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十年（2014-2023）年高考真题分项汇编
专题25 基因工程
〖2023 年高考真题〗...........................................................................................................................1
〖2022 年高考真题〗.........................................................................................................................12
〖2021 年高考真题〗.........................................................................................................................21
〖2020 年高考真题〗.........................................................................................................................31
〖2019 年高考真题〗.........................................................................................................................36
〖2018 年高考真题〗.........................................................................................................................39
〖2017 年高考真题〗.........................................................................................................................42
〖2016 年高考真题〗.........................................................................................................................45
〖2015 年高考真题〗.........................................................................................................................48
〖2014 年高考真题〗.........................................................................................................................52
〖2023 年高考真题〗
1．（2023·天津·统考高考真题）根据下图，正确的是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1 需要MII 期去核卵母细胞
C．过程2 可以大幅改良动物性状
D．过程2 为过程3 提供了量产方式，过程3 为过程1、2 提供了改良性状的方式
1
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2．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物
AT1 蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
3．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因
构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重
组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
4．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型
小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期
获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用
于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
2
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下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
5．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将目
的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制
酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
6．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质
粒，如图1 所示。请回答下列问题：
3
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(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有
，扩增程序中最主要的不同是
。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用__________________。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过
程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有
。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_____________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了PCR
扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有
。
4
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(6) 对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是
。
7．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径
I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了
L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和BrdU
均能与
互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一
组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的百分比
（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
(3)为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，
即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌体，
5
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其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于细胞质，
与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细胞核。请完
善制备小鼠IK 的技术路线：
→连接到表达载体
→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→
→获得小鼠IK。
(4) 各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的
三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被标记
的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
8．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新
型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法和
CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
(1) 图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于
；从愈伤组织到幼苗的培养过程需
要的激素有生长素和
，该过程还需要光照，其作用是
。
(2)图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的
。图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注
。
(3)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是
。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体
（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得
转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是
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，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是
，依据是
。
(5)与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是
（答出2 点即可）。
9．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多
种酶，推测这些酶生效的场所应该是
（填“细胞内”和“细胞
外”）。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段
序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源
切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点可以同源
切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物
对目的基因进行
PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳
清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在
的培养基上
筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，再
重新导入。研究人员在UGA 基因序列两端加上酵母菌DNA 中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA 基因进
行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可以顺利
重连，如图，则应选择方式
进行连接。
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（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在
的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图
。
10．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是
。除图甲中标出的结构外，作为载体，质
粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即
可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物
。已知J 基因转录的模板链位于b 链，
由此可知引物F1 与图甲中J 基因的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
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(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水
平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了
，
条带2 所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
11．（2023·全国·统考高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因为
材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP 基
因的突变基因文库。通常，基因文库是指
。
(2) 构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建
表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为
；②为
，其作用是
；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是
。
(3) 目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色
荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
(4) 新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变基
因进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白基
因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是
。
12．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙
肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工
程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是
。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表
达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是
。能识别载体
中的启动子并驱动目的基因转录的酶是
。
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(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取
进行DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是
。
(5) 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
。
13．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。
某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体
融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备
的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼
苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为
和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处
理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的
失活。对处理后的原生质体在显微镜下用
计数，确定原生质体
密度。两种原生质体1 1∶混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进
行稀释，稀释的目的是
。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，
并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于
。
下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出
，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR 技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA 序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA 序
列b；M1、M2为序列a 的特异性引物，N1、N2为序列b 的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的
。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系，
为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列
b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经
后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预期
的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
14．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行
诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替
换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与
植株的种子大小相近。
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(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和
进行切割，用DNA
连接酶将两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备
。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了
。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养
基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株
（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得
的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植
株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸
内切酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的
条带涂黑。
。
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〖2022 年高考真题〗
1．（2022·辽宁·统考高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转
基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
）
A．预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
2．（2022·河北·统考高考真题·多选）人染色体DNA 中存在串联重复序列，对这些序列进行体外扩增、电
泳分离后可得到个体的DNA 指纹图谱。该技术可用于亲子鉴定和法医学分析。下列叙述错误的是（
）
A．DNA 分子的多样性、特异性及稳定性是DNA 鉴定技术的基础
B．串联重复序列在父母与子女之间的遗传不遵循孟德尔遗传定律
C．指纹图谱显示的DNA 片段属于人体基础代谢功能蛋白的编码序列
D．串联重复序列突变可能会造成亲子鉴定结论出现错误
3．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1 导入谷氨
酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
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(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB 两个标记基因，
为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端引入
XhoⅠ酶识别序列，进行PCR 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含
（EcoR
∕Hind
∕Xho
Ⅰ
Ⅲ
Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2 构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉素
敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片段
全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
4．（2022·重庆·统考高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能
途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui 基因，并开展了相关探索。
步骤I：
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步骤II：
(1) 花药培养能缩短育种年限，原因是
。在步骤I 的花药培养过
程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含
的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I
中能用于制造人工种子的材料是 。
(2) 步骤II 中，eui 基因克隆于cDNA 文库而不是基因组文库，原因是
；在构建重组Ti 质粒时使
用的工具酶有 。为筛选含重组Ti 质粒的菌株，需在
培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I 中的
，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui 基因的鉴定方法是 ，移栽后
若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
5．（2022·江苏·统考高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究
纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能
是 。
(3) 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进行了PCR 扩增
与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，溶液
中添加NaC1 至2．0mo1/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在
催化下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可
示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M 重组质粒（在EcoRⅤ
位点插入片段）。请完成下表。
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分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融
合片段M 中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR 目的产物约为 bp。
确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连接
处上游含有Hind III+EcoR V 的识别序
列，下游含有EcoR V+BamH I 的识别序
列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细
胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在
纤毛基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量相
等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环数）。
从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
6．（2022·河北·统考高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶
抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答
下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的
上，此方法的不足之处是
。
(4) 为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有
（写出两点即可）。
(5) 确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的
以鉴定其抗性程度。下图为
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三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析
（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是
。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。
导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了
抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是
（写出两点即可）。
7．（2022·北京·统考高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E 物质）污染
会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖
细胞等存在E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经
济且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是
。
(2)为监测E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE 和酵母来源的UAS 是两
种诱导型启动子，分别被E 物质-受体复合物和酵母来源的Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方
