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专题18 基因工程
一、单选题
1、（2024·天津滨海新·三模）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中
克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如
图）。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3 基因，同时避免内源HMA3 基因的干
扰，在进行PCR 扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③
B．①+②
C．③+②
D．③+④
2、（2024 届河北省保定市十校高三下学期三模）近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程
领域的应用已经被开发，下列关于AI 算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大
的是（ ）
A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构
B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列
C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA 的碱基序列
D．按照设定的mRNA 的碱基序列设计新基因
3、（辽宁省部分学校2024 年高三临考押题考试（三模））为了提高构建基因表达载体的
效率，通常会运用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA 片段，图1、图2 表示含有
目的基因的DNA 片段和质粒上限制酶的识别位点，表中为各种限制酶的识别序列和切割
位点。下列叙述错误的是（ ）
1
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限制酶种类
BamH I
Bcl I
Hind III
EcoR I
识别序列及
切割位点
A．对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行切割以获取目的基因
B．BamHⅠ和Bcl Ⅰ是同尾酶，二者的切割位点不同
C．图中启动子的作用是作为DNA 聚合酶识别和结合部位
D．将该重组质粒导入动物细胞常用显微注射法
4、（2024 届辽宁省高三联考三模）某种嗜热细菌，其栖息的热泉水温可达90℃左右，若
该细菌DNA 分子中含有胞嘧啶脱氧核苷酸M 个，下列关于嗜热细菌的叙述错误的是（
）
A．该细菌DNA 聚合酶可以应用于PCR 技术
B．该细菌DNA 分子中的每个磷酸基团都与2 个脱氧核糖相连
C．该细菌DNA 分子的碱基中A+T/G+C 的比例可能较高
D．该细菌DNA 分子第n 次复制时需要游离的胞嘧啶脱氧核苷酸M×（2n-1）个
5、（2024 届辽宁省高三·三模）通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身的细胞在体外
诱导发育成特定的组织器官，然后再移植回患者体内。图1 和图2 表示利用自身细胞进行
器官移植的两种方法，其中诱导多能干细胞（iPS 细胞）类似于人类的胚胎干细胞。下列
叙述正确的是（ ）
2
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A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的
混合气体的CO2培养箱中
B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者的完全相同，因此移植后不会
发生免疫排斥反应
C．可利用农杆菌转化法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox 基因、c-Myc 基因和Klf 基
因导入成纤维细胞
D．图2 中卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用
去核，可整个注入去核的卵母细胞中
6、（2024·吉林长春·三模）基于AI（人工智能）的蛋白质设计方法可通过现有蛋白质数据
库及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构和功能。下列叙述错误的是（ ）
A．AI 预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则
B．AI 可帮助人们深入了解蛋白质分子结构和功能的关系
C．获得AI 设计的蛋白质，可通过改造或合成基因来实现
D．AI 可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质
7、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠
绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒
DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定
3
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的叙述，正确的是（ ）
A．DNA 溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
B．电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理
C．根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
D．用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
8、（2024·黑龙江大庆·三模）T4 溶菌酶（Ao）在温度较高时易失去活性。研究人员通过
蛋白质工程将T4 溶菌酶第3 位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97 位半
胱氨酸之间形成一个二硫键，获得热稳定性高的T4 溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（
）
A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作
B．蛋白质工程与中心法则的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中
D．A0和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因
9、（2024·浙江·三模）各类生物因子、生物技术误用滥用等会引起生物性危害。以下不会
带来生物安全风险的是（ ）
A．核污水排入海洋导致生物变异
B．转基因抗虫作物长期大规模种植
C．克隆技术用于器官移植和人体克隆
D．禁止生物武器及其技术、设备的扩散
10、（2024·福建宁德·三模）关于“DNA 的粗提取与鉴定”（实验Ⅰ）和“绿叶中色素的
提取和分离”（实验Ⅱ）的相关叙述错误的是（ ）
A．两个实验都使用酒精溶解物质
B．两个实验都需要将实验材料进行充分研磨
C．实验Ⅰ粗提取的DNA 呈现蓝色，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色
D．实验IDNA 在不同浓度NaCl 溶液中的溶解度不同，实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶
解度不同
11、（2024·湖北·三模）棉蚜体内有多种寄生蜂的卵。初级寄生蜂将卵产于棉蚜体内，幼
4
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虫取食棉蚜组织导致棉蚜死亡，形成低蚜。重寄生蜂的卵在初级寄生蜂的幼虫体内孵化并
从中获得营养。现利用PCR 技术对僵蚜及其体内寄生蜂种类进行检测，为了一次鉴定出多
种目标昆虫，加入同一PCR 体系的引物应满足（ ）
①每对引物扩增的序列对应一种昆虫
②每对引物扩增的序列对应多种昆虫
③每对引物扩增的产物长度不同
④每对引物扩增的产物长度相同
⑤所有引物之间不能相互配对
⑥所有引物的长度相同
A．①③⑤
B．②④⑥
C．②③⑥
D．①④⑤
12、（2024·湖南衡阳·三模）当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅
变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类
化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐
渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的
释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是（ ）
A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA 聚合酶的参与
C．步骤④阶段使用的MS 培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI121 质粒的植株作对照
5
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13、（2024·湖南永州·三模）HA 蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上
皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是
利用基因工程技术制备HA 蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别
序列如下，下列叙述正确的是（ ）
A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4 种游离的核糖核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入EcoRI 和
HindⅢ的识别序列，拼接前载体用MfeI 和HindⅢ切割
C．利用PCR 扩增目的基因时，反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是维持渗透压
稳定
D．利用鸡输卵管生物反应器生产HA 蛋白可以大规模用于禽流感疫苗制备
14、（2024·湖南衡阳市祁东县·三模）研究发现，若将第52 位的脯氨酸（密码子为
CCA）替换成苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分
碱基序列及可供选择的引物如图1 所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸
PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2 所示，其中Ⅰ为
转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2 所使用的引物组合为（ ）
6
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A．引物1 和引物4
B．引物2 和引物6
C．引物2 和引物4
D．引物3 和引物5
15、（2024·广东茂名·三模）不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA
（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为
非限制性引物。PCR 的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但
当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR 的简单过程如图所示。假设
