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专题18 基因工程
(2024 年1 月浙江省)1. 关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是（ ）
A. 试管动物的培育
B. 转基因食品的生产
C. 治疗性克隆的研究
D. 生物武器的发展和生产
(2024 年山东省）13. 关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A. 整个提取过程中可以不使用离心机
B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C. 鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
(2024 年山东省）25. 研究发现基因L 能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术
编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI 切点处插入大豆基因L 的向导DNA 序列，
将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、
目标基因L 部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目标基因L 时，所用的引物越短，引物特异性越______（填
“高”或“低”）。限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI 酶切大豆基
因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI 酶切后，载体上保
留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。
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（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为
了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，部分序列信息及
可选用的酶切位点如图乙所示，PCR 产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是
______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
（3）实验中获得1 株基因L 成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1 条
染色体有T-DNA 插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占
比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
（2024 年高考全国甲卷）12. 某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR 扩增目的基因。PCR 的每次循环包括变性、复性、延伸3 个阶段，其中DNA 双链打
开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA 链碱基之间的化学键是________。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c 的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a
单酶切相比，用酶a 和酶b 双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c 单酶切构建重组质
粒时宜选用的连接酶是________。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若
要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
（4）蛋白E 基因中的一段DNA 编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG
开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G 缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
2
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（2024 年安徽省）14. 下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低
B. 利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C. DNA 在不同浓度NaC1 溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA 粗提物
D. 将溶解的DNA 粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
（2024 年广东省）21. 驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能
优异的生物材料，BC 膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，
将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC 膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造
及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
（1）研究者优化了培养基
_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可
在气液界面处获得BC 菌膜（菌体和 BC 膜的复合物）。
（2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA 聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光
调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子
PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP 识别）。为实现蓝光控制染色，
启动子①②及③依次为________，理由是___________。
3
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（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用
为________________________（答两点）。
（4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC 菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现
只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。
（5）有企业希望生产其他颜色图案的BC 膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。
（2024 年吉林省）7. 关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
（2024 年吉林省）25. 将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA 转移）和不含有Vir
基因、含有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提
高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
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注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR
表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预
冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可
能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转
化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B. 将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
（2024 年安徽省）20. 丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合
成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
（1）扩增X 基因时，PCR 反应中需要使用Taq DNA 聚合酶，原因是_________________。
（2）使用BamH I 和 SalI 限制酶处理质粒和X 基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如
图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是___________________________。
5
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、