案1 相比，方案2 的主要优势是
，因而被用于制备监测鱼（MO）。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需
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从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选
项的序号填入相应的方框中。
.
Ⅰ启动子：
。
①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P 生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P 肌）
.
Ⅱ基因：
。
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM 不育的原因是：成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后
造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM 不育的目的是
。
8．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶识别并降解，药物
A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合
蛋白FLAG-P 和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨基端，使
融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介质结合，但不影响P 或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物需满足的条件是
、为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引
物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其
中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA 序列正确，
翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同。据图甲分析，出现该
问题的原因是 。
修改扩增P 基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是
。
(3) 融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A 和UBC 按照图乙中的组合方式分成5 组。各组样品
混匀后分别流经含FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC 抗体检测，检测结果如图丙所示。
已知FLAG-P 和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是
；由②④组或③⑤组的差异推测，P△
中缺失的特定序列的作用是 。
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(4)根据以上结果推测，药物A 治疗该病的机理是 。
9．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，
具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a 是 ，物质b 是 。
在生产过程中，物质b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是
。
(2) 蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有
、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基
本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所
示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的
（填“种类”或“含量”）有关，
导致其活性不同的原因是
。
(3) 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要
写出实验设计思路
。
10．（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于
某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）
为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
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回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR 技术，在优化反应条
件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成
量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
，终止子的作用是
。
(4) 培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
，此外丙酮的积累会伤
害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(5) 这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济
特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于
，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
11．（2022·全国·统考高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作
用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA 病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR 法。这种方法的基本原理
是先以病毒RNA 为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR 技术扩
增相应的DNA 片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR 引物时必须依据新冠病毒RNA 中的
来进行。PCR 过程每次循环分为3 步，其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴
性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1 种情况即
可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明
。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的
编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操
作流程是
。
12．（2022·福建·统考高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生
的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14 的单克
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隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14 基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR 扩增CD14 片段。已知DNA 聚合酶催化引物
的3’—OH 与加入的脱氧核苷酸的5’—P 形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是
（填“
5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。
(2) 载体和CD14 片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1 所示。用Xho I 和Sal 1 分别酶切CD14
和载体后连接，CD14 接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对
CD14 的连接方向进行鉴定，理由是
。
培养能表达CD14 蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
（二）抗CD14 单克隆抗体的制备流程如图2 所示：
(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0 细胞的生长特点是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入
进行专
一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14 抗体，原因是
。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14 抗体，用于检测巨噬细胞。
〖2021 年高考真题〗
1．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（
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）
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA 序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
2．（2021·湖北·统考高考真题）某实验利用PCR 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物
与模板完全配对）外，还有2 条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，
以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA 的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
3．（2021·湖北·统考高考真题）限制性内切酶EcoRI 识别并切割
双链DNA，用EcoRI 完
全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA 片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6
B．250
C．4000
D．24000
4．（2021·山东·统考高考真题）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引
子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用
于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A．“引子”的彻底水解产物有两种
B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
5．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m 的功能，构建了融合表达蛋白M 和tag 标签的质粒，
请结合实验流程回答下列问题：
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(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m 片段。
②为了获得融合tag 标签的蛋白M，设计引物P2 时，不能包含基因m 终止密码子的编码序列，否则将导致
。
③热启动PCR 可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA 聚合酶（Taq 酶）以外的各成分混合后，加热
到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR 扩增，下列叙述正确的有
A．Taq 酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR 相比，热启动PCR 可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR 产物DNA 碱基序列的特异性体现了Taq 酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I 切开的载体A 与添加同源序列的m 混合，用特定DNA 酶处理形成黏性末端，然后降温以促进
，形成A-m 结合体。将A-m 结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA 聚合酶及
酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m 仍能被Sma I 切开，则Sma I 的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3 基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿
嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是
。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag 标签，说明 ，
后续实验可借助tag 标签进行蛋白M 的分离纯化。
6．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把
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“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后将