模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（
）
A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计
B．据图可知，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同
C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸
D．该不对称PCR 过程中需要（26-1）a 个限制性引物
16、（2024·广东·三模）蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白
质的新时代。如通过蛋白质工程，将干扰素结构上的两个半胱氨酸改为丝氨酸，就可以使
其保存半年，而活性不受影响。下列关于蛋白质工程的叙述，正确的是（ ）
A．蛋白质工程的操作流程与中心法则的方向相同
B．蛋白质工程需要改造或合成蛋白质的编码基因
C．对干扰素的改造无需考虑其空间结构
D．蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列
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17、（2024·重庆渝中·三模）
技术是基因工程中获取目的基因的重要手段，其原理与
体内复制类似。图1、图2、图3 是与
有关的三幅图解，下列相关叙述正确的是
（ ）
A．通过3 次图1 过程的循环即可从含目的基因的
分子中分离出目的基因
B．图2 中第1 组引物适合进行
，第2 组引物不适合进行
C．图3 可反映
体系中热稳定性
聚合酶的功能
D．体内
复制和
中的引物都是核糖核苷酸链
18、（2024·贵州·三模）细胞色素C 是细胞中普遍含有的一种蛋白质。利用DNA 分子杂交
技术和测定DNA 的热稳定性可以判断生物亲缘关系的远近。实验思路如图所示，下列有
关说法错误的是（ ）
A．DNA 的提取利用了DNA 与蛋白质等物质在物理和化学性质方面存在差异的特点
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B．获得的杂合双链DNA 分子，配对的碱基对越多，结构越稳定，变性温度越高
C．T 甲-甲-T 甲-丙大于0 说明甲和丙的DNA 序列不同，但甲与丙细胞色素C 的结构可能
相同
D．由上述结果可以推测，甲与乙的亲缘关系比甲与丙的亲缘关系近
19、（2024·甘肃白银·三模）研究发现，若将第52 位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成
苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可
供选择的引物如图1 所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对
抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2 所示，其中Ⅰ为转录模板链，
引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2 所使用的引物组合为（ ）
A．引物1 和引物4
B．引物2 和引物6
C．引物2 和引物4
D．引物3 和引物5
二、多选题
1、（2024 届河北省保定市十校高三下学期三模）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的
重组质粒，该质粒的部分结构如图所示，其中J 基因序列表达J 蛋白，V5编码序列表达短
肽V5。下列叙述错误的是（ ）
A．作为基因表达载体，该重组质粒通常还需具有标记基因等结构
B．用F2、R2作引物进行PCR 检测，可确定J 基因插入方向是否正确
9
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C．通过启动子的位置和引物的方向可判断该融合基因转录的模板是a 链
D．该启动子高度甲基化对该基因在受体细胞中表达J-V5融合蛋白有利
2、（2024 届辽宁省高三联考三模）终末期心脏病患者需要进行心脏移植，但移植过程中
往往会发生缺血再灌注损伤（IRI），导致心脏坏死。研究发现，IRI 通过促进Caspase8 等
一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官坏死。根据Caspase8 基因合成的小干
扰RNA（siRNA）可以使Caspase8 基因沉默，有效抑制IRI 所致的器官损伤，如图所示。
下列说法正确的是（ ）
A．供者与受者的主要组织相容性抗原一半以上相同，方可进行器官移植
B．重组质粒除了包含目的基因、标记基因外，还必须有启动子和终止子
C．细胞凋亡中会发生Caspase8DNA→siRNA→Caspase8 蛋白的过程
D．基因沉默复合物，抑制遗传信息的翻译过程，使Caspase8 基因沉默
3、（2024·辽宁·三模）研究发现，若将第52 位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸
（密码子为ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的
引物如图1 所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因
进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2 所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的
“ ”代表突变位点。改造过程中PCR2 所使用的引物组合不可能为（ ）
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A．引物1 和引物4
B．引物2 和引物6
C．引物2 和引物4
D．引物3 和引物5
4、（2024·辽宁抚顺·三模）CRISPR/Cas9 基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，
精确引导核酸酶Cas9 切割与sgRNA 配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA 的过程中会改
变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD—1 蛋白基因的2、3、4 片段造成蛋白
质的功能缺失，制作PD—1 基因敲除鼠的流程如图1 所示。将体外转录获得的Cas9mRNA
和sgRNA 导入小鼠的受精卵中，获得了12 只基因编辑小鼠。利用PCR 鉴定小鼠的基因型，
电泳结果如图2 所示。已知P1 和P2 是PCR 的引物。下列相关分析正确的是（ ）
A．敲除2、3、4 片段引起的变异属于基因重组
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B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3 个sgRNA
C．图2 中，4 和12 个体杂交的子代均为敲除纯合子
D．图2 中，3、5、9 个体的体内均能检测到PD—1
5、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶
（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐
高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2 基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该
过程中，将目的基因与原始质粒A 构建成质粒B,将质粒B 与信号肽（一段能够引导目标蛋
白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析正确的是（ ）
A．对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成
B．生产AmyS2 是从预期AmyS2 功能出发设计其氨基酸序列
C．可以从导入质粒C 的工程菌的培养液中提取获得AmyS2
D．构建质粒B 和C,选择的限制酶分别是NdeI 和EcoRI、BamHI 和Eco52 I
三、非选择题
1、（2024·天津北辰·三模）毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程
菌。研究人员以pPIC9K 质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg 的重
组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA 上并实现复制与表达，
部分过程如下图。其中5'AOX1 为AOX1 基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1
（TT）为AOX1 基因终止子，3'AOX1 为AOX1 基因的部分序列（同源重组的重要位点之
一），Bg1Ⅱ、SacⅠ、SnaBⅠ和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg 基因中“→”表示基因转录
方向。回答下列问题。
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(1)过程①PCR 除需要加入Taq 酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入 和 。
(2)为了后续将目的基因定向插入质粒，在进行过程①时应在HBsAg 基因两侧的A 和B 端
分别添加的碱基序列是 、 。
(3)过程③需用一定浓度的 处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆
菌的目的是 。
(4)若用限制酶SnaBⅠ、Bg1Ⅱ联合酶切pPIC9K 质粒，获得的DNA 片段的长度分别是
38kb、27kb、67kb 用限制酶BgⅢ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K 质粒，得到的DNA 片段的长度
分别是38kb、40kb、54kb：已知HBsAg 基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是 ，
获得的重组DNA 的长度为 。
(5)转化的酵母菌需在培养基中加入甲醇，其目的是 。
2、（2024·天津滨海新·三模）抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高
农业生产效率。图1 为抗除草剂转基因玉米的技术流程。
(1)为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA 重组方法：无缝克隆In-
Fusion 技术（图2），其中In-Fusion 酶可以将任何具有相同15bp 末端序列的线性DNA 分
子进行连接，类似同源重组。
13
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①科研人员希望应用以上方法构建含有A 和GUS 基因的重组DNA 分子，首先获得了3 种
DNA 分子如图3，然后混合进行In-Fusion 反应。
如果引物2 上额外添加的片段对应于GUS 基因中加粗的e 片段，那么引物1 和引物4 上额
外增加的片段分别对应载体中的片段 。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过
处理的农杆菌中。
②为筛选成功转入目标重组DNA 分子的菌落，可以选取引物 扩增目的基因并电泳
检测。请在图4 中画出阳性菌落（成功转入目标重组DNA 分子的菌落）的电泳结果 。
(2)农杆菌转化愈伤组织时，用含 的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，
愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。
已知报告基因GUS 表达产物能催化无色物质K 呈现蓝色，则排除假阳性的原理是：报告基
