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专题43 基因工程
一、重组DNA 技术的基本工具
1.基因工程的概念
2．限制性内切核酸酶
(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)作用：识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二
酯键。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。
3．DNA 连接酶
种类
E.coli DNA 连接酶
T4 DNA 连接酶
来源
大肠杆菌
T4 噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，连接两个DNA 片段
4.限制酶和DNA 连接酶的关系
(1)限制酶和DNA 连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA 的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA 连接酶起作用时，不需要模板。
5．基因进入受体细胞的载体
作用
携带外源DNA 片段进入受体细胞
种类
质粒、噬菌体、动植物病毒等
条件
能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因
6.DNA 的粗提取与鉴定
(1)实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理
1
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或化学方法对它们进行提取。
①DNA 不溶于酒精。
②DNA 在不同浓度的NaCl
溶液
中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的NaCl 溶液。
③在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)实验流程
二、基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)获取目的基因的方法
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
②利用PCR 获取和扩增目的基因。
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
3．将目的基因导入受体细胞
(1)导入方法
项目
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、
花粉管通道法
显微注射技术
Ca
2 ＋ 处理法
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
2
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(2)农杆菌转化法
①转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。侵染时将Ti 质
粒上的T DNA
转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA 上。
4．目的基因的检测与鉴定
项目
步骤
检测内容
方法
分子水平
的检测
第一步
转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因
PCR 技术
第二步
目的基因是否转录出了
mRNA 技术
第三步
目的基因是否翻译出了蛋白质
抗原—抗体
杂交技术
个体生物
学水平的
鉴定
抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度
5．DNA 片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验原理
①DNA 扩增：利用PCR 可以在体外进行DNA 片段的扩增。
②电泳鉴定：DNA 分子在一定的pH 下，可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，DNA 向着与
它所带电荷相反的电极移动。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶中的DNA 分子通过染色，
可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。
(2)实验步骤
①DNA 片段的扩增
②DNA 片段电泳鉴定的基本过程
三、基因工程的应用
3
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1.基因工程在农牧业方面的应用
(1)转基因抗虫植物；(2)转基因抗病植物；(3)转基因抗除草剂植物；(4)改良植物的品质；(5)提高动物
的生长速率；(6)改善畜产品的品质。
2．基因工程在医药卫生领域的应用
(1)对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物。基因工程药物主要包括细胞因子、
抗体、疫苗和激素等。
(2)让哺乳动物批量生产药物，如乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
(3)可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。
3．在食品工业方面的应用：利用工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
四、蛋白质工程的原理和应用
1.概念
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，
或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．蛋白质工程的基本原理
(1)基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，而蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能
的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
(2)基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改
变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
3．蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面：利用蛋白质工程研发药物。
(2)其他工业方面：被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面：科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加粮食
产量。
五、生物技术的安全性与伦理问题
1．对转基因产品安全性的争论
(1)基因工程对原本是自然造就的生命形式进行了人为改造，使之具有了全新特征。
(2)人们所生活的国家或社会的政治制度、意识形态、宗教信仰、经济发展水平、历史背景、传统文化
和伦理道德观念等的差异，决定了人们具有不同的价值观取向。
2．理性看待转基因技术
(1)以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
(2)应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
(3)要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(4)我国对转基因技术的方针是研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上