其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
(3)过程③~⑤中，SgRNA 与Cas9 蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异性
结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9 蛋白可切割
序列。
(3) 利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除一个长度为1200bp 的基因，在DNA 水平上判断基因敲除是否成功
所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是
。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9 质粒中获得重组
质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中，构建得到能大
量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组
DNA 的编辑过程：
。
7．（2021·福建·统考高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛
存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT 基因导入大肠杆菌构建
工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA 的核苷酸序列设计了相应的引物（图1 甲），通过PCR 扩增MT 基因。已知A 位点
和B 位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为
。
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(2)本实验中，PCR 所用的DNA 聚合酶扩增出的MT 基因的末端为平末端。由于载体E 只有能产生黏性末端
的酶切位点，需借助中间载体P 将MT 基因接入载体E。载体P 和载体E 的酶切位点及相应的酶切序列如图
1 乙所示。
①选用 酶将载体P 切开，再用 （填“T4DNA 或“E·coli81DNA”）连接酶将MT 基因
与载体P 相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT 基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E 进
行酶切，将切下的MT 基因和载体E 用DA 连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处
理的大肠杆菌，筛出MT 工程菌。
(3)MT 基因在工程菌的表达量如图2 所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT 工
程菌，理由是 。
8．（2021·辽宁·统考高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人
宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小
为0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
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(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经
过程得到cDNA，将其作为PCR
反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位
点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
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注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
9．（2021·天津·统考高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸
能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的
工程菌株。下图1 为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2 为构建表达载体时所需的关键条件。
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
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①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好的ATG，且能通过
双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1 和2。其中引物1 的5′端序列应考虑
和 。
②将上述PCR 产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有
，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录
系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效
表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体
培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提
高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件
B．使用乳酸菌LDH 基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
10．（2021·北京·统考高考真题）新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗
是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病
毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S 基因连接到位于载体上的
腺病毒基因组DNA 中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
(1)新冠病毒是RNA 病毒，一般先通过 得到cDNA，经 获取S 基因，
酶切后再连接到载体。
(2)重组疫苗中的S 基因应编码________。
A．病毒与细胞识别的蛋白
B．与病毒核酸结合的蛋白
C．催化病毒核酸复制的酶
D．帮助病毒组装的蛋白
(3)为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可
以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→
→ →诱发特异性免疫反应。
(4)重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA 不
会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因
。
11．（2021·山东·统考高考真题）人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位
点结合 BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ 基因表达的抑制，
可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入
表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
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（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图
可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是
，在 R 末端添加的序列所对应
的限制酶是
。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要
种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达
荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无
荧光的原因是
。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R
扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的
结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于
，理由是
。
12．（2021·浙江·统考高考真题·节选）回答下列（一）小题：
（一）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以
及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体
，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼
每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体
形成
，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并
有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有
（答出2 点即可）。提取质粒后，采用
法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并
观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用
分散斑马鱼囊胚的内细胞
团，取分散细胞作为初始材料进行
培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为
，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
13．（2021·河北·统考高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用
植物修复技术将土壤中的Cd 富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），
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可降低土壤中Cd 的含量。为提高植物对Cd 污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd 转运蛋白（YCF1）
基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这
个群体称为
。
（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是
。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是
。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1 基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
。研究者进一步获得了转YCF1 基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材
料的目的是
。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd 污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同
器官中Cd 含量（图2）。据图1 可知，与野生型比，转基因植株对Cd 具有更强的
（填“耐性”或“富集能力”）；据图2 可知，对转基因植株的
进行后续处理对于缓解土壤
Cd 污染最为方便有效。
（5）已知YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高
Cd 环境的原因是
。
相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd 污染土壤修复植物的优势在于
（写出两点即可）。
14．（2021·全国·统考高考真题）PCR 技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，
医生进行了相关操作：①分析PCR 扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR 扩增DNA 片段；
④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是
（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是
。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、
三步，其中复性的结果是
。
（3）为了做出正确的诊断，PCR 反应所用的引物应该能与
特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指
。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
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15．（2021·广东·统考高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体
系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4 步酶促反应的非
细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造
成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有