因GUS 在 细胞中表达，而在农杆菌中不表达，因此用无色物质K 处理上述能正常生
长的愈伤组织，假阳性的农杆菌 （出现/不出现）蓝色。
3、（2024·河北承德·三模）培育抗草甘膦转基因大豆时，首先需要构建UTR—CTP—
EPSPS 序列（UTR—前导序列；CTP—叶绿体定位信号肽序列；EPSPS—抗草甘膦基因）
和pCAMBIA1300 质粒的重组载体，构建过程如图所示。重组载体通过电转化方式导入大
肠杆菌DH5R 中，经测序验证后导入农杆菌菌株EHA105 中形成转化的工程菌株，再转染
大豆。回答下列问题：
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(1)构建UTR—CTP—EPSPS 序列与pCAMBIA1300 质粒的重组载体过程中，进行PCR 时需
要在两种引物的 端连接限制酶 的识别序列，引物序列的确定应依据
，PCR 依据的原理是 。
(2)重组质粒PTWGM1 接入的UTR—CTP—EPSPS 序列中，EPSPS 基因与CTP 绑定的目的
是 。利用质粒PTWGM1 可以大量扩增UTR—CTP—EPSPS 片段，是因为其结构
中含有 。
(3)质粒PTWGM1 通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R 的关键是利用电脉冲在 处
打开通道，使得外源DNA 能够顺利进入细胞内。要确定细胞电转化是否成功，需要在培
养大肠杆菌的培养基中添加 进行筛选。
(4)若要回收EPSPS 片段，可将扩增产物通过电泳进行分离后，割下凝胶以回收扩增的
EPSPS 基因。在凝胶中DNA 分子的迁移速率与 （答出两点）有关。若除目标条
带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是 （答出一点）。
4、（2024·河北邯郸·三模）通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1 所示。
同源重组技术结合1c1'-sacB 双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图
2 是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ 基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet'是四
环素抗性基因，sacB 基因是蔗糖致死基因，LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解
成蓝色化合物。回答下列问题：
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限制酶
EcoR I
BamH I
HindⅢ
Xma I
识破序列和
切割位点
5'—G↓AATTC—
3'
5'—G↓GATCC—
3'
5'—A↓AGCTT—
3'
5'—C↓CCGGG—
3'
(1)据图1 分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是 。
(2)采用PCR 技术扩增目的基因时，在PCR 反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，
若目的基因扩增3 代，则共用引物 个。PCR 完成以后，常采用 法来鉴定
PCR 的产物。
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(3)过程①中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加 、 限制酶的识别序列；
过程⑤中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加 基因两端的同源序列。
(4)过程⑦中，在含有 的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除 LacZ 基因菌
株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对 LacZ 基因进行回补，筛选
LacZ 基因回补菌株时应在培养基中添加 。
5、（2024·河北秦皇岛·三模）α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转
移酶（cgt）生产α、β 和γ 环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt 在芽孢杆菌中的产量
较低，诱变效果不佳。cgt 的372 位天冬氨酸和89 位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，
江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt 催化特异性提高
了27 倍。请回答下列问题。
(1)蛋白质工程的第一步通常是确定预期的 。重叠PCR 是常用的DNA 定点突变技术，
其原理如图所示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR 不需要用到 酶。要完成两处位点
的突变，至少要设计 种引物。
(2)下图是该酶编码链的部分序列，请你设计替换372 位天冬氨酸（密码子：GAU、GAC）
到赖氨酸（密码子：AAA、AAG）的引物FP2 和RP1 中三个连续碱基，分别为 、
。
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(3)用大肠杆菌大量生产重组cgt 需要解决酶的分泌问题。重组cgt 位于双突变载体（简称Ｔ
载体）上，研究人员将重组cgt 基因与pET-20b（+）载体（简称p 载体）上的pelB 信号肽
序列连接，构成重组载体cgt-p，该过程如图所示。应选用 、 对T 载体酶切处理，
用 、 对p 载体进行酶切处理，并用 酶构建重组载体cgt-p，导入目的工程
菌。培养基中除基本营养外，还需加入 完成筛选。
6、（2024·河北邯郸·三模）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻
蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。Wx 基因模板链第226 位碱基为G，此时胚乳中直
链淀粉含量最高（表现为非糯性），记为品种G；若该位点突变成T，胚乳中直链淀粉的
合成水平会降低（表现为糯性），记为品种T。已知品种G 和品种T 杂交，后代均表现为
非糯性，下图表示品种G 和品种T 中Wx 基因的部分碱基序列，请回答下列问题：
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(1)研究人员以待测水稻叶片总DNA 为材料进行PCR 扩增，若引物1 的核苷酸序列为5'-
GCTTCACTTCTCTGCTTGTC-3'，则引物2 的核苷酸序列为5'- -3'。
(2)研究人员对PCR 扩增产物经AccⅠ酶（已知AccⅠ酶的识别位点为
，两引物之
间无另外的AccⅠ酶的识别位点）切割后进行 可以检测出该待测水稻属于哪种品种。
若检测结果只观察到长度为 bp 的DNA 条带，则表明该水稻为品种T。
(3)将品种T 的Wx 基因与载体结合构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有 。若
利用我国科学家独创的目的基因导入方法获得转基因水稻，此种方法 （填“需要”
或“不需要”）进行植物组织培养，原因是 。
(4)若利用基因工程改造品种G，获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻，可以将Wx 基因
（填“正向”或“反向”）接入质粒，导入品种G 的受体细胞进而获得转基因水稻，从
水平抑制Wx 基因表达。
7、（2024·河北沧州·三模）龙牙槐木具有较高的药、食两用价值，其活性成分包括楤木皂
苷。总三萜包括三萜皂苷等，三萜皂苷是楤木皂苷主要结构，其合成途径中的一个关键限
速酶基因是Aeβ-AS 基因。研究人员构建了含该基因的表达载体，并对烟草进行异源转化，
以期提高楤木皂苷的产量，WT 组为野生型烟草，L2、L21、L25、L30 均为转基因株系，
相关实验结果如图所示。回答下列问题
(1)在短时间内可通过 技术在龙牙槐木体外大量扩增Aeβ-AS 基因，该过程通常
需要人工合成长度为20～30 个核苷酸的片段，该片段具有的特点是 （答出两
点）
(2)获得足量的Aep-AS 基因后需构建基因表达载体，该载体上启动子的作用是 ，
常用 法将重组载体导入烟草细胞。转基因烟草细胞需经 技术获得
转基因烟草植株，该过程所需培养基中要加入的植物激素是 。
(3)检测Ae-AS 基因是否表达可用 法。转基因株系中总三萜含量较WT 组高，说
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明 。结合图1、2 分析，能提取到较高含量楤木皂苷的株系及部位是
。
8、（辽宁省部分学校2024 年高三临考押题考试（三模））In-Fusion 技术是一项新型的无
缝克隆技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列
（即同源序列，通常为15~20 bp），然后用In-Fusion 酶（能识别双链线性化 DNA 片段：
5'→3'末端任意16 个碱基，使其降解）处理即可实现无缝连接。其操作步骤如图。回答下
列问题：
(1)通过PCR 扩增需要用到引物，引物的作用是 。在设计引物时最好在引物的
端添加限制酶的识别序列。引物 A 或引物 B 要依据 的序列进行设计。若目的基因通
过PCR 循环5 次，需要消耗引物 个，经过程②扩增n 次，得到符合要求的目的基因
片段数量为 。
(2)PCR 过程包括变性、复性、 。其中复性时温度需要降低到50℃左右的目的是
。
(3)图中同源序列1、2 中的碱基序列一般不同，这样设计的原因是 。
(4)将同源序列1 和2 与线性化质粒连接成重组质粒需要 的作用，若将重组质粒导入植
物细胞，则常用的方法为 。与传统构建重组质粒的方法相比， In-Fusion 技术的优势
之一是 。
9、（2024·辽宁沈阳·三模）腓骨肌萎缩症（CMT）是一种常见的遗传性疾病，患者常出现
神经元肿胀、轴突变性及肌肉萎缩等症状。为探究突变的NEFH 基因与CMT 的关系，某
科研团队利用生物工程技术，构建出多只含有突变的NEFH 基因的转基因模型鼠。据图回
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答下列问题：
(1)图1 中基因的编码区是指基因中能够转录mRNA 的区域，其上游、下游存在能调控转录
过程的非编码区。该基因的启动子位于图1 中 区段（填“非编码区1”、“编码
区”或“非编码区2”）。
(2)构建基因表达载体前，需对该基因进行PCR 扩增。PCR 的原理是 。在不影
响该基因编码功能前提下，应选图2 中限制酶 对该基因进行切割，载体也需用
相同的限制酶进行切割的原因是 。
(3)构建基因表达载体后导入小鼠体细胞，再结合生物工程中的 技术制备出转
基因模型鼠（如图3）。4 号鼠遗传物质与2 号鼠 （填“完全”或“不完
全”）相同，原因是 。若4 号鼠表现为 ，说明突变的NEFH 基因
与CMT 的发生有关，此项研究为CMT 的靶向治疗提供了理论基础。
10、（2024 届辽宁省高三联考三模）某真菌的W 基因可编码一种高效降解纤维素的酶：已
知图中W 基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图1 中质粒为载体，进行转
基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题：
限制酶
BamH I
EcoR I
Mfe I
KpmI
Hind II
识别序列
及切割位
点
G↓GATT
C
G↓AATT
C
C↓AATT
C
GCTAC↓
C
A↓AGCT
T
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(1)限制酶主要是从 中分离纯化出来的。应使用限制酶 切割图1 中质
粒，使用限制酶 切割图2 中含W 基因的DNA 片段，以获得能正确表达W 基因
的重组质粒。