要严格，坚持依法监管。
3．生殖性克隆人面临的伦理问题
生殖性克隆与治
疗性克隆
①生殖性克隆：指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
②治疗性克隆：指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用来修
4
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复或替代受损的细胞、组织和器官，达到治疗疾病的目的
生殖性克隆人面
临的伦理问题
①生殖性克隆人“有违人类尊严”。②生殖性克隆人是人为地制造在心
理上和社会地位上都不健全的人。③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人
会面临流产、死胎和畸形儿等问题
4.我国禁止生殖性克隆人
(1)对生殖性克隆人的实验研究，我国政府的四原则是：不赞成、不允许、不支持、不接受。
(2)对治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张进行有效监控和严格审查。
5．生物武器的种类
包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
6．我国对生物武器的态度
我国政府支持《禁止生物武器公约》的宗旨和目标，全面、严格履行公约义务，并主张全面禁止和彻
底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
一、单选题
1．科学家利用PCR 技术扩增人乳头瘤病毒HPV-16L1 基因，构建了含HPV-16L1 基因的表达载体pBI-L1，
经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度
较高的HPV-16L1 蛋白。下列说法错误的是（ ）
A．利用PCR 扩增HPV-16L1 基因的前提是已知该基因的一段碱基序列
B．构建表达载体pBI-L1 时可使用两种不同限制酶以确保正确连接
C．必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因
D．可以用抗原一抗体杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1 蛋白
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR
技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细
胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检
测与鉴定：1、分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技
术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体
杂交技术。2、个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、利用PCR 扩增HPV-16L1 基因的前提是已知该基因的一段碱基序列，根据该序列制作引物，
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A 正确；
B、用两种不同限制酶，可保证目的基因和载体定向连接，且不发生自身环化，B 正确；
C、除选用烟草的受精卵作为受体细胞外，也可选用烟草的根尖分生区细胞作为受体细胞，然后通过植物
组织培养使每个细胞中均含有目的基因，C 错误；
D、分子水平对目的基因进行检测，可根据抗原抗体杂交技术检测相应蛋白质，D 正确。
故选C。
2．以下关于农杆菌转化法的叙述错误的是（ ）
A．若用Ti 质粒作载体，目的基因的插入位置应该在T－DNA 片段内
B．将重组Ti 质粒导入农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌
C．农杆菌能将重组Ti 质粒转移到被侵染的植物细胞内，并将其整合到染色体上
D．能在植物细胞中检测到目的基因，还不能说明转化成功
【答案】C
【分析】农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。根据
农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti 质粒的T-DNA 上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的
基因整合到植物细胞中染色体的DNA 上。
【详解】A、若用Ti 质粒作为载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA 片段内，这样可以保证目的基因随
T-DNA 整合到受体细胞的染色体DNA 上，A 正确；
B、将重组Ti 质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中的
DNA 分子的生理状态，B 正确；
C、农杆菌能将重组Ti 质粒中的T-DNA 转移到被侵染的植物细胞内，并将其整合到染色体上，C 错误；
D、目的基因成功导入还不能说明该基因工程项目获得成功，只有转基因植株具有相关的特性才能说明基
因工程项目获得成功，D 正确。
故选C。
3．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由正确的是（ ）
A．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．对宿主细胞无伤害，以便于重组 DNA 的筛选
D．能在宿主细胞中稳定保存并复制，以便产生大量的目的基因
【答案】D
【分析】1.常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2.为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点，以便于目的基因的插入； ②要有标记基因（如
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抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞
无害，而且要易从供体细胞分离出来。
【详解】A、作为运载体必须具备的条件之一是具有某些标记基因，以便于重组后进行重组子的筛选，A
错误；
B、作为运载体必须具备的条件之一是具有多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，B 错误；
C、对宿主细胞无伤害，便于目的基因能在宿主细胞中稳定存在和表达，C 错误；
D、作为运载体必须具备的条件之一是能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目
的基因，D 正确。
故选D。
4．CAR-T 细胞疗法是通过设计CAR 基因，并导入癌症患者的T 细胞中，使其转化为CAR-T 细胞，CAR-
T 细胞膜上的CAR 蛋白与癌细胞表面抗原特异性结合后，可激活CAR-T 细胞使其增殖、分化，从而实现
对癌细胞的特异性杀伤和记忆，主要过程如下图。下列叙述正确的是（ ）
A．CAR 基因缺少启动子，进行过程②有利于实现其在T 细胞中的复制和表达
B．CAR 蛋白的胞外结合区相当于抗原-MHC 复合体，可与癌细胞特异性结合
C．CAR-T 细胞经过程④形成的效应细胞能准确识别癌细胞并引发癌细胞凋亡
D．CAR-T 细胞因在体内可以增殖分化，故在体外转化完成后无需扩大培养即能使用
【答案】C
【分析】题图分析：过程①是体外合成CAR 基因的过程，需要限制酶将三个片段切割得到互补的黏性末
端，再用DNA 连接酶将其连接；过程②基因表达载体的构建；过程③是将重组质粒转入受体细胞（患者