。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋白，
方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4 种酶的表达。表达载体转
化大肠杆菌时，首先应制备
细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的
方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是
。在分子水平上，可以通过改变
，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
16．（2021·全国·高考真题）用DNA 重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生
物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4 种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA 连接酶有E. coli DNA 连接酶和T4DNA 连接酶。上图中
酶切
割后的DNA 片段可以用E. coli DNA 连接酶连接。上图中
酶切割后的
DNA 片段可以用T4DNA 连接酶连接。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是
。
（3）DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受
体细胞中能
；质粒DNA 分子上有
，便于外源DNA
插入；质粒DNA 分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细
胞，方法是
。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指
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。
〖2020 年高考真题〗
1．（2020·北京·统考高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属
转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3 基因，同时避免内源HMA3 基因的干扰，在进行PCR
扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③
B．①+②
C．③+②
D．③+④
2．（2020·浙江·高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体
并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2 个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂
不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA 检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不
抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA 可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全
酶切环状质粒后，出现3 条带。表明该质粒上一定至少有3 个被该酶切开的位置
3.（2020·天津·统考高考真题）阅读下列材料，回答下列小题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进
展。
资料一：人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基
因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规
模爆发。
资料二：小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出
抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7 导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉
病大规模爆发。
资料三：疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5 种不同
抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1 中。在按蚊肠道内，AS1 工程菌分泌的基因表达产物
可杀灭疟原虫。因AS1 可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1 工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一
般可被阻断。
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（1）目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是（ ）
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
（2）在利用种间关系进行生物防治的措施中，下列分析错误的是（ ）
A．施用绿僵菌工程菌减少虫害，不改变绿僵菌与害虫之间存在寄生关系
B．引入Fhb7 增强小麦的抗菌性，目的是调节真菌对植物的寄生能力
C．AS1 工程菌分泌的多种表达产物不改变AS1 与按蚊之间存在共生关系
D．使AS1 工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是调节按蚊对人的寄生能力
4．（2020·海南·统考高考真题）某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。
回答下列问题。
（1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是
。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR 法。操作的
基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y 染色体的性别决定基因，即SRY 基
因的一段碱基设计
，以胚胎细胞中的DNA 作为模板，进行PCR 扩增，最后用SRY 特异性探针
检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为
；出现阴性反应者，胚胎为
。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常
用的分子检测方法是
，检测的基本思路是
。
5．（2020·北京·统考高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的
枯草芽孢杆菌菌株（B 菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达
载体（HT 质粒）连接，再导入B 菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
（1）纤维素属于 糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是
。
（2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出
的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。
（3）C1酶基因以B 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的
方向与已被酶切的HT 质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I 和BamH I 的酶切位点。该基因内
部没有这两种酶切位点。图1 中酶切位点1 和2 所对应的酶分别是
。
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（4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1 不进行处理，对照组2 进行相应
处理。在相同条件下培养96 小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能
力最强。对照组2 的处理应为 。
（5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用
。（举一
例）
5．（2020·江苏·统考高考真题）如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 的方法，简捷地分析出已知序列
两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I 酶切为例）：
请据图回答问题：
（1）步骤I 用的EcoR I 是一种 酶，它通过识别特定的
切割特定位点。
（2）步骤Ⅱ用的DNA 连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成
；PCR
循环中，升温到95℃是为了获得
；TaqDNA 聚合酶的作用是催化
。
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（3）若下表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，步骤Ⅲ选用的PCR 引物必须是
（从引物①②③④中选择，填编号）。
DNA 序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序
列
PCR 引物
①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′
（4）对PCR 产物测序，经分析得到了片段F 的完整序列。下列DNA 单链序列中（虚线处省略了部分核苷
酸序列），结果正确的是 。
A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′
B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′
C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′
D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′
6．（2020·山东·统考高考真题）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科
研人员将能表达出基因编辑系统的DNA 序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx 基因）启动子
序列的定点编辑，从而获得了3 个突变品系。
（1）将能表达出基因编辑系统的DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，所需的酶是
， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的
过程称为 。
（2）根据启动子的作用推测，Wx 基因启动子序列的改变影响了
，从而改变了 Wx 基因的转录水平。与野生型水稻相比，3 个突变品系中Wx 基
因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填：发生或不发生)改变，原因是
。
（3）为检测启动子变化对Wx 基因表达的影响，科研人员需要检测Wx 基因转录产生的mRNA （Wx
mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经
过程获得总 cDNA。通过PCR 技
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术可在总cDNA 中专一性的扩增出 Wx 基因的cDNA，原因是
。
（4）各品系Wx mRNA 量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为
，原因
是 。
7．（2020·天津·统考高考真题）Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。
小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利
用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达
载体，技术路线如下。
据图回答：
（1）为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B 链编码序列的
起始30 个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA 中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子
数有 个。
（2）在人胰岛素A、B 肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B 肽链。下列有关分
析正确的是
。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A 链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，
可形成 种DNA 片段。
（4）检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所
经历的细胞结构依次是
。
（5）用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识
别它的免疫细胞有 。
A．B 细胞 B．T 细胞 C．吞噬细胞 D．浆细胞
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〖2019 年高考真题〗
1．（2019·江苏·统考高考真题）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（ ）
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