(2)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W
基因，其上游启动子应选择 启动子（选填“植物”、“真菌”或“放线菌”）。
(3)W 基因转录的模板链是 （选填“甲链”或“乙链”）。利用PCR 技术对W
基因进行扩增的原理是 ，子链的延伸方向是 。
(4)研究人员欲对W 基因的mRNA 进行RT-PCR，已知其mRNA 的序列为5'-UGAAC-
CCUA…（中间序列）…GUCCACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重
组质粒，用于PCR 扩增的引物应为__________。
A．5'-TGAACGCTA…
B．5'-CCAGTCGAC…C．5'-GAATTCTGA…
D．5'-AACCTTCGA…
11、（2024·辽宁·三模）研究低温条件下番茄细胞WHY1 基因对光合作用的影响，对于温
度敏感型蔬菜作物的栽培具有重要的实践意义。回答下列问题：
(1)研究人员利用重组DNA 技术，将克隆的WHY1 基因与外源高效启动子连接，导入番茄
基因组中构建WHY1 基因的过表达植株（
），如图1 所示。若限制酶切割WHY1 基因
和番茄基因组后形成相同的黏性末端（即图中Ⅰ、Ⅱ处），则会出现
（答出2 点）等情况，从而导致构建过表达植株的成功率下降。
(2)PCR 的产物一般通过电泳来鉴定，结果如图2 所示。1 号泳道为标准，2 号泳道为阳性对
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照（提纯的相关蛋白基因片段），3 号泳道为实验组。1 号泳道的条带实质为 ，若3
号泳道有杂带（非目的DNA 片段）出现，则原因可能是 （答出2 点）。
(3)小干扰RNA（siRNA）能诱导特定基因转录出的mRNA 降解，导致基因沉默。研究人员
据此构建了WHY1 基因的沉默植株（
），siRNA 因阻断了 过程而关闭了WHY1
基因。进一步研究发现，番茄细胞WHY1 基因影响光反应阶段D1 蛋白（可捕捉光能）的
含量，且与温度有关。研究人员用特定抗体检测D1 蛋白在叶绿体内的含量，结果如表所
示。该实验中的自变量为 ，对比三种番茄的D1 蛋白含量可得到的结论是 。
温度
25℃
4℃
植株类型
W
W
D1 蛋白含
量
12、（2024 届辽宁省高三·三模）诱变育种和基因工程育种均为实验室常用的生物育种手段。
已知玉米的抗虫性状由一对等位基因调控，为了得到抗虫玉米植株，某实验室对野生型玉
米种子进行了不同方法的处理后得到目的植株。回答下列问题：
(1)该实验室对野生型玉米种子进行了诱变处理，进行培育、筛选后得到突变植株，该植株
自交，后代中抗虫植株约占1/4，说明诱变引起的突变为 （填“隐性”或“显
性”）突变。进一步研究发现，该突变是由野生型某个基因发生一个碱基由G 到A 的替换
导致的，则野生型基因和抗病基因的碱基序列长度 ，碱基序列 。（后
两空填“相同”或“不同”）
(2)该实验室利用农杆菌转化法将外源抗虫基因（cry）转入野生型玉米细胞得到转化细胞，
并将其培育成植株X，过程如图1 所示，其中1、2 代表染色体，抗氨苄青霉素基因
（AmpR）为标记基因。已知该品种玉米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换。
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①忽略抗虫基因和抗性基因的区别，仅根据两个基因在染色体上位置，除图1 中的转化细
胞种类外，请在图2 中画出还可能得到的其他种类的转化细胞 。
②研究表明，标记基因的产物对细胞具有一定的毒害作用，因此为了得到抗虫性状稳定遗
传且不含标记基因产物的优良植株，可将植株X 进行自交从而获得预期目的的植株。为达
到该目的，是否可以将cry 基因和AmpR基因用同一个 Ti 质粒进行转运？ （填
“可以”或“不可以”），原因是 。
13、（2024·吉林长春·三模）东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌
等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，
该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工
程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。
(1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分
离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用
法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。
(2)通过上述方法筛选得到6 种乳酸菌，测得它们对霉菌的抑菌率如下表，应选择乳酸菌编
号为 的菌株进行后续操作。
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乳酸菌编
号
Ll
L2
L3
L4
L5
L6
抑菌率/%
28．57
19．48
58．44
14．28
6．49
36．36
(3)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检
测与鉴定。下面是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。
①利用PCR 技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 。PCR 过程中，经过4 轮
循环，消耗引物的个数是 。
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的
5＇端加入 （填“BamH I”或“Nde I”）的识别序列。
③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电
泳检测，结果如下图。
1：DNA 标准样
2：普通受体菌的DNA
3：转化操作后受体菌的
DNA
4：无菌水
设置4 号的目的是 （答出1 点即可），电泳结果表明 。
14、（2024·吉林·三模）当蚊子叮咬时，它会将唾液中一种叫做anophelins 的蛋白质（一
种抗凝血因子）注入宿主体内，让血液更自由地流动。长期以来，研究人员一直试图利用
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疟蚊创造人用新型血液稀释剂。回答下列问题：
(1)蚊子产生的anophelins 蛋白对于人体来说是异物，免疫系统会对其进行攻击，发生免疫
反应，这体现了免疫系统的 功能
(2)为获取anophelins 基因，需提取蚊子 的总RNA，再经逆转录过程得到DNA，
将其作为PCR 反应的模板。并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(3)构建基因表达载体时、若科研人员需将anophelins 基因整合到质粒上， 如上图，应使用
限制酶 切割如图中含anophelins 基因的DNA 片段，使用限制酶 切割图
中质粒，以获得能正确表达的重组质粒。
(4)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌，提取来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA 并用
适当的限制酶（如BamHI） 切割， 经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段长度。这一操作的
目的是 。
(5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产anophelins 蛋白更具有优势。其理由是
。
15、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中
含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋
白基因重组质粒的过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr表示氨苄青霉素抗性基
因），五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题：
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限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NotⅠ
识别序列及
切割位点
(1)要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是 。
基因工程技术中通常选择 种限制酶进行酶切。
(2)人乳铁蛋白基因可利用PCR 技术进行扩增，扩增需要引物 （在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ”中选择），连续扩增5 次后至少需要引物 个。
(3)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有 （填“四
环素”或“氨苄青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，
再利用 工程技术获得转基因小牛。
(4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用 技术，若 ，则表明目
的基因已翻译形成蛋白质。
(5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是
。
16、（2024·黑龙江大庆·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较
慢，从而导致可溶性糖含量高，汁多质脆，研究发现这与甜玉米G 蛋白含量较高有关。为
提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G 蛋白的转基因甜玉米新品种。在超
量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti 质粒的酶切位点如图1、2 所示。
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(1)图1 中，强启动子是一段在特殊序列结构的DNA 片段。位于基因的 驱动基因持
续转录，该转录过程中模板链的5’端位于 （填“M”或“N”）端。
(2)图2 所示载体为农杆菌的Ti 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的
转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 。
(3)结合图1 和图2，为使DNA 片段能定向插入Ti 质粒中，可用PCR 技术在DNA 片段的两
端添加限制酶识别序列，M、N 端添加的序列分别是限制酶 的识别序列。
(4)外植体经脱分化过程形成的愈伤组织放入农杆菌液（含重组Ti 质粒）浸泡后，进行植物
组织培养时培养基中需加入 进行筛选，最终获得玉米植株Y1、Y2、Y3.通过对3
个植株的G 蛋白表达量和还原糖的含量进行测定，发现Y3 植株的G 蛋白表达量最多，但
却不是还原糖含量最多的植株，原因可能是 。
(5)下图为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA 需通过剪接（切去内含子对应
序列）和加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提
高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸（RNA 剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，
发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制提出一种假说：吗啉反义寡核苷酸可能导致
RNA 前体上内含子1 和外显子2 的对应序列同时被剪切，而不是内含子1 对应序列被单独