T 细胞）的过程。
【详解】A、CAR 基因缺少启动子，无法在T 细胞中转录，故过程②在导入T 细胞前完成，有利于实现其
在T 细胞中表达，A 错误；
B、CAR 蛋白的胞外结合区相当于抗体-MHC 复合体，可与癌细胞特异性结合，进而实现对癌细胞的攻击，
B 错误；
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C、CAR-T 细胞经过CAR 蛋白的作用接受癌细胞的信息后，会增殖分化成效应细胞进而能准确识别癌细胞
并引发癌细胞凋亡，C 正确；
D、CAR-T 细胞体内可以增殖分化，但在体外转化完成后依然需扩大培养才能使用，D 错误。
故选C。
5．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR)、四环素抗性基因（TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有
目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒），并导入受体菌中。
根据题目所提供的信息，下列叙述正确的是（ ）
A．若用ScaI 酶切质粒，所得产物经凝胶电泳可形成3 个条带
B．若用HindIII 和ScaI 酶切，一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C．若用PvuI 酶切，在含四环素培养基中形成的菌落，一定含有目的基因
D．若用SphI 酶切，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落，再影印接种到
含氨苄青霉素的培养基中
【答案】A
【分析】题图分析，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有ScaⅠ和PvuⅠ的酶切位点，四环素抗性基因
（TetR）内含有HindⅢ、SphⅠ和SalⅠ的酶切位点。
【详解】A、若用ScaI 酶切质粒，由于图示质粒中有两个酶切位点，因而能得到三种DNA 片段，即完整
的片段和两个短片段，所得产物经凝胶电泳可形成3 个条带，A 正确；
B、若用HindIII 和ScaI 酶切，由于质粒中有两个ScaI 酶的切割位点，因而不一定能防止目的基因与质粒的
反向连接，B 错误；
C、若用PvuI 酶切，则会破坏氨苄青霉素抗性基因，则重组质粒中只有四环素抗性基因，因此成功导入重
组质粒的受体细胞具有对四环素的抗性，同时若导入的是空质粒，则受体细胞依然也具有对四环素的抗性，
进而可推测，在含四环素培养基中形成的菌落，不一定含有目的基因，C 错误；
D、若用SphⅠ酶切，则会破坏四环素抗性基因（TetR），氨苄青霉素抗性基因（AmpR）不受影响，则重
组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养
基中能形成菌落，在含Tet 的培养基中不能形成菌落，因此，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含氨苄
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青霉素的培养基中长成菌落，再影印接种到含四环素的培养基中，则只在含氨苄青霉素的培养基上生长的
菌落即为目的菌，D 错误。
故选A。
6．人们对转基因生物安全性的关注，随着转基因成果的不断涌现而与日俱增。下列有关转基因成果的叙
述，错误的是（ ）
A．对微生物的基因改造是基因工程取得实际应用成果最多的领域
B．利用转基因小鼠Ⅰ型糖尿病模型可以模拟该病的发生和发展过程
C．啤酒酵母双乙酰浓度过高会影响啤酒的风味和口感，利用转基因工程菌可以减少它的生成
D．种植的转基因作物中大豆和棉花最多，其次是玉米和油菜
【答案】D
【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样
性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)。对待转基因技术的利弊，正确的做法应该是趋利避害，
不能因噎废食。
【详解】A、微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感、容易进行遗传物质操
作等优点，对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域，A 正确；
B、利用转基因小鼠Ⅰ型糖尿病模型可以模拟该病的发生和发展过程，属于基因工程的应用，B 正确；
C、啤酒酵母双乙酰浓度过高会影响啤酒的风味和口感，利用转基因工程菌可以减少它的生成，缩短啤酒
的发酵周期，属于基因工程的应用，C 正确；
D、种植的转基因作物中大豆和玉米最多，其次是棉花和油菜，D 错误。
故选D。
7．乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒
酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙
酯高产菌株，该过程如下图所示。下列关于该过程的分析不合理的是（ ）
A．转入的L-PG 基因表达产物不能影响酿酒酵母活性
B．可以利用PCR 技术筛选含有L-PG 基因的受体细胞
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C．L-PG 基因可在乳酸乙酯高产菌株体内复制与表达
D．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
【答案】D
【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（ PD ）替换为植物
乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），从而获得乳酸乙酯高产菌株的过程。
【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存或活性，因此转入的L-PG 基因表达产物不能影响
酿酒酵母活性，A 正确；
B、PCR 技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG 基因的受体细
胞，B 正确；
C、L-PG 基因是目的基因，目的基因可在受体细胞内复制和表达，因此L-PG 基因可在乳酸乙酯高产菌株
体内复制与表达，C 正确；
D、标记基因Ampr 可筛选含有目的基因的受体细胞，对重组质粒进行初步筛选，但不能检测是否成功构
建乳酸乙酯高产菌株，D 错误。
故选D。
8．图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（ ）
A．若通过PCR 获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2+转化法
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
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目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因：DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻
译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、引物是根据目的基因两侧序列获得，需要与目的基因两端互补，故若通过PCR 技术大量扩增
该目的基因，应该选用引物甲和引物丙，A 正确；
B、图甲中BamHⅠ会破坏两种抗性基因，不能选用，故图乙中目的基因左侧只能选BclⅠ，而质粒上没有目
的基因右侧Sau3A 的切点，两者都有Hind Ⅲ的切点，为了防止目的基因与质粒随意连接，故质粒和目的
基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切，B 正确；
