获得128 个融合基因，理论上该过程消耗了254 个引物
21．（2024·山东烟台·一模）哺乳动物体内一定含量的w-3 多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心血管
疾病的作用，但LCPUFA 在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获
得LCPUFA 合成酶基因fat-1(1229bp),培育转fat-1 基因家兔，其部分流程如图一所示。
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(1)PCR 扩增fat-1 基因的前提是 ，以用于特异性制备PCR 扩增需要的引物。PCR 扩增过程中，经过
4 轮循环后，得到的产物中只含一种引物的DNA 分子占比为 。
(2)在构建PEBf 质粒时，为确保fat-1 基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat-1 基因的引物进行相应
设计。已知fat-1 基因转录的模板链为a 链，与b 链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC,则另一
引物5’端需添加的限制酶识别序列为 ,理由是 。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA 等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，
科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat-1 基因引物进行PCR 扩增后电泳，部分结果如图二所
示。据图分析，1 组和2 组分别是 细胞组PCR 产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA 合成酶，可采用 技术。如果fat-1 基因已正确插入PEB
质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA 合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，
可能的原因是 。
22．（2024·山东泰安·一模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢导致可溶性糖含
量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G 蛋白转基因甜玉米新品种。在
超量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti 质粒的酶切位点如图1、2 所示。
(1)强启动子能被 识别并结合，驱动基因持续转录。在培育转基因甜玉米中T-DNA 的作用是 。为
使DNA 片段能定向插入T-DNA 中，可用PCR 技术在DNA 片段的两端添加限制酶识别序列，M、N 端添
加的序列所对应的限制酶分别是 。处理好的DNA 片段与Ti 质粒的重组过程共需要 种酶。
(2)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后，进行植物组织培养时培养基中需加入 进行筛
选，获得玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对四个株系的G 蛋白表达量进行测定，发现a4株系的表达量与野生
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型相近，原因可能是 。
(3)下图示淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA 需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后
方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将
吗啉反义寡核苷酸（RNA 剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制
提出两种假说。
假说1：导致RNA 前体上内含子1 的对应序列不能被剪切；
假说2：导致RNA 前体上内含子1 和外显子2 的对应序列同时被剪切。
①为验证上述假说，分别在受精卵发育后3 天的胚细胞中从实验组和对照组提取 ，逆转录形成
cDNA。若假说1 成立，使用图示引物2 和引物4 进行PCR 后电泳的结果为 （目的条带的有无）。
②若要证明假说2，需选择图示引物 进行PCR。
③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR 操作过程角度解释可能的原因是
（至少写出两点）。
23．（2024·山东聊城·一模）易错PCR 是利用低保真的Taq 酶和改变PCR 的反应条件，降低DNA 复制的
准确性，在新DNA 链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA
序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图
是研究人员利用易错PCR 技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问
题：
(1)在体外利用PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA 解链为单链的条件是 。PCR 反应
体系中需添加引物，引物的作用是 。
(2)图中步骤①为易错PCR 过程，其扩增过程中需要加入Taq 酶，这是因为Taq 酶具有 的特点。图中步
骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用 处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指 。
(3)Taq 酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于
氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR 相比，易错PCR 的反应
体系中应适当 （填“提高”或“降低”）Mn2+浓度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+浓度。
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(4)阐述通过易错PCR 技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别 。
24．（2024·广东江门·一模）在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发
了新的DNA 重组方法: In-Fusion 技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的
DNA 序列（即同源序列），然后用In-Fusion 酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会