剪切。（外显子：基因中编码蛋白质氨基酸的片段。内含子：基因中不编码蛋白质氨基酸
的片段。）
为证明该假说，设置两组实验，一组玉米受精卵中导入吗啉反义寡核苷酸，另一组不导入。
提取两组受精卵中的RNA，逆转录合成DNA（即cDNA）：
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①以cDNA 为模板，选择图示引物 进行PCR，产物进行电泳鉴定，根据是否有扩
增产物及产物大小判断该假说是否成立。
②若某次电泳结果发现实验组和对照组均没有出现任何条带，从PCR 反应成分的角度分析，
可能的原因是 （至少写出1 点）。
17、（2024·黑龙江双鸭山·三模）某水稻品种含有基因Q，该基因在水稻体细胞和精子中
正常表达，但在卵细胞中却因该基因不能与RNA 聚合酶结合而无法表达。为了获得基因Q
能够表达的卵细胞，研究人员进行了相关研究。回答下列问题：
(1)水稻体细胞中RNA 聚合酶可与基因Q 的 结合开启转录。研究人员从水稻的体
细胞中提取总RNA，经 过程获得基因Q 中编码蛋白质的DNA 片段。通过PCR 技
术扩增该DNA 片段时需要根据 设计两种引物，扩增n 轮需要消耗引物的数量为
。若直接从水稻体细胞中分离DNA，通过PCR 技术扩增基因Q，则至少经过 轮
循环才能得到只含基因Q 的DNA 片段。
(2)构建基因表达载体时，需要在基因Q 的 （填“5′”或“3′”）端添加限制酶的识
别序列，以保证目的基因和载体的正向连接。
(3)研究人员将基因Q 与Luc 基因（荧光素酶基因，荧光素酶能催化荧光素产生荧光）拼接
成Q-Luc 融合基因（融合基因中的Q 和Luc 基因都能独立表达），之后利用农杆菌转化法
将融合基因转入水稻愈伤组织。经过 ，可获得转基因水稻。将转基因水稻培育成
熟后，其卵细胞中的基因Q 能够正常表达，推测可能的原因是 。在分离并培养转
基因水稻卵细胞的过程中，可以筛选出能够表达基因Q 的卵细胞，筛选的方法是 。
18、（2024·江苏南通·三模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的一种传染病。
下图表示研究人员扩增ASFV 的CP530R 和 F317L 基因，并导入含病毒载体1 和pSC101
质粒的大肠杆菌，在细胞内实现同源重组并制备重组病毒疫苗的主要过程。pSC101 是一种
低拷贝数的温度敏感质粒（在30℃下能复制、在37℃下不能复制），recET 基因和ccdA
基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导。请回答下列问题。
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(1)引物F 的设计依据是 。过程①的程序为：98℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，
35 个循环；72℃3min。最后72℃3min 的目的是 。
(2)ccdB 基因编码的毒性蛋白CcdB 抑制DNA 促旋酶，导致细胞死亡。ccdA 基因编码的蛋
白CcdA 可保护细胞免受CcdB 毒害。将大肠杆菌先接种在含 的培养基中，在 ℃
下培养一段时间，加入目的基因并电激；一段时间后将大肠杆菌接种在含 的培养基中，
在 ℃下继续培养，获得含病毒载体2 的大肠杆菌。
(3)据重组原理可知重组蛋白 RecT 的功能有 ，重组过程涉及 键的水解和形成。
(4)转化后的 Vero 细胞，在37℃、含 （气体条件）的培养箱中培养48h，收获细胞及
上清液，利用 技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势
是 。
19、（2024·浙江·三模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国野生
山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题：
Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种
(1)人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）
葡萄植株进行 、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的 ，完成杂交。
(2)胚离体培养。杂交后7-10 天，剪取子房经75%乙醇或 消毒后，用 多次冲洗，用解
剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。
Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D 基因的功能展开相关研究
(3)科研人员利用pG 载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4 基因的酵母AH109 菌株
中，如下图所示。GAL4 基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109 菌株为色氨
酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。
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①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的 组，此外还需额外添加
，通过显色反应做进一步验证。
A 组：加色氨酸和组氨酸
B 组：不加色氨酸和组氨酸
C 组：加组氨酸，不加色氨酸
D 组：加色氨酸，不加组氨酸
②实验结果表明抗寒相关D 基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实
验结果。
对照组1：酵母菌导入pG-GAL4 重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。
对照组2：酵母菌导入 ，实验结果： 。
实验组：酵母菌导入 ，实验结果： 。
(4)将抗寒相关D 基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D 基因和抗除草剂基因的稳定
表达载体，用含 的培养基筛选愈伤组织，用PCR 方法筛选出 植株，72 小时 诱导
培养，检测植株中D 蛋白的含量以判断抗寒能力。
20、（2024·安徽·三模）“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”
大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。Cre-LoxP 系统能够实现特定基因的敲除，其技术
过程如图1 所示。
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(1)当两个LoxP 序列位于同一个DNA 分子上且方向相同时，Cre 重组酶能将两个切割位点
之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。据此可知，Cre 重组酶
在此过程中的作用类似于 酶。在特定基因的敲除过程中，若两个LoxP 序列方向相反时，
Cre 重组酶使两个LoxP 间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于 。
(2)图1 中LoxP 序列的方向取决于序号 对应的区域。一个LoxP 序列的内部被Cre 重组酶
切割后，将在DNA 序列的 （填5′或3′）端形成游离的磷酸基团。
(3)科学家以小鼠为材料，将三种荧光蛋白基因、两种LoxP 序列与脑组织特异表达启动子
M 相连接，构建图2 所示的基因表达载体，再用 法将该基因表达载体导入小鼠的受精卵
中，进而得到仅含一个图2 所示片段的转基因小鼠，再经过进一步操作，获得纯合的转基
因小鼠a（不含Cre 酶）。
(4)图2 所示序列的两个LoxP1 之间或两个LoxP2 之间的基因，只会被Cre 酶识别并切割一
次。为使脑组织细胞中Cre 酶的表达受调控，研究者将Cre 酶基因与启动子N（由信号分
子X 开启）连接，经一系列操作，获得纯合转基因小鼠b，将纯合小鼠a 和b 杂交，得到
F1。
a.若无X 作用时，该小鼠脑组织的色彩为 色，其他组织细胞颜色为 色。
b.若有X 作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理： 。
21、（2024·安徽·三模）利用金属硫蛋白启动子（PCUP1）和绿色荧光蛋白（CFP）基因等
构建重组质粒PCUP9K-CFP，并通过氯化锂法转化毕赤酵母，获得工程菌株，工程菌细胞
及其发酵液中可检出绿色荧光蛋白。发酵液中分别加入不同浓度的铜离子处理2h 后，结果
如图1；分别加入10μmmVL 的铜、铬、镉和砷离子处理2h 后，结果如图2（CK 为对照
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组）。请回答下列问题：
(1)根据图1 结果可知，GFP 基因表达可以被一定浓度的铜离子促进，说明PCUPI 属于
启动子，构建基因表达载体需要的工具酶有 ，重组质粒pCUP9K-GFP 上不需
要携带特殊抗性基因等充当标记基因，理由是 。
(2)培养工程菌的过程中，在接种环节要严格遵从无菌操作，如何确定接种操作达到无菌要
求? 。
(3)含pCUP9K-GFP 的毕赤酵母菌可以指示水体中铜离子的污染程度，理由是 。
用铬、镉和砷离子处理该工程菌的目的是 。
22、（2024·安徽马鞍山·三模）干扰素在体外保存相当困难，若将其分子上的一个半胱氨
酸替换为丝氨酸，则可延长保存时间。科研人员利用PCR 技术对干扰素基因进行定点突变。
他们通过实验先在试管A 中得到产物1，接着在试管B 中得到产物2（已定点突变的干扰
素基因），整个流程如下图。回答下列问题。
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(1)PCR 技术利用了 原理。实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须
进行高压蒸汽灭菌，目的是 。
(2)在PCR 反应体系中加入引物的作用是 。试管A 中要得到产物1 至少经过 次循
环。试管B 中所需的下游大引物为产物1 中的 链。
(3)为了使定点突变的干扰素基因能在哺乳动物乳腺细胞中特异性表达，在构建该基因表达
载体时应将该基因与 等调控元件重组在一起，然后将该表达载体通过 法导入哺
乳动物的受精卵中。
23、（2024·福建宁德·三模）猴痘是由猴痘病毒引起的一种人畜共患病。研究发现其F3L
蛋白可抑制宿主天然免疫。科研人员通过转基因技术，利用大肠杆菌表达F3L 蛋白，进行
猴痘病毒相关研究。
注：kanr为抗卡那霉素抗性基因；EcoRI、XhoI 为酶切位点
回答下列问题：
(1)PCR 扩增F3L 基因时，反应体系中添加的引物作用是 。
(2)将PCR 扩增得到的含F3L 基因的DNA 片段与质粒都经双酶切，再用 将两者连接，
构建F3L 基因表达载体。研究表明蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L 基因在大肠杆菌
中表达，推测其影响部位是图1 中 （填字母）。
(3)大肠杆菌用 处理，然后将基因表达载体导入其中，为筛选出导入重组质粒的大肠
杆菌，还需使用含有 的固体培养基。
(4)重组大肠杆菌在0.6mM IPTG 浓度下培养，探究不同的温度、培养时间的优化方案。将
其提取的蛋白质进行电泳，结果如图2，已知F3L 蛋白相对分子质量为24.6ku，请用方框
在图2-乙中标出其所在位置 ，从图中可推测出培养重组菌的最适条件为 。
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注：M 为已知相对分子质量标准；ku 为蛋白质相对分子质量
24、（2024·福建福州·三模）为研究编码铁运输相关蛋白的基因A（约963bp）在拟南芥缺
铁胁迫响应中的作用，需要构建超量表达A 的拟南芥转基因株系。质粒的结构如图2 所示。
回答下列问题。
(1)图1 中，过程①指的是从拟南芥中提取RNA，经 催化，合成cDNA；过
程②指的是以cDNA 为模板，通过PCR 扩增目的基因，需要在引物的 端，加