（3）研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳
源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的____________________，引起发酵液pH 值下降。兴趣小
组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同
浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓
度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置______（填数字）组实验（重复组不计算在内）。
（4）大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是__________________。
（5）发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经_____________________，最终获得发酵产品。
(2024 年1 月浙江省)22. 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转
运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2 种锌转运蛋白M 和N 与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N
基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N 克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序
列信息设计引物进行PCR 扩增，PCR 每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内
______的作用效果。PCR 产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA 分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠
近电泳槽负极接口；当2 个PCR 产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2 个条带之间的距离会
______。回收DNA 片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N 基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利
用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR 快速验证重组转化是否成功。此反应可以用
大肠杆菌悬液当模板的原因是______。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至
液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N 基因在受体细胞中的
表达水平，无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N 基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将
菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006 和0.0006，然后各取10μL 菌液用涂布器均匀涂布在固体
培养基上，培养2 天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M
和N 中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。
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注：OD600 为波长600nm 下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M 或N 基因的表达载
体。
(2024 年1 月浙江省)23. 小鼠毛囊中表达F 蛋白。为研究F 蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技
术获得了F 基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f 小鼠，突变基因用f 表示。f 小鼠皮毛比野生型小鼠长
50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f 杂合子基因型用+f 表示）
回答下列问题：
（1）F 基因敲除方案如图甲。在F 基因的编码区插入了一个DNA 片段P，引起F 基因产生______，导致
mRNA 提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______而丧失活性。要达到此目的，还可以对
该基因的特定碱基进行______和______。
（2）从野生型、f 杂合子和f 小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用
DNA 探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f 小鼠和f 杂合子对应的DNA 片段分别位于
第______泳道和第______泳道。
（3）g 小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f 小鼠相同。f 基因和g 基因位于同一条常染色体上。f 杂合
子小鼠与g 小鼠杂交，若杂交结果是______，则g 和f 是非等位基因；若杂交结果是______，则g 和f 是等
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位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g 杂合子基因型用+g 表示）
（4）确定g 和f 为等位基因后，为进一步鉴定g 基因，分别提取野生型（++）、g 杂合子（+g）和g 小鼠
（gg）的mRNA，反转录为cDNA 后用（2）小题同样的DNA 探针和方法检测，结果如图丙。g 小鼠泳道
没有条带的原因是______。组织学检查发现野生型和g 杂合子表达F 蛋白，g 小鼠不表达F 蛋白，因此推
测F 蛋白具有的作用______。
(河南省2024)11. 某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维
素的菌株（B2）。该小组在含有N 基因的质粒中插入B1基因组的M1 与M2 片段；再经限制酶切割获得含
N 基因的片段甲，片段甲两端分别为M1 与M2；利用CRISPR/Cas9 基因组编辑技术将片段甲插入B1的基
因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示
引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N 基因能在菌株B2 中表达，在构建片段甲时，应将M1 与
M2 片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1 基因组中与向导RNA 结合的DNA。向导RNA 与B1基因组DNA
互补配对可以形成的碱基对有G－C 和________。
（3）用引物P1 和P2 进行PCR 可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板
与引物P3 和P4 进行PCR，实验结果是________。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2 点即可）。
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(甘肃省2024)21. 源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，
某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协
同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是______。
高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了______。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。
（3）过程⑤在基因工程中称为______，该过程需要的主要酶有______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有______。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______的生理
状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异
的原因是______（答出两点）。
生
物
质
原
料
降解率（%）
协同系数
酶
A
酶
B
酶
C
混1
混2
混1
混2
小
麦
秸
秆
7.08
6 03
8.19
8 61
26.98
74.33
114.64
玉
米
秸
秆
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉
米
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
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芯
注：混1 和混2 表示三种酶的混合物
2024 年黑龙江省普通高等学校招生选择性考试临考预测押题密卷-生物学 A 卷1. 吲哚胺-2，3-