在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（ ）
A．推测In-Fusion 酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键
B．载体A 端和B 端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基不容易互补配对
D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列
25．（2024·山东青岛·一模）“DNA 粗提取与鉴定”的实验步骤是：研磨→去杂质→析出→鉴定：某研究
小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如下表所示。下列说法错误的是（ ）
去杂质方式
沉淀质量（g）
DNA 浓度（ng/μL）
OD260/OD280
二苯胺鉴定
离心
0.068
81.5
1.53
蓝色
4℃冰箱静置
0.1028
336.4
1.41
（注：OD260与OD280的比值可检查DNA 纯度。纯DNA 的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一
比值会明显降低）
A．猪肝和菜花均可作为提取DNA 的材料
B．对研磨液进行离心是为了加速DNA 的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．析出时的离心转速明显高于去杂质时
26．（2024·山东青岛·一模）CRISPR-Cas12a 系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas 系统，
该系统主要包含crRNA 和Cas12a 蛋白两部分，crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA 序列，从而引导
Cas12a 蛋白到相应位置剪切DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a 系统对宫颈癌细胞中的KIFC1 基因进
行敲除，来探讨KIFCI 基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa 细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含
种核苷酸；细菌细胞中的 也能起到类似Cas12a 蛋白的作用。若要将KIFCI 基因从目标DNA 上
剪切下来，需要设计 种crRNA。
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(2)为保证目的基因与PX458 质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中
P1 的碱基序列为5′ 3′（写出前9 个碱基）。采用PCR 技术对一个DNA 进行扩增时，第n 次循
环共需要引物 个。
(3)
在目的基因
与PX458 质粒连接时，可用 （填“E.coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a 重组载体成功转染至HeLa 细胞，与对照组相比，实验组中KIFCl 蛋白表达量如图2 所
示，细胞数目的变化如图3 所示，由此可得出的结论是 ，判断依据是 。
27．（2024·河北·一模）为研究干旱胁迫基因LEA 和VOC 对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建
了两个基因表达载体。其中基因LEA 与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表载体甲，基因VOC 和标记基因
构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如图所示。
(1)利用PCR 扩增LEA 基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板、4 种脱氧核苷酸、 ，
还需要在引物的 （填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是 。
(2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR 扩增仪中加入的引物的碱基序列为 ，
扩增 代后会得到等长的8 条DNA 片段。
(3)农杆菌转化甘蓝型油菜细胞时，T—DNA 的作用是 ，该过程发生的变异类型为 。
(4)乙酰-CoA 羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解
过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环
境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC 和ATGL 基因的表达水平，结果如下图。
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正常植株
转基因A 植株
转基因B 植株
AC 酶
ATGL 酶
①在分子水平上，用 方法检测AC 酶和ATGL 酶的含量可得到上述结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA 和VOC 在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是 。
28．（2024·辽宁辽阳·一模）棉花是我国重要的经济作物，黄萎病是棉花的最主要病害之一，有棉花的
“癌症”之称。我国科学家在世界上首次获得转基因抗黄萎病棉花新株系。这将使棉花“癌症”有望得到
根治。科学家将从海岛棉中分离出来的抗黄萎病基因At7 导入陆地棉中，使陆地棉获得抗病性状。下列对
转基因棉的检测与鉴定的叙述，错误的是（ ）
A．检测转基因棉是否导入基因At7，需要一段能与基因At7 互补的短单链核酸引物
B．检测转基因棉中的基因At7 是否转录出mRNA，其原理是抗原与抗体的特异性结合
C．检测到转基因棉表达出At7 蛋白，说明转基因棉中成功导入了基因At7 并能表达
D．检测转基因棉是否抗黄萎病，可接种黄萎病的病原体到转基因棉植株上
29．（2023·山东菏泽·一模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静
置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，
电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA 时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
30．（2024·广东·一模）健康的生活方式、乐观的心态和定期体检是预防癌症的主要手段。（CAR-T 细胞
疗法是治疗血液恶性肿瘤及淋巴瘤的研究热点，我国首款新型肿瘤治疗方法——CAR-T 产品于2021 年上
市。左图为CAR-T 细胞疗法的原理示意图，该疗法借助基因工程和细胞工程技术，根据CAR 蛋白（右