入限制酶 、 的识别序列。
(2)构建表达载体时，将PCR 产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片
段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA 连接酶进行连接，以避
免 。
(3)将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR 鉴定，如图3 所示，选择“1、2”号菌进行测序
的原因是 。
(4)将拟南芥的 直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并将
得到的种子接种在含有 （抗生素）的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目
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的基因的阳性植株。
(5)提取转基因及野生型植株的蛋白质进行电泳检测，如图4。若其中 号为转
基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A 的拟南芥转基因株系。
25、（2024·福建·三模）乳糖不耐受是机体乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳
中的乳糖所引起的非感染性腹泻。科学家采用基因工程技术将肠乳糖酶基因导入奶牛基因
组中，获得的转基因牛分泌的乳汁中乳糖含量大大降低，用到的质粒和目的基因的部分结
构如图1 和图2 所示，不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
限制酶
识别序列及切割位点
Hind
Ⅲ
A↓AGCTT
Sma I
CCC↓GGG
Kpn I
GGTAC↓C
Sal I
G↓TCGAC
Nhe I
G↓CTAGC
(1)用Sma I 切割图1 质粒后，能不能用E.Coli DNA 连接酶再将其连接起来？ 。在构
建基因表达载体时，与用一种限制酶切割相比，用切割后可以形成不同末端的两种限制酶
同时切割目的基因和质粒的优点是 。
(2)为了将图2 中的目的基因准确插入到图1 质粒中，需要在肠乳糖酶基因的两端分别添加
（填限制酶）的识别序列。为保证肠乳糖酶基因的正确复制和与质粒的正确连接，在设计
PCR 引物时，应在与β 链结合的引物的 （填“
”或“
”）端添加 （填限制
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酶）的识别序列。
(3)在构建基因表达载体时，肠乳糖酶基因应插入 之间。将含有肠乳糖酶基因的表达
载体导入受体细胞的常用方法是 ，受体细胞除了受精卵、胚胎干细胞外，还可以是
，受体细胞所含的性染色体必须是 。
(4)利用胚胎工程技术将导入目的基因的受体细胞培育成个体，采用分子杂交技术检测肠乳
糖酶基因在转基因奶牛中是否转录出mRNA 的大致思路为 。
26、（2024·福建漳州·三模）类胡萝卜素因众多营养保健功能而具有很高的商业价值与应
用前景。现研究人员通过构建含有β-胡萝卜素酮化酶基因bkt 的表达载体，转化莱茵衣藻
（一种真核绿藻）以提高其类胡萝卜素产量。请回答下列问题：
(1)为了同时保留衣藻内源性启动子H-R 及终止子RBCS2，应选用限制酶 对质粒
pUCBKT-P 和pH105 进行酶切，原因是 。再利用DNA 连接酶将酶切下的基因片段连
接成表达载体。
(2)可利用 （填技术）大量扩增bkt 基因，该技术需要在添加 离子的缓冲液中扩增
基因。若产物中除了目的基因外有其他DNA 片段存在，从引物角度考虑，原因可能是
。
(3)用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏
感浓度不同，所以要设计 的奇霉素进行实验，观察并确定 。
(4)以下是利用某两种限制酶进一步对提取的莱茵衣藻DNA 进行单酶切和双酶切后的电泳
结果。据此推测，提取的DNA 总长度是 bp，两种限制酶切割位点之间的最短距离是
bp。
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27、（2024·福建泉州·三模）洋桔梗是一种观赏价值高的花卉植物，易受真菌侵害而造成
经济损失。几丁质为多数真菌细胞壁主要成分，研究人员将菜豆几丁质酶基因（Chi）转入
洋桔梗中，以获得对抗真菌侵染的品种。请回答：
(1)获取目的基因。从序列数据库（GenBank）中查找Chi 序列后，还需从菜豆中提取 ，
根据 设计引物，通过PCR 获得目的基因。
(2)PCR 产物鉴定。将 PCR 扩增产物的序列与GenBank 中的 Chi 序列进行比较的目的是
。
(3)构建表达载体并导入农杆菌。利用 限制酶切割PCR 产物和质粒pB I 121，并连接成
表达载体 pB I 121-Chi（如图1）。将 pB I 121-Chi 转入农杆菌中，将转化产物涂于选择培
养基中进行筛选、培养。
(4)农杆菌转化洋桔梗愈伤组织。将洋桔梗愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡 10min，再将愈
伤组织放入含卡那霉素的培养基中筛选、培养。将得到的抗性无根苗转移到生根培养基中
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诱导生根，其中培养基中生长素用量和细胞分裂素用量的比值 （填“=”、“>”或
“<”）1。
(5)目的基因的检测及鉴定。
①选择pB I 121-Chi 中的npt Ⅱ进行分子水平的检测，以判断Chi 是否表达。原因是（Ⅰ）
洋桔梗细胞中存在与 Chi 序列相似的同源基因；（Ⅱ）pB Ⅰ 121-Chi 中的 np t Ⅱ和 Chi
在表达上是 。
②取未转化植株和能够正常生根的抗性转化植株新长出的幼嫩叶片，提取基因组 DNA，
进行PCR 检测，获得阳性植株。从 5 个生长良好的阳性植株提取 mRNA，进一步利用
PCR 检测，结果如图2.则应选择植株 （填序号）进行个体生物学水平鉴定即对这些植
株进行 ，以确定获得抗真菌洋桔梗植株。
28、（2024·江西南昌·三模）现有假单胞菌减毒活疫苗（Pp）和敲除了M 基因的缺陷型假
单胞菌减毒活疫苗（Pp－m），Pp 只能预防白点病，研究者欲将外源抗原基因导入到Pp 中
表达，以构建能预防多种疾病的多联疫苗。已知含抗性基因的质粒存在安全性风险，现为
获得无抗性基因但可通过其他方式达到筛选目的的质粒，并让该质粒携带抗原基因从而实
现对多联疫苗的研制。
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(1)图中是操作中使用的PBBR1 质粒（kan⁺为卡那霉素抗性基因，该质粒上只有BamHI 和
SacⅠ限制酶识别位点）和M 基因（M 基因为假单胞菌在不含氨基酸的普通培养基上合成谷
氨酸的必需基因），其中P1－P8为设计的引物；利用PCR 技术扩增M 基因，应选择
引物，利用PCR 技术扩增不含卡那霉素抗性基因的PBBR1 质粒并使其线性化时应选用
引物。
(2)图中右下方为供选择使用的限制酶及识别序列（箭头为限制酶的切割位点）。由于
PBBR1 质粒和M 基因两端都没有相同的限制酶识别序列，应在设计上述两对引物时增加两
种不同的限制酶识别序列，可选择 识别序列分别加在引物的5’端。
(3)利用上述PCR 产物经相同的两种限制酶酶切和连接，将连接产物导入 （填Pp 或Pp
－m）中，将转化产物接种在 培养基上，挑选出能在培养基上生长的单菌落。
(4)提取上述菌落中的质粒，为防止抗原基因与质粒的反向连接，利用 限制酶处理质粒
和抗原基因，将构建的重组质粒导入假单胞菌中以生产多联疫苗。
29、（2024·山东潍坊·三模）L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺（丙烯酰胺的前体），
而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某
科研机构欲利用pET22b 质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以
构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1 是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因
两侧的部分碱基序列，图2 是pET22b 质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的
LacZ 基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落
为白色。
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(1)利用PCR 从提取的DNA 中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是 。要
将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b 质粒中，需使用的两种限制酶是 。
(2)若图1 下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B 端的引物序列
是 （只写出16 个碱基即可）。
(3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青
霉素和X-gal 的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。
①若只使用限制酶EcoRI 构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现 色，这些菌
落 （填“能”、“不能”或“不一定能”）产生L-天冬酰胺酶，理由是
。
②若使用（1）中的限制酶处理，则菌落呈 色的为符合要求的宿主菌，理由是
。
(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4 个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只
能从大肠杆菌中提取到4 条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是
。
30、（2024 山东省齐鲁名校第三次联合检测）羟基酪醇具有抗癌、抗炎、保护软骨和抗骨
质疏松的作用，主要从橄榄植物的叶子和果实中提取，但提取周期长、回收率低。乙醇脱
氢酶 6（ADH6）是酿酒酵母利用甘油合成高产羟基酪醇过程中的关键酶。科研人员利用
基因工程技术将酿酒酵母的 ADH6 基因导入大肠杆菌中，以期获得高产羟基酯醇的转基
因大肠杆菌。
(1)科研人员利用 PCR 技术获得大量的酿酒酵母 ADH6 基因，用该技术扩增目的基因前
需要根据 来设计引物。PCR 每次循环一般可以分为 三步。
(2)利用含 ADH6 基因的 DNA 片段和质粒构建基因表达载体的过程中，应使用的酶主要
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有 。与天然质粒相比，作为载体的质粒的独特之处在于 。
(3)研究人员将构建的基因表达载体导入大肠杆菌，经筛选获得 5 株转基因大肠杆菌
（HJ17~HJ21）。导入基因表达载体前，需要用 Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 。
(4)为比较 5 株转基因大肠杆菌的羟基酪醇的产生情况，研究人员进行了相关实验，结果
如图。
由图可知，为提高羟基酪醇的生产效率，可选用 作为发酵生产的菌种，依据是 。
31、（2024·湖北·三模）人溶菌酶（HLZ）是一种具有抑菌活性的蛋白质，在食品保鲜、
抗菌消炎等方面广泛应用。为提高溶菌酶的产量，研究人员设计了利用基因工程高效生产
溶菌酶的方案，流程如图所示。
回答下列问题：
(1)溶菌酶能够破坏多种细菌的细胞壁，说明溶菌酶参与人体 （填“非特异性”或
“特异性”）免疫，理由是 。
(2)提取出的HLZ 基因不具备限制酶切割位点，利用PCR 技术对HLZ 基因进行扩增时，应
在所用两种引物的 端添加 识别序列，以实现HLZ 基因与pPIC9K 质粒的正向