2．（2019·海南·统考高考真题）人的T 细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多
肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y 的基因，可从人的T 细胞中提取
作为模板，在
催化下合
成cDNA，再利用
技术在体外扩增获得大量Y 的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y 的基因插入农杆菌Ti 质粒上
的
中，得到含目的基因的重组Ti 质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶
肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y 的愈伤组织，则说明Y 的基因已经
。
（4）天然的Y 通常需要在低温条件下保存。假设将Y 的第6 位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，
若要根据蛋白质工程的原理对Y 进行改造以提高其热稳定性，具体思路是
。
3．（2019·江苏·统考高考真题）图1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0 具有四环素
抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
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（1）EcoRV 酶切位点为
，EcoR V 酶切出来的线性载体P1 为 末端。
（2）用TaqDNA 聚合酶进行PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体
P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为
的脱氧核苷酸，形成P2；P2 和目的基因
片段在
酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C 三类菌落，
其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是
（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是
、
。
（5）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR 鉴定。图2 所示
为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是
。某
学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp 片段，原因是
。
4．（2019·天津·统考高考真题）B 基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但
在卵细胞中不转录。为研究B 基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B 基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 。
A．含B 基因的染色体缺失 B．DNA 聚合酶失活
C．B 基因发生基因突变 D．B 基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或
中提取总RNA，构建 文库，进而获得B 基因编码蛋
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白的序列。将该序列与Luc 基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白
质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程 中T-DNA 整合到受体细胞染色体DNA 上，过程
在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是
。
A．将随机断裂的B 基因片段制备成探针进行DNA 分子杂交
B．以Luc 基因为模板设计探针进行DNA 分子杂交
C．以B 基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA 杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵
细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明
。
〖2018 年高考真题〗
1．（2018·北京·统考高考真题）用XhoI 和SalI 两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA 片段，酶切位点及
酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（ ）
A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalI 处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA 片段是单链DNA
2．（2018·浙江·统考高考真题）将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，
这种导入外源基因的方法属于（ ）
A．杂交育种
B．转基因技术
C．单倍体育种
D．多倍体育种
3．（2018·上海·高考真题）阻止病人的致病基因传给子代的方法通常是将正常基因导入病人 （ ）
A．体细胞的细胞质
B．生殖细胞的细胞质
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C．体细胞的细胞核
D．生殖细胞的细胞核
4．（2018·上海·高考真题）以重组DNA 技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。
(1)获得目的基因的方法通常包括 和 。
(2)切割和连接DNA 分子所使用的酶分别是 。
(3)运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或
，后者的形状呈
。
(4)由于重组DNA 分子成功导入受体细胞的频率 ，所以在转化后通常需要进行
操作。
(5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和
序列上是相同的。
5．（2018·海南·统考高考真题）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农
杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜 （填“受伤的”或“完好的”）叶片与
含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是
。
（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中
已转移到植物
细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与
不含甜蛋白个体数之比为1:1，则说明甜蛋白基因已经整合到
（填“核基因组”
“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”）中。
（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用
作为外植体进行组织培养。
（4）通常，基因工程操作主要有4 个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体
细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为
。
6．（2018·天津·统考高考真题）甲型流感病毒为RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017
年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA 为模板，逆转录成对应
DNA 后，利用
技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序
列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的
，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
（2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA 的基因，其产物的反密码子能与
（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。将该基因与
连接
后导入宿主细胞。提取宿主细胞的
进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA 的
转基因宿主细胞。
（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将（1）中的重组质粒导入（2）中的转基因宿主细胞，并在补加
的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒
基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA 基因转录时，识别其启动子的酶是
。
A．病毒的DNA 聚合酶
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B．宿主的DNA 聚合酶
C．病毒的RNA 聚合酶
D．宿主的RNA 聚合酶
（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不
具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起
免疫，增强免疫保护效
果。
7．（2018·全国·统考高考真题）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性
可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP 基因的5′末
端，获得了L1-GFP 融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和
酶切位点的示意图如下，图中E1~E4 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0 时，使用了两种限制酶，这两种酶是
。使用这
两种酶进行酶切是为了保证
，也是为了保证
。
（2）将P1 转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1 基因在牛的皮肤细
胞中完成了
和
过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的
移
入牛的
中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR 方法进行鉴定。在鉴定时应分别以
该牛不同组织细胞中的
（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR 模板。
8．（2018·江苏·统考高考真题）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀
粉酶基因（1656 个碱基对），利用基因工程大量制备琢α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
（1）利用PCR 技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的
。
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（2）为了便于扩增的DNA 片段与表达载体连接，需在引物的
端加上限制性酶切位点，且常在两
条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是
。
（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中
的设定与引物
有关，
的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）
①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间
（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA 片段包含
个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子
最多有 种。
（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶
活性，结果如下：
缓冲
液
50mmol/LNa2HPO4-KH2PO4
50mmol/LTris-HCl
50mmol/LGly-NaOH
pH
6．0
6．5
7．0
7．5
7．5
8．0
8．5
9．0
9．0
9．5
10．0
10．5
酶相
对活
性%
25．4
40．2
49．8
63．2
70．1
95．5
99．5
85．3
68．1
63．7
41．5
20．8
根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为
。
〖2017 年高考真题〗
1．（2017·北京·统考高考真题）为了增加牡丹的花色类型，研究者从某植物中克隆出花色基因C （图
1），拟将其与质粒（图2）重组，
再借助农杆菌导入菊花中。
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下列操作与实验目的不符的是（ ）
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和DNA 连接酶构建重组质粒
B．用含C 基因的农杆菌侵染牡丹的愈伤组织，将C 基因导入细胞
C．在培养基中添加青霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C 基因是否整合到菊花染色体上
2．（2017·上海·统考高考真题）生物工程包含多项分支技术，就其产业化应用而言，生物工程的基本原理
是（ ）