图）是多种肿瘤的嵌合抗原受体的特点而设计。
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回答下列问题：
(1)机体肿瘤的发生主要与免疫系统的 功能降低有关。
(2)图中过程①称为 ，这是基因工程的核心步骤，需要用到的工具酶有 。过程②最常用的方法
是 。CAR-T 细胞输入患者体内后，其活化需要两个信号的刺激，具体是 。
(3)据图可知，CAR-T 细胞疗法相对传统的药物化疗和放疗而言，具有 （请写出两点）的突出优点。
(4)CAR-T 细胞在治疗肺癌、肝癌、乳腺癌等实体瘤的总体效果上还不尽如人意，请根据右图并结合特异性
免疫的原理，提出一种CAR 蛋白改造的简单思路，以提升CAR-T 细胞对实体瘤的疗效： 。
31．（23-24 高三下·江西·阶段练习）猕猴桃溃疡病是一种严重影响猕猴桃产量的细菌性病害。为获得抗猕
猴桃溃疡病的转基因猕猴桃，科研人员以猕猴桃的愈伤组织（对卡那霉素敏感）为转基因受体，通过农杆
菌转化法将抗菌肽基因导入猕猴桃。图1 表示抗菌肽基因和卡那霉素抗性基因（nptⅡ基因）及其上限制酶
酶切位点的分布情况，图2 表示Ti 质粒及其上限制酶酶切位点的分布情况。回答下列问题：
(1)限制酶能识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断
裂。限制酶主要来源于原核生物，但不会切割原核生物自身的DNA 分子，推测原因是 。目的基因
可随T-DNA 整合到目的细胞的染色体DNA 上，这体现了 的生物学变异原理。
(2)若只用EcoRI 切割目的基因和Ti 质粒，会产生多种连接产物。为筛选出含有目的基因正向连接的重组Ti
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质粒的菌株，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到了①②③三类菌落，其生长情况如下表，“+”表
示生长，“-”表示不生长。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中序号），菌落②的导入情况
是 。
项目
①
②
③
无抗生素
+
+
+
卡那霉素
-
-
+
氨苄青霉素
-
+
+
卡那霉素+氨苄青霉素
-
-
+
(3)若既要避免上述多种连接情况的发生，又要使目的基因最终能整合到猕猴桃愈伤组织细胞的染色体
DNA 上，最好选择限制酶 对目的基因和Ti 质粒进行切割。
32．（2024·山东聊城·一模）易错PCR 是利用低保真的Taq 酶和改变PCR 的反应条件，降低DNA 复制的
准确性，在新DNA 链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA
序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图
是研究人员利用易错PCR 技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问
题：
(1)在体外利用PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA 解链为单链的条件是 。PCR 反应
体系中需添加引物，引物的作用是 。
(2)图中步骤①为易错PCR 过程，其扩增过程中需要加入Taq 酶，这是因为Taq 酶具有 的特点。图中步
骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用 处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指 。
(3)Taq 酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于
氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR 相比，易错PCR 的反应
体系中应适当 （填“提高”或“降低”）Mn2+浓度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+浓度。
(4)阐述通过易错PCR 技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别 。
33．（2024·安徽蚌埠·一模）研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转入溶菌酶基
因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取），过程如图所示。其中编号①~⑨表示过程：质粒S 中
的基因Leu 通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种
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必需氨基酸），基因GFP 控制合成绿色荧光蛋白。四种限制性内切核酸酶的识别序列及切割位点见下表。
请回答下列问题：
限制酶
BamHI
BgIII
HindIII
Xbal
识别序列和切割位点
G'GATCC
A'GATCT
A'AGCTT
TCTAGA
(1)过程②需要的限制性内切核酸酶是 ，在③中，B 与切割后的质粒S 用 酶连接，在两个片段
相邻处形成 ，获得重组质粒T。
(2)为成功筛选出含重组质粒T 的成纤维细胞，质粒S 中用作标记基因的是 。为达到筛选目的，培养
基的营养成分中特殊之处是 。若用PCR 检测目的基因是否成功导入受体细胞中，实验组以待测的样
本DNA 为模板，使用目的基因的特异性引物进行PCR 扩增，同时将以 片段为模板的组别作为阳性
对照组，将以非目的基因片段为模板的组别作为阴性对照组。
(3)过程⑧形成的早期胚胎中 （填结构）将发育成完整转基因羊个体。
34．（2024·河北邯郸·一模）华南农业大学科研团队首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合
成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白质——人神经生长因子(hNGF)，为生产高活性的人类药
用蛋白提供了一种高效的新技术，拓展了畜牧动物在人类医学中的应用。图示为该团队构建的基因表达载
体，请回答下列相关问题：
(1)科研人员曾经利用小鼠唾液腺组织中分离纯化的鼠源神经生长因子(mNGF)及大肠杆菌表达的hNGF 进
行一些神经损伤疾病的治疗，但其治疗效果均比人体自身合成的hNGF 差。请分析mNGF 治疗效果较差的
原因可能是 ，导致mNGF 的活性较低；大肠杆菌表达的hNGF 治疗效果也较差的原因可能是
，导致大肠杆菌表达的hNGF 活性也较低。
(2)家畜的唾液腺是一种高效的生物反应器，与乳腺生物反应器相比较，其优点是 (答出两点)；
在构建hNGF 基因表达载体时，需将hNGF 基因与 等控制元件重组在一起，通过
技术将基因表达载体导入猪的受精卵中，经 等技术将受精卵培养成胚胎并转移到受体猪体内。
(3)为确定转基因猪是否培育成功，除了分子水平的鉴定，还可以进行个体水平的鉴定，具体的方法是
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