连接。过程①中将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。
(3)过程④中，每隔一段时间取1mL 酵母发酵液，离心后取 （填“上清液”或“沉
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淀”）进行蛋白质凝胶电泳，得到结果如下图，已知HLZ 的理论分子量约为16ku。结果显
示本实验中HLZ 酵母表达体系初步构建成功，判断依据是 。如需进一步确认该蛋白
质为HLZ，可采取的措施为 。
注：M．蛋白Marker；1．空酵母培养48h；2．导入空质粒酵母培养48h；3～6．导入重组
质粒酵母分别培养24h、48h、76h、96h。
32、（2024·湖北襄阳·三模）丙肝病毒（HCV）是一种致病性强的单链RNA 病毒，主要侵
染肝细胞，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，也是肝硬化和肝癌的元凶之一。为研制丙
肝病毒的单克隆抗体，研究者以小鼠为实验材料设计了以下实验。回答下列问题。
(1)在HCV 感染的急性期，会引发机体的特异性免疫应答。在体液免疫过程中，B 细胞活化、
增殖分化过程需要两次信号刺激，一是抗原的直接刺激，二是 。B 细胞受到两个信号
的刺激后开始分裂、分化，大部分分化为浆细胞，浆细胞产生和分泌大量抗体发挥免疫效
应。抗体在浆细胞中合成、运输及分泌过程依次经历的结构是 。
(2)为使单细胞悬液中的B 淋巴细胞产生的抗体中一定含有能与丙肝病毒结合的抗体，需要
进行的操作是 ,图中筛选1 所采用的培养基从用途上分类，属于 培养基，使用该培
养基进行细胞培养的结果是 。
(3)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，α-干扰素在丙肝及部分肿瘤的治疗中有
一定疗效。科学家们采用基因工程技术将干扰素基因导入大肠杆菌生产干扰素。图1、图2
分别表示干扰素基因相关限制酶切割位点、质粒结构示意图。
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①为确保成功获得基因工程菌，图1 和图2 最好用 （填限制酶）切割。
②PCR 过程中延伸阶段选用72℃而非95℃，是综合考虑了两个因素，这两个因素分别是
。
③生产干扰素的工程菌可选用大肠杆菌或酵母菌，选用酵母菌作为受体细胞的优势是 。
33、（2024·湖南永州·三模）镰刀菌、立枯丝核菌引起的水稻（2n=24）立枯病和褐飞虱引
起的水稻虫害，常常造成水稻减产。某科研团队为培育抗褐飞虱、抗立枯病的水稻新品种，
以对褐飞虱不具有抗性的连粳11 号、龙粳39 号、荃优822 号三个纯合水稻品种为实验材
料，进行了相关实验。回答下列问题：
(1)为建立水稻基因组数据库，科学家须完成水稻 条染色体的DNA 测序。
(2)连粳11 号对镰刀菌表现为易感病，对立枯丝核菌表现为抗病，而龙粳39 号则相反。水
稻对镰刀菌和立枯丝核菌的抗性分别受非同源染色体上的A/a、B/b 基因控制。连粳11 号
和龙粳39 号杂交得到F1，F1自交得到F2，统计F2结果如下图所示。据图可知，连粳11 号
和龙粳39 号的基因型分别为 ，F2中对两种菌均具有抗性的个体占 。请简要写出简
便获得对两种菌均具有抗性的纯合子（标记为甲）方案 。
(3)该团队利用X 射线对荃优822 号水稻进行处理后，发现少数水稻（标记为乙）对褐飞虱
产生了较高抗性。其5 号染色体上某DNA 区段与高抗虫性相关，对荃优822 号的该区段设
计重叠引物，提取乙和荃优822 号的5 号染色体DNA 进行扩增，扩增产物的电泳结果如下
图所示：
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据图推测5 号染色体上第 对引物对应区间的基因（标记为N 基因）发生了碱基的
（填“增添”、“缺失”或“替换”）。
(4)研究者对N 基因进行分离和克隆，以其作为目的基因与Ti 质粒的 进行拼接，并运用
农杆菌转化的方法导入到水稻甲的叶肉细胞中，经 获得转基因植株（标记为丙），
(5)对丙进行扩大培养，发现有部分丙植株体细胞中含有2 个N 基因，让其自交后得到可以
稳定遗传的抗褐飞虱新品种丁。请参照图例在作答区域内标出丁植株细胞内N 基因在染色
体上可能的相对位置 （圆圈表示细胞，竖线表示染色体，圆点表示基因位点，字母表
示基因）。
34、（2024·湖南永州·三模）大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望
利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。科
研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，部分结构如下图。在人体
特定部位进行42℃处理后，p7 可在重组酶Bxb1 作用下翻转，免疫元件中的GFP 和aPD-
L1 两种基因可以成功表达。据此回答下列问题：
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(1)推测p7 应为 （填“启动子”或“终止子”），其功能是 。
(2)Tel42 为来自λ 噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子
pLac 可以使Tel42 持续性表达，当温度 （填“低于”、“等于”或“大于”）42℃时，
Tcl42 蛋白会抑制启动子pRL。
(3)质粒系统就像“基因电路”，其中的Tcl42 基因就像“开关”，能在加热时瞬时激活特
定基因。其核心基因包括重组酶Bxb1 基因、分泌型aPD-L1 蛋白基因（该蛋白可用于免疫
治疗）等。请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA 连接
酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路”→ →重组
酶Bxb1 基因不表达→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→ →解除Tcl42 蛋白对启动
子pRL 的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量aPD-L1。将下列选项代号填入
上述横线，将“基因电路”补充完整。
A．受体菌37℃时
B．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42 失去活性
C．荧光蛋白GFP 基因、aPD-L1 基因的转录
D．重组酶Bxb1 基因表达，进而引起p7 两侧发生重组
(4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是 。导入后
的菌体用 方法接种于含四环素的培养基上，由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌。
(5)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体
内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌可被FUS 处理激活，并具有肿瘤免疫治
疗效果。请以成瘤建模后的小鼠为材料，设计一个实验方案 。
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35、（2024·湖南衡阳市祁东县·三模）动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，
以便在实验室环境中进行有效的细胞培养。该系统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳
铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表达载体，然后将该重组载体导入奶牛体内以生
产人乳铁蛋白，相关过程如图所示。回答下列问题：
(1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。
①实验人员提取了相关mRNA，通过逆转录获取cDNA，再通过PCR 技术扩增人乳铁蛋白
基因。在整个过程中，需要用到的原料是 。
②实验人员利用PCR 技术扩增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA 聚合酶，而不能
使用普通的DNA 聚合酶，其原因是 。
(2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI 及其酶切位点，TetR表示四环素抗性基因，
AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两
种限制酶是 ，同时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和 之间。
(3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植
到代孕牛体内。此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为 。
(4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C 三头转
基因牛的乳汁，从中提取了蛋白质，结果发现A、C 两头转基因牛提取的乳汁中未检测到
人乳铁蛋白，而B 转基因牛提取的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。该检测方法的原理是
。进一步提取A、C 两头转基因牛的基因组DNA 和mRNA 进行检测，A 转基因牛能检测到
人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C 转基因牛则都不能检测到。以上两次检测
结果说明了 。
36、（2024·广东茂名·三模）在DNA 体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达
载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛
选方法，该方法实施的前提条件是载体DNA 上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA 和
pBR322 质粒构建基因表达载体，然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图
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1、2 所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。回答下列问
题：
(1)已知限制酶PstI 和BamHI 识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构
建重组质粒，图1 中，若使用限制酶PstI 切割外源DNA 片段，则切割pBR322 应该选择限
制酶 （填“PstI 或”“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是 。
(2)在某次实际操作中，实验人员将外源DNA 片段插入pBR322 的BamHI 切割位点处，构
建了重组质粒，然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图
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2 所示的实验。
①结合图2 阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是 。该培养基中添
加了氨苄青霉素（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源
DNA 的重组质粒，这是由于 。
②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使
之定位沾上菌落印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，