二氧酶（IDO）是一种含铁血红素单体蛋白，可催化色氨酸分解代谢，可能与免疫排斥反应、病原体感染、
中枢神经系统疾病（如抑郁）等有关。为研究IDO 表达的相关特性，研究者构建了一个能融合表达IDO 和
绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒IDO-EGFP-C1。回答下列问题：
（1）利用PCR 技术获取IDOcDNA，过程如图1 所示，图中①~③表示步骤，其中影响扩增特异性的步骤
是________。由图可知，扩增温度设置存在差异，其中与酶无关的步骤是______。
（2）构建融合IDO 和EGFP 的重组质粒IDO-EGFP-C1（图2 中KpnI、NheI、AgeI、BglⅡ均为限制酶且指
向其识别序列，KanR为卡那霉素抗性基因，ori 为复制原点，233bp 的片段为IDO 基因的特有序列）。已知
IDOcDNA 的长度为1200bp，而质粒EGFP-C1 的长度为4700bp，其上EGFP 的长度为780bp。图2 为设计
的实验流程（箭头表示正确的插入方向），研究者甲认为用引物a 和引物b 进行PCR 扩增，再将产物用电
泳鉴定，若产生______bp 的DNA 片段即可证明实验成功；但研究者乙认为该实验流程需修正，其最简单
的方法是____________。
（3）重组质粒IDO-EGFP-C1 的测序。研究者乙根据其想法实施了实验并获得预期的产物，通常还需进一
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步通过基因测序对结果进行确认，原因是_____________。
（4）转染结果鉴定。转染IDO-EGFP-C1 质粒的TC-1 细胞中可见荧光蛋白表达，该过程需在培养基中添
加______以便筛选转染成功的细胞，然后提取被转染的TC-1 细胞的基因组DNA，用引物a 和引物c 对其
进行扩增，结果如图3，则图中1 为含______的TC-1 细胞，2、3 为______。
2024 届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题2. 大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠
绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限
制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（ ）
A. DNA 溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
B. 电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理
C. 根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
2024 届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题3. 科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶
（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶
（AmyS2）。获取AmyS2 基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质
粒A 构建成质粒B,将质粒B 与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒
C。下列分析正确的是（ ）
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A. 对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成
B. 生产AmyS2 是从预期AmyS2 功能出发设计其氨基酸序列
C. 可以从导入质粒C 的工程菌的培养液中提取获得AmyS2
D. 构建质粒B 和C,选择的限制酶分别是NdeI 和EcoRI、BamHI 和Eco52 I
2024 届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题4. 人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含
量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的
过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr表示氨苄青霉素抗性基因），五种限制酶的识别序列及切割
位点如下表所示。回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NotⅠ
识别序列及切割
位点
（1）要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是__________。基因工程
技术中通常选择__________种限制酶进行酶切。
（2）人乳铁蛋白基因可利用PCR 技术进行扩增，扩增需要引物__________（在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选
择），连续扩增5 次后至少需要引物_________个。
（3）据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有____________（填“四环素”或
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“氨苄青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用_________工程
技术获得转基因小牛。
（4）检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用___________技术，若___________，则表明目的基因已翻
译形成蛋白质。
（5）对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是
________________。
2024 届东北三省四市教研联合体高三模拟（二）生物试题5. 中国科学家领衔的国际团队发现，驯
鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2 发生突变，利用PCR 技
术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（ ）
A. 研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案
B. PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步
C. DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
D. 一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物
2024 届东北三省四市教研联合体高三模拟（二）生物试题6. 我国科研人员通过基因治疗，成功治
愈了全球首例β-地中海贫血症患者。研究人员运用高精准变形式碱基编辑器(tBE)，对患者自体造血干细胞
中的单个碱基进行编辑，以重新激活γ-珠蛋白的表达，最终使患者血红蛋白水平恢复正常，过程如图1 所
示。相较于图2 中基于 CRISPR 技术的β-地贫基因编辑疗法，该方法见效更快、疗效更好，且不引发患者
基因组突变或片段缺失。请回答下列问题。
（1）基因治疗中通常用到AAV(腺病毒)等，AAV 的作用为____________。
（2）据图2 分析CRISPR 技术中gRNA 起____________(填“导向”或“切割”)的作用。相比 CRISPR
技术(切断双链)，tBE 不需要破坏DNA 双链就能对致病的碱基突变进行校正，由此可知tBE 具有
________优点(写出1 点即可)。
（3）为了检测目的基因是否翻译成γ-珠蛋白，可采用的技术为____________。采用自体造血干细胞编辑
移植的优点为________________________________(写出1 点即可)。
（4）欲验证图1 中基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效，请写出大致实验思路。(注：使用的测量
工具无需说明，β-地中海贫血症志愿者、健康志愿者多人)__________________
（2024 届贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市第一中学黄金二卷三模）7. 胰岛素是治疗人类糖
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尿病的特效药，传统生产胰岛素的方法是从动物胰腺中提取。1978 年，我国科学家将人胰岛素基因（S）
导入大肠杆菌细胞中，构建基因工程菌并进行筛选，使大肠杆菌表达重组人胰岛素，这是我国拥有自主知
识产权的基因工程药物，流程如图所示。为防止目的基因与载体质粒反向连接，选用图中MunI 和NheI 两
种限制酶来切割目的基因和质粒，但INS 基因的两侧无MunI 和NheI 两种限制酶的识别序列及切割位点，
可在PCR 扩增INS 基因时增加MunI 和NheI 两种限制酶的识别序列，以便构建基因表达载体。回答下列问
题：
注：LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
图中限制酶识别序列及切割位点：EcoRI：G↓AATTC、MunI：C↓AATTG、NheI：G↓CTAGC、XhoI：C↓TCGAG
（1）设计引物时需要在引物的________（填“3'”或“5'”）端增加相应限制酶的识别序列。
（2）已知INS 基因编码区首端和末端（其中一条链）的序列为5'-AGCCCTCC…（中间核苷酸序列）…
GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是________（选填字母序号）。
A. 5'-GAATTCAGCCCTCC-3'
B. 5'-CAATTGAGCCCTCC-3'
C. 5'-GCTAGCGCTGGTTC-3'
D. 5'-CTCGAGGAACCAGC-3'
（3）流程中步骤③将目的基因导入大肠杆菌前，常用_________处理大肠杆菌细胞，以提高转化率。转化
后的大肠杆菌，需要配制培养基进行培养，配制的培养基采用___________法进行灭菌。
（4）在经步骤③处理后的大肠杆菌中进一步分离筛选出导入重组质粒（含目的基因的质粒）的大肠杆菌，
从菌落特征的角度设计一个实验方案进行筛选，要求写出实验思路及预期结果______。
（2024 届广西桂柳高三下学期名校联考）8. 科研人员利用不同算法，可依据蛋白质结构预测其功能。
下列有关说法错误的是（ ）
A. 将未知蛋白质与已知蛋白质的氨基酸序列进行对比分析可以预测蛋白质的功能
B. 通过三维结构对比可以判断两个蛋白质是否有相似的功能
C. 核苷酸序列发生突变，其编码的蛋白质功能就会发生改变
D. 可根据蛋白质结构相似程度判断物种间亲缘关系的远近
（2024 届广西桂柳高三下学期名校联考）9. 基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植
物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ）
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A. 应该将抗虫基因插入农杆菌Ti 质粒的T-DNA 片段内
B. 可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物
C. 目的基因与Ti 质粒的结合未涉及碱基互补配对原则
D. 转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
（2024 届贵州省贵阳一中联考模拟预测）10. 某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘
蓝，过程如图所示，①～④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ酶切位点唯一。其中BamHⅠ与
EcoRⅠ之间的距离为20kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ识别序列和切
割位点如图。请回答：
BamHⅠ：—G↓GATCC— BglⅡ：—A↓GATCT— EcoRⅠ：—G↓AATTC—
（1）常用特异性地扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→__________”三步。
（2）启动子的功能是__________。
（3）步骤①应选择限制酶__________切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加__________，以便筛选
出含目的基因的甘蓝植株，原因是__________。
（4）经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因
存在正向与反向两种连接方式。用__________酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产
物大小，若出现__________条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。
(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)11. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的
基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I 的识别序列和切点是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和
切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（ ）
A. 质粒用限制酶I 切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I 切割
C. 目的基因和质粒均用限制酶I 切割
D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
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(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)12. 下图为DNA 分子的某一片段，其中①②③
分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（ ）
A. DNA 连接酶、限制酶、解旋酶
B. 限制酶、解旋酶、DNA 连接酶
C. 限制酶、DNA 连接酶、解旋酶
D. 解旋酶、限制酶、DNA 连接酶
(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)13. 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，
连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计
引物进行PCR 后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目
的基因为长度300bp 的片段。下列有关说法错误的是（ ）
A. PCR 复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B. 电泳条带迁移的位置和速度与DNA 分子的大小、带电量和构象有关
C. 选取引物甲、丙，扩增出450bp 长度片段时，可以说明目的基因正接
D. 选取引物甲、乙，扩增出400bp 长度片段时，可以说明目的基因反接
(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)14. 巢式PCR 是指先后用外内引物扩增目的基因
的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA 片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目
的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列
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说法错误的是（ ）
A. 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA 片段
B. 第二轮PCR 反应能否进行，是对第一轮PCR 反应正确性的鉴定
C. 由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D. 如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
(广东省汕头市2024 年高三二模考试)15. 转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因
食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗虫基因（crylC）和双T-DNA 载体连接（图示连接后双T-DNA 部分
结构），利用其中的“Cre/LoxP”系统培育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因
编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两个同向的loxP 序列并将两个loxP 间的序列删除。
图：P—启动子（P1 为胚乳特异表达启动子；P2 为绿色组织特异性表达启动子）
回答下列问题：
（1）Cre 酶与基因工程中的______（工具酶）作用类似。
（2）载体中，T-DNA 的作用是转移到被侵染的细胞后__________________，hpt 基因（潮霉素抗性基因）
和gus 基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA 共转化植株的筛选，起到基因表达载体中
____________（填结构）的作用。
（3）筛选得到双T-DNA 共转化成功的植株T0中，hpt 基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。
先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-1、GH-2 和GH-3，自交后得到T1代
植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus 基因进行PCR 检测，产物的电泳结果如
下图a。（不考虑减数分裂时发生互换）
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①T0代中______（填编号）是T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。
②在答题卡对应
图b 中画出植株GH-2 的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置_____（注：用圆点·表示T-
DNA1和T-DNA2在染色体上的位置）
③GH-1 的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt 基因的植株的比例为______。这些植株自交
后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。