A．必须改造相关生物的基因
B．以糖类物质作为主要原料
C．以活细胞作为生物反应器
D．以原生物体的代谢物为产品
3．（2017·江苏·统考高考真题）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过
多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR 扩增过
程示意图如下，请回答下列问题：
（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过 获得 用于PCR 扩增。
（2）设计一对与MT 基因两端序列互补配对的引物（引物1 和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中
需要增加适当的
位点。设计引物时需要避免引物之间形成
，而造成引物自连。
（3）图中步骤1 代表
，步骤2 代表退火，步骤3 代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR 扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏
的碱基配对。
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退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但
的引物需要设
定更高的退火温度。
（5）如果PCR 反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有
（填序号：①升
高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。
4．（2017·上海·统考高考真题）列关于遗传信息的传递与表达的问题
为了探究基因在高等动物体内不同发育阶段和不同类型的细胞中表达的持异性，通常以绿色荧光蛋白编码
基因(GFP)作为目的基因构建转基因动物。
1. 得GFP 基因的方法一般包括 和 。
2. 使用限制酶PstI(识别序列和切割位点如图A 所示）切开GFP，其产生的末端应该为
。
3. 知图B 所示质粒经EcoRI 和AatII 联合酶切后形成1.0kb 和3.2 kb (1kb = 1000 对碱基）两种DNA 片段，若
将0.8 kb 的单个基因插在质粒的PstI 位点处，所形成的重组质粒用EcoRI 和AatII 联合酶切后，能形成两种
DNA 片段，其大小应分别为 kb 和 kb。
4. 上述重组质粒导入小鼠受精卵雄性原核中的常规方法是 。
5. 上述受精卵移植发育而成且头部发荧光的转基因小鼠中，全身各种组织或细胞均含有的物质是 。
①GFP 基因 ②GFPmRNA ③GFP 蛋白
A．① B．①② C．②③ D．①②③
5．（2017·全国·统考高考真题）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真
核生物所具有的切除内含子对应的RNA 序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子）可以表达出某种特定
蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是
。
（2）若用家蚕作为表达基因A 的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用
作为
载体，其原因是
。
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（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有
(答出两点即可)等优点。
（4）若要检测基因A 是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是
(填“蛋白A 的基因”或“蛋白A 的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA 是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的
先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是
。
6．（2017·全国·统考高考真题）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过
基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验
材料，原因是 。提取RNA 时，提取液
中需添加RNA 酶抑制剂，其目的是 。
（2）以mRNA 为材料可以获得cDNA，其原理是
。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因
是 （答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是
。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据
中心法则分析，其可能的原因是 。
〖2016 年高考真题〗
1．（2016·全国·高考真题）图（a）中的三个DNA 片段上依次表示出了EcoR I、BamH I 和Sau3A I 三种限制
性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoR I、Sau3A I 的切点是唯
一的）。
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根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH I 酶切得到的目的基因可以与上述表达载体被
酶切后的产物连接，理由是
。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。
这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，不能表达的原因
是 。
（3）DNA 连接酶是将两个DNA 片段连接起来的酶，常见的有
和
，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是
。
2．（2016·全国·高考真题）某一质粒载体如图所示，外源DNA 插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活
（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I 酶切后，与用
BamH I 酶切获得的目的基因混合，加入DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结
果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒
载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有
（答出两点即可）。
而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状
目的基因的细胞是不能区分的，其原因是
；并且
和
的细胞也是不能区分的，其原
因是
。在上述筛选的基础上，若
要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有
的固体培养
基。
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（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA 复制所需的原料来自于
。
3．（2016·海南·统考高考真题）基因工程又称为DNA 重组技术，回答相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即
和从
中分离。
（3）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA 文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA 文库中含
有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是
。
（3）在基因表达载体中，启动子是
聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表
达载体的受体细胞，最常用的原核生物是
。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有
和
颗
粒。
4．（2016·江苏·统考高考真题）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2 中标注了相关限制
酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用
两种限制酶切割，酶切后
的载体和目的基因片段，通过
酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将
其转入处于
态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加
，平板上长
出的菌落，常用PCR 鉴定，所用的引物组成为图2 中
。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA 末端与BclⅠ酶切的DNA 末端连接，连接部位的6 个碱基对序列为
，对于该部位，这两种酶
(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1 质粒最多可能获得
种大小不同的DNA 片段。
5．（2016·天津·统考高考真题）人血清白蛋白（HSA） 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图
是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
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（1）为获取HSA 基因，首先需采集人的血液，提取
合成总cDNA，然后以cDNA 为模
板，采用PCR 技术扩增HSA 基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框
内标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA 的载体，需要选择的启动
子是
（填写字母，单选）。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是
。
（4）人体合成的初始HSA 多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选
择途径Ⅰ获取rHSA 的优势是
。
（5）为证明rHSA 具有医用价值，须确认rHSA 与
的生物学功能一致。
〖2015 年高考真题〗
1．（2015·重庆·高考真题）下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA 反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
2．（2015·全国·高考真题）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305 个氨基
酸组成。如果将P 分子中158 位的丝氨酸变成亮氨酸，240 位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质
（P1）不但保留P 的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的
进行改造。
（2）以P 基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因，所获得的基因表达
时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括
的复制；以及遗传信息在不同分子之间的
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流动，即： 。
（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过
和 ，进而确定相对应的脱氧
核苷酸序列，据此获得基因，在经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物
进行鉴
定。
3．（2015·江苏·高考真题）胰岛素 A、B 链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。 图 1 是该方法所用的
基因表达载体,图2 表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B 分别表示
-半
乳糖苷酶与胰岛素 A、B 链融合的蛋白)。 请回答下列问题:
(1)图1 基因表达载体中没有标注出来的基本结构是 。
(2)图1 中启动子是
酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉
素抗性基因的作用是
。
(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有 。
(4)β-半乳糖苷酶与胰岛素A 链或B 链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在
于 。
(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的 A 链或 B 链,
且
-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为
。
(6)根据图2 中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。 你的推测结果是
,理由是 。
4．（2015·江苏·高考真题）荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA 片段为探针，与染色体上对应的DNA
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片段结合，从而将特定的基因在染色体上定位。请回答下列问题:
(1)DNA 荧光探针的制备过程如图1 所示，DNA 酶Ⅰ随机切开了核苷酸之间的
键从而产