如图2 阶段二实验所示。导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含 （填
“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是 。
37、（2024·广东·三模）某两性花植物花小不易进行杂交育种工作。已知雄性可育基因对
雄性不育基因为显性。某科研团队利用基因工程将育性恢复基因A、花粉致死基因B、绿
色荧光蛋白基因C 连锁成为一个A-B-C 基因并导入雄性不育个体的一条染色体上，获得育
性恢复植株甲。雄性不育植株雄蕊发育不正常，但雌蕊正常。使用无缝克隆技术可将A、
B、C 基因连接成DNA 片段，其机理如图。回答下列问题：
(1)基因工程需要使用的工具酶有 ，后者主要是连接DNA 片段之间的磷酸二酯键。
与用单酶切割目的基因与载体相比，双酶切割法的优点是 。
(2)无缝克隆时，T5 核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，其目的是 。与传统的
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酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有 （写出2 点即可）。
(3)甲植株自交得F1，F1中雄性不育植株所占比例为 。
(4)假设雄性可育植株与育性恢复植株、不育植株可区分。请利用雄性可育纯合植株、甲植
株和荧光检测仪，设计杂交实验，探究导入的A-B-C 基因是否与雄性不育基因在同一条染
色体上（不考虑互换，不用具体描述荧光检测过程）。实验设计方案：甲植株作为母本与
雄性可育纯合植株杂交，F1中通过荧光检测仪检测并选取有荧光的雄性可育植株进行自交，
观察并统计F2中的表型及比例。预期结果：①若有荧光雄性可育植株：有荧光育性恢复植
株：无荧光雄性可育植株：无荧光雄性不育植株的比例为3：1：3：1，则 ；②
若 。
38、（2024·海南·琼海市嘉积中学高三三模）研究人员利用一种从某生物体内分离出的抗
盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出了抗盐碱大豆，使大豆
能在盐碱地中正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①~⑥为不同过程，
其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，AluⅠ、SmaⅠ、HindⅢ和PstⅠ为限制酶。根据所学知识，
回答下列问题：
(1)不用限制酶AluⅠ切割抗盐碱基因的原因是 。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，
选择SmaⅠ和PstⅠ比只选择PstⅠ的优点是 （答出两点）。
(2)研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb 的DNA 片段，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb 的
DNA 片段；SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb 的DNA 片段（注意：DNA 片段大小
与图中所画比例一致），则抗盐碱基因的长度为 。
(3)利用PCR 技术可获取大量目的基因，PCR 反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合
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到互补DNA 链上，对两种引物的设计要求之一是 ；除引物外，PCR 反应体系中还需
要加入 （答出两点）。
(4)将目的基因导入植物细胞时，常采用农杆菌转化法，将目的基因插入Ti 质粒中。利用Ti
质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈伤组织细胞的理论依据是 。
(5)为了筛选出成功导入重组质粒的农杆菌，1 号培养基中需要加入的物质是 。诱导组
织细胞脱分化的是 号培养基。图中④⑤⑥过程，所利用的生物技术的理论基础是
。
39、（2024·广西玉林·三模）Ti 质粒上有vir 区和T-DNA 区，vir 区决定T-DNA 的转移。研
究人员将vir 区和T-DNA 区分离，开发了包括微型Ti 质粒和辅助Ti 质粒的双元载体系统。
利用该系统，将抗草甘膦基因（cp）导入大豆中，培育抗除草剂（草甘膦）的转基因大豆。
回答下列问题：
(1)双酶切可将cp 基因以正确方向插入微型Ti 质粒。已知cp 基因的a 链为转录的模板链，
则引物1 和引物2 的5'端应分别加入 酶和 酶的酶切位点。
(2)目的基因表达载体过大时难以操作，转化效率较低。研究人员在构建微型Ti 质粒时删除
了生长素基因和细胞分裂素基因，这样做的优点是 （答出2 点）。T-
DNA 从农杆菌转移到植物细胞中时始于右边界止于左边界，在T-DNA 的转移过程中会出
现不完整转移现象，若以绿色荧光蛋白基因（GFP）作报告基因研究T-DNA 的转移，则
GFP 应构建在紧临 （填“左”或“右”）边界的位置。
(3)将微型Ti 质粒上重组了cp 基因的农杆菌与含辅助Ti 质粒的农杆菌混合，一定温度下保
温一段时间，得到含双元载体的农杆菌。在含双元载体的农杆菌中，辅助Ti 质粒的作用是
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。
(4)用含有cp 基因表达载体的农杆菌侵染大豆愈伤组织，筛选出转cp 基因的愈伤组织。诱
导愈伤组织形成试管苗的过程，在植物组织培养中叫 阶段。此阶段需要更换新的
培养基，是因为 。
40、（2024·广西柳州·三模）γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、治疗神经损伤、生产可降
解材料等方面有广泛应用，高效制备GABA 是目前国内外的研究热点。科研人员运用基因
工程技术构建重组表达载体（如图所示），将其成功导入大肠杆菌获得能生产GABA 的工
程菌。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA。请回答下
列问题：
(1)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是 。该菌利用目的基因
表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA，表明基因与性状的关系是 。
(2)由图可知，步骤①用于切割质粒的限制酶是 ，这在实践中的优势是 。
(3)在进行步骤②之前，需对gadB 基因进行扩增以提高获得重组质粒的概率。现在常用的
快速扩增技术是PCR，扩增过程使用的DNA 聚合酶具有的特点是 ，扩增过程中的使用
的引物 （填“可”或“不可”）重复利用。
(4)为筛选出含重组质粒的大肠杆菌，应在添加 的选择培养基上培养；培养后获得的菌
落却不能判定是否含有重组质粒，理由是 。进一步检测成功转化的GABA 高产大肠杆
菌，可通过检测 获得（写出2 个检测指标）。
41、（2024·贵州毕节·三模）二十碳五烯酸（EPA）能促进体内饱和脂肪酸代谢，是人体自
身不能直接从头合成但又不可缺少的营养物质。研究人员利用转基因技术从海洋细菌中提
取了EPA 合成途径的关键基因pfaB，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。请
回答下列问题：
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(1)利用PCR 技术扩增pfaB 基因时，需要选用图1 中的引物 （填序号），引物的作
用是 。
(2)图2 所示的两种引物中，引物 设计不合理。若将pfaB 基因扩增n 次，共需要引物
个。
(3)构建基因表达载体时，为使pfaB 基因成功表达，应将其插入载体的 之间。
42、（2024·贵州·三模）在植物基因工程中外源基因表达量不足是目前利用转基因植物生
产植物疫苗时存在的问题之一。研究表明，启动子的串联能增强外源基因的表达，研究人
员拟构建含有两个35s 启动子（35s 启动子是花椰菜花叶病毒的一种强启动子）串联的转基
因苜蓿。一个35s 启动子包括1 个A 区和2 个B 区。图甲表示35s 启动子及其附近区域分
布的限制酶识别位点，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。图乙表示待转入
第二个35s 启动子的重组质粒的构成组件及其上的限制酶识别位点。
(1)利用PCR 技术可以扩增35s 启动子，PCR 技术的原理是 ，此技术设计引物很关键，
引物是 。利用此技术扩增的35s 启动子可以在PCR 扩增仪中自动完成，完成以后，常
采用 来鉴定PCR 的产物。
(2)根据限制酶识别位点，为了让第二个35s 启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选
择 限制酶切割图甲的DNA 片段。
(3)为了筛选出正确串联了两个35s 启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素
的平板进行筛选，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是 、 ，得到①②③三类菌落，
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其生长状况如下表（+代表生长，-表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是
（填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，
可以说明串联两个35s 启动子能 。
平板类型
①
②
③
甲：无抗生素
+
+
+
乙：卡那霉素
-
-
+
丙：？
-
+
+
丁：？
-
-
+
43、（2024·甘肃张掖·三模）γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、治疗神经损伤、生产可降
解材料等方面有广泛应用，高效制备GABA 是目前国内外的研究热点。科研人员运用基因
工程技术构建重组表达载体（如图所示），将其成功导入大肠杆菌获得能生产GABA 的工
程菌。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA。回答下列
问题。
(1)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是 。
(2)由图可知，步骤①用于切割质粒的限制酶是 ，这在实践中的优势是
。
(3)在进行步骤②之前，需对gadB 基因进行PCR 扩增以提高获得重组质粒的概率，需加入
种引物和 酶，扩增过程中使用的引物 （填“可”或“不可”）重复
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利用。
(4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培
养基筛选出转基因工程菌。
(5)将成功转化的大肠杆菌进行发酵培养，发酵罐内的原料应富含 ，酸碱度要求
是调至 。一段时间后，检测GABA 的含量。
44、（2024·甘肃白银·三模）随着抗生素需求的增加，利用基因工程从微生物中获得抗生
素已成为生产抗生素的一种重要途径。某实验室欲利用大肠杆菌获得抗体，图1 表示该抗
体基因及部分碱基序列，图2 表示质粒及限制酶的切割位点，图3 表示不同限制酶的识别
序列，其中AmpR、KanR分别为氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。回答下列问题：
(1)限制酶作用于DNA 分子的 键，其切割DNA 后可产生 和平末端。
(2)将图1 中抗体基因与图2 中质粒结合的过程称为 ，结合过程中使用的限制酶是 。
将目的基因导入受体细胞后，可在培养基中加入 （填“氨苄青霉素”或“卡那霉素”）
对目的细胞进行筛选。
(3)与从实验室常用小鼠中获得的抗体不同，从大肠杆菌中获得的抗体在结构上较为简单，
原因最可能是 。
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