（4）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了______，培
育了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片______（填“具有”或“不具有”）抗虫的性状。
(2024 年广东省茂名市高三模拟测试)16. 不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA
（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。
PCR 的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产
生大量的ssDNA。不对称PCR 的简单过程如图所示。假设模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后开始
扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（ ）
A. 限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计
B. 据图可知，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同
C. 上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸
D. 该不对称PCR 过程中需要（26-1）a 个限制性引物
(2024 年广东省茂名市高三模拟测试)17. 在DNA 体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达
载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法
实施的前提条件是载体DNA 上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA 和pBR322 质粒构建基因表达载体，
然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2 所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，
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TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题：
（1）已知限制酶PstI 和BamHI 识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构建重组质粒，
图1 中，若使用限制酶PstI 切割外源DNA 片段，则切割pBR322 应该选择限制酶___（填“PstI 或”
“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是___。
（2）在某次实际操作中，实验人员将外源DNA 片段插入pBR322 的BamHI 切割位点处，构建了重组质粒，
然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2 所示的实验。
①结合图2 阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是___。该培养基中添加了氨苄青霉素
（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA 的重组质粒，这是由于___。
②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落
印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2 阶段二实验所示。导入
了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含___（填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是___。
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(甘肃省西北师范大学附属中学2023-2024 学年高三第五次诊断（三模）)18. 猪流行性腹泻是由
猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性肠道传染病。PEDV 是一种正链单股RNA 病毒，PEDV 基因组共
编码蛋白21 种，这些蛋白共同协调着病毒的复制与增殖。其中Nsp10 蛋白对基因组RNA 合成以及病毒多
聚蛋白的加工有着极其重要的作用。研究人员构建了PEDV Nsp10 基因真核表达载体，为进一步探究PEDV
Nsp10 蛋白的生物学功能以及特性奠定一定的基础。请回答下列相关问题：
（1）对于PEDV 而言，基因指的是______。PEDV 在细胞中的增殖过程如图1 所示。PEDV 感染细胞后，其
基因组既可作为______翻译出病毒特异的蛋白质，又能够作为模板经过______次复制得到子代病毒的基因
组。
（2）Nsp10 基因不能直接进行PCR 扩增，需要经______过程得到相应的产物再进行PCR 扩增。为了便于扩
增后的DNA 片段与表达载体连接，需在引物的______（填“3'端”或“5'端”）加上限制性酶切位点，且
常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是______。
（3）扩增Nsp10 基因的特异性引物分别为：
引物Ⅰ序列：5'-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT-3'，
引物Ⅱ序列：5'-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT-3'
下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点，图2 质粒上的，Ampr代表青霉素抗性基因，其作用是______，
orl 为复制原点，其余为限制酶切割位点，由此推断切割质粒选择的限制酶是______。
限制酶名
称
识别序列和切割位
点
BamHⅠ
5'-G↓GATCC-3'
EcoRⅠ
5'-G↓AATTC-3'
XhoⅠ
5'-C↓TCGAG-3'
2024 届黑龙江省部分学校高三冲刺卷（五）生物试题19. 尖孢镰刀菌容易引起番茄枯萎症，对农
业造成巨大损失。为研究F 基因（目
基因）的功能，科学家利用同源重组交换的原理对F 基因敲除，分
析其生物学功能及致病力。基因敲除过程是先构建基因敲除载体，将基因敲除载体导入受体细胞，经过筛
选找出基因敲除成功的受体细胞。基因敲除原理如下图所示：
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注：Hygr为潮霉素抗性基因；A、B 为实现同源重组交换的序列，C、D、E、G 为其他不同的基因片段；1
～6 为引物。
（1）选取限制酶____、____分别对F 基因左右两端A、B 片段进行酶切，并用____酶将A、B 片段与潮霉
素抗性基因连接，构建目的基因敲除载体。同时需要在潮霉素抗性基因前添加启动子，启动子的作用是
____。
（2）把构建好的目的基因敲除载体导入尖孢镰刀菌细胞内，导入成功后，将菌液放在含____的固体培养
基上培养，使用的接种方法是____。在这一过程中，F 基因与潮霉素抗性基因发生同源重组交换，与____
（填减数分裂时期）的某些行为类似。
（3）培养完毕，挑取单菌落提取其基因组DNA 作为模板，选择引物____进行PCR 扩增，其中引物会结合
在DNA 片段的____（3'或5'）端，扩增30 个循环进行电泳，如果没有F 基因条带，则确定目的基因敲除
成功。
（4）潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达的原因是____。
2024 届黑龙江省部分学校高三冲刺卷（五）生物试题20. 在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量
的有害物质H2O2，PIP2s 为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输。我国的科研团队首次发
现了植物细胞中AT1 基因编码的AT1 蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理如图一所示。图二表示通过
“PCR 替换个别核苷酸获得突变基因”的定点突变技术，且个别核苷酸差异不影响引物与模板链的结合。
回答下列问题：
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（1）盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压_______，吸水能力_______。图一中植物细胞中AT1 基
因编码的AT1 蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理为______。
（2）通过PCR 替换个别核苷酸诱导AT1 基因突变时，引物_______中含有特定的突变，为防止引物相互杂
交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对_____、______用于合成PCR 产物1 和PCR 产物2；然后将
PCR 产物1 和2 加入无引物的PCR 反应体系得到含有点突变的目的基因。再用引物对________扩增目的基
因，得到大量的点突变目的基因。
（3）为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，对引物1 和引物4 的要求是_____。
（4）若将点突变目
基因导入棉花细胞，我国科学家自己独创的方法是______。要检测是否成功表达，
可以从转基因生物个体中提取蛋白质，用相应的抗体进行_______杂交。
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