生切口，随后在DNA 聚合酶Ⅰ作用下，以荧光标记的
为原料，合成荧光标记
的D NA 探针。
(2)图2 表示探针与待测基因结合的原理。先将探针与染色体共同煮沸，使DNA 双链中 键断裂，形成单
链。随后在降温复性过程中，探针的碱基按照
原则，与染色体上的特定基因序列形
成较稳定的杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有
条荧光标记的DNA 片段。
(3)A、B、C 分别代表不同来源的一个染色体组，已知AA 和BB 中各有一对同源染色体可被荧光探针标记。
若植物甲(AABB)与植物乙(AACC)杂交，则其F1有丝分裂中期的细胞中可观察到
个荧光点；在减
数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到
个荧光点。
5．（2015·上海·统考高考真题）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
如图A 所示，质粒pZHZ9 上含有X 抗生素抗性基因（XR）和Y 抗生素抗性基因（YR）。其中XR内部含有限
制酶KasI 识别序列，YR内部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgoMIV 识别序列，五种酶的识别序列如图B
（▼表示切割位点），且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。
（1）若要将结构如图C 所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒pZHZ10，则pZHZ9 需用限制酶
切开。
（2）将上述切开的质粒溶液与目的基因溶液混合，加入DNA 连接酶连接后，进行大肠杆菌受体细胞导入
操作。之后，受体细胞的类型（对两种抗生素表现出抗性R 或敏感性S）包含
。
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A．XR、YRB．XR、YSC．XS、YRD．XS、YS
（3）若用KasI 和FseI 联合酶切重组质粒pZHZ 10（只含单个目的基因），则可能产生的酶切片段数为
。
（4）动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是
。
A．受精卵能使目的基因高效表达 B．受精卵可发育成动物个体
C．受精卵基因组更易接受DNA 的插入 D．受精卵尺寸较大，便于DNA 导入操作
6．（2015·福建·高考真题）GDNF 是一种神经营养因子．对损伤的神经细胞具有营养和保护作用．研究人
员构建了含GDNF 基因的表达载体（如图1 所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的
研究．请回答：
（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是 。
（2）构建含GDNF 基因的表达载体时，需选择图1 中的
限制酶进行酶切．
（3）经酶切后的载体和GDNF 基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、
GDNF 基因与载体正向连接、GDNF 基因与载体反向连接（如图1 所示）．为鉴定这3 种连接方式，选择
HpaI 酶和BamHI 酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA 片段进行电泳分析，结果如图2 所示．图
中第
泳道显示所鉴定的载体是正向连接的．
（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF 基因是否成功表达，可用相应的
与提取的蛋白质杂交．当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行
培养以得到更多数量的
细胞，用于神经干细胞移植治疗实验．
7．（2015·四川·高考真题）将苏云金杆菌Bt 蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其
过程如下图所示（注：农杆菌Ti 质粒上只有T-DNA 片段能转移到植物细胞中）。
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（1）过程①需用同种
酶对含Bt 基因的DNA 和Ti 质粒进行酶切。为
将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用 培养基。
（2）过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让
进入棉花细胞；除尽农杆菌
后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是
。
（2）若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加
以
获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是
。
（4）检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是
。种植转基因抗
虫棉能减少
的使用，以减轻环境污染。
8．（2015·海南·高考真题）在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内
质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段
C 后，产生A、B 两条肽链，再经酶丙作用生成由51 个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技
术可大量生产胰岛素。回答下列问题：
(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是
，合成胰高血糖素的细胞是
。
(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的
序列，用该序列与质粒表
达载体构建胰岛素原基因重组表达载体，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成
的基因工程菌。
(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，则用该工程
菌进行工业发酵时，应从 中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。
〖2014 年高考真题〗
1．（2014·重庆·高考真题）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（
）
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A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA 聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti 质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
2．（2014·广东·高考真题·多选）利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如图所示，下列叙述
正确的是（ ）
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR 获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl 溶液制备
D．过程④可利用DNA 分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
3．（2014·江苏·高考真题·多选）下列关于基因工程技术的叙述,错误的是（ ）
A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6 个核苷酸序列
B．PCR 反应中温度的周期性改变是为了 DNA 聚合酶催化不同的反应
C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
4．（2014·海南·高考真题）下面是将某细菌的基因A 导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。
请据图回答：
⑴获得A 有两条途径：一是以A 的mRNA 为模板，在
酶的催化下，合成互补的单链DNA，
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然后在
作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的
序列，推测出相应的mRNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA 的
序列，再通过化学方法合成所需基因。
⑵利用PCR 技术扩增DNA 时，需要在反应体系中添加的有机物质有
、
、4 种脱氧核苷酸三磷酸和耐热性的DNA 聚合酶，扩增过程可以在PCR 扩增仪中完成。
⑶由A 和载体B 拼接形成的C 通常称为
。
⑷在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是
。
5．（2014·全国·高考真题）植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若从该植物中获得该耐
旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：
(1)理论上，基因组文库含有生物的 基因；而cDNA 文库含有生物的
基因。
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中
出所需的耐旱基因。
(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物
的体细胞中，经过一系列的过程
得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的
，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的
是否得到提高。
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3:1 时，则可推测该耐
旱基因整合到了
（填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条
上”）。
6．（2014·天津·高考真题）嗜热土壤芽孢杆菌产生的β—葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶，为使
其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：
.
Ⅰ利用大肠杆菌表达BglB 酶
PCR
⑴
扩增bglB 基因时，选用
基因组DNA 作模板。
⑵下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB 基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR 扩增的bglB 基因重组进该质
粒，扩增的bglB 基因两端需分别引入
和 不同限制酶的识别序列。
⑶大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为
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。
Ⅱ．温度对BglB 酶活性的影响
⑷据图1、2 可知，80℃保温30 分钟后，BglB 酶会 ；为高效利用BglB 酶降解纤维素，反应温度
最好控制在 。
A．50℃ B．60℃ C．70℃ D．80℃
Ⅲ．利用分子育种技术提高BglB 酶的热稳定性
在PCR 扩增bglB 基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB 基因的突变率，经过筛选，可获得能表达热稳定性
高的BglB 酶的基因。
⑸与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比，上述育种技术获取热稳定性高的BglB 酶基因的效率更高，
其原因是在PCR 过程中
A．仅针对bglB 基因进行诱变
B．bglB 基因产生了定向突变
C．bglB 基因可快速积累突变
D．bglB 基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变
7．（2014·上海·高考真题）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
pIJ702 是一种常用质粒（下图），其中tsr 为刘链丝菌素（一种抗生素）抗性基因；mel 是黑色素合成基因，
其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而限制酶ClaI、BglⅡ、PstⅠ、SacⅠ、SphⅠ在PIJ702 上分别
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只有一处识别序列。
（1）质粒DNA 分子中的两条链靠
键维系成双链结构。
（2）以SacI 和SphI 切取的目的基因置换PIJ702 上0.4kb（1kb=1000 对碱基）的SacI/SphI 片段，构成重组
质粒pZHZ8.上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在上表中。因此判断目的基因内部是否含有BglⅡ切割
位点，并说明判断依据
。
（3）已知PIJ702 上含mel 基因的Cla
/Pst
Ⅰ
Ⅰ区域长度为2.5kb，若用ClaⅠ和PstⅠ联合酶切pZHZ8，则参
照表数据可断定酶切产物中最小片段的长度为
kb。
（4）不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况如下表所示。若要筛选接纳了PIJ702 或
pZHZ8 的链霉菌细胞，所需的硫链丝菌素最小浓度应为
μg/mL （填写表格中给定浓度）；含有
重组粒pZHZ8 的菌落呈
色。
（4）上述目的基因来源于原核生物，其蛋白编码序列（即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列）
经测定为1265 对碱基，试判断对这段序列的测定是否存在错误：
，并说明依据
。
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