C、若将基因表达载体导入受体细胞大肠杆菌时，需用钙离子等处理，使其处于易于吸收外源DNA 的状态，
C 正确；
D、在受体细胞中，插入目的基因时氨苄青霉素抗性基因被破坏，不能和目的基因同时表达，D 错误。
故选D。
9．若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性内切核
酸酶的酶切位点分别是BglⅡ（－A↓GATCT－），EcoRⅠ（－G↓AATTC－）和Sau3AⅠ（－↓GATC－）。
下列分析合理的是（ ）
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1 噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRI 切割目的基因和P1 噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1 噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1 噬菌体载体
【答案】D
【分析】限制酶选择原则：
（1）应选择切点位于目的基因两端的，不能位于目的基因内部，防止破坏目的基因，同时为避免目的基
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因和质粒自身环化或随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
（2）根据质粒特点确定限制酶种类具体原则：
①保证切割的黏性末端与目的基因的相同，以便两者能够连接。
②保证切割后的质粒至少保留一个标记基因，以便进行筛选；保留复制原点，以便在受体细胞中维持稳定
和表达。
【详解】A、用EcoRⅠ切割目的基因和P1 质粒载体，产生相同的黏性末端，用DNA 连接酶连接时可能会
发生反向连接，A 错误；
B、用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1 质粒载体，这与A 选项中仅用EcoRⅠ切割一样，B 错误；
C、用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1 质粒载体，会产生相同的黏性末端，可能会发生反向连接，C 错
误；
D、只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1 质粒载体，产生不同的黏性末端，防止发生反向连接，且
这样目的基因插入运载体后，RNA 聚合酶的移动方向与图丙实线方向相同，D 正确。
故选D。
10．野生型的λ 噬菌体具有DNA 分子量大、限制酶切割位点过多等特点，但经人工改造后可作为载体将
目的基因导入大肠杆菌。下列相关说法正确的是（ ）
A．改造λ 噬菌体时，需除去其全部的限制酶切割位点
B．转化前必须用Ca2﹢将大肠杆菌处理成能吸收外源DNA 的生理状态
C．λ 噬菌体载体可自我复制并含有标记基因
D．人工改造λ 噬菌体是获取转基因大肠杆菌的核心工作
【答案】C
【分析】基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸
之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA 连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【详解】A、λ 噬菌体用作运载体时，应保留至少一个限制酶的切割位点，A 错误；
B、将目的基因导入微生物细胞需要采用感受态细胞法，该过程常用Ca2﹢进行处理，而λ 噬菌体作为载体
将目的基因导入大肠杆菌，不需要用Ca2﹢处理，B 错误；
C、λ 噬菌体载体可自我复制并含有标记基因，标记基因便于重组质粒的筛选，C 正确；
D、基因工程的核心是基因表达载体的构建，D 错误。
故选C
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11．用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA 片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。
下列关于电泳技术叙述错误的是（ ）
A．电泳是指带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程
B．泳道①、②分别是用XhoⅠ、SalⅠ处理得到的产物
C．若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA 片段后电泳，其泳道可能只有5 个条带
D．电泳技术可以用于亲子鉴定、生物间亲缘关系鉴定
【答案】B
【分析】分析题图：限制酶SalⅠ有三处切割位点，切割后产生4 个DNA 片段，泳道①中是用SalⅠ处理得
到的酶切产物；限制酶XhoⅠ有2 处切割位点，切割后产生3 个DNA 片段，泳道②中是用XhoⅠ处理得到的
酶切产物。
【详解】A、电泳是指带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程，A 正确；
B、限制酶SalⅠ有三处切割位点，切割后产生4 个DNA 片段，泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物，限
制酶XhoⅠ有2 处切割位点，切割后产生3 个DNA 片段，泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物，B 错误；
C、限制酶SalⅠ有三处切割位点，切割后产生4 个DNA 片段，限制酶XhoⅠ有2 处切割位点，切割后产生3
个DNA 片段，结合题图可知，若用XhoI 和SalI 两种酶同时处理该DNA 片段后电泳，可能存在相同长度
的DNA 片段，其泳道可能只有5 条，C 正确；
D、不同生物的DNA 切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴
定，D 正确。
故选B。
12．苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry 具有杀虫毒性，但Cry 蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，
制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry 蛋白第168 位的组氨酸替换为精氨酸
后，Cry 蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3 倍；将Cry 蛋白第282 位、第283 位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成
甘氨酸和丝氨酸后，Cry 蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7 倍。下列有关叙述错误的是（ ）
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A．对Cry 蛋白的改造是通过改造Cry 蛋白的相关基因来实现的
B．Cry 蛋白的毒性提高了3~7 倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构
C．改造Cry 蛋白应从Cry 蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构
D．使用蛋白质工程改造Cry 蛋白过程中需要使用限制酶和DNA 连接酶
【答案】C
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，
来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成
基因，来改造现有蛋白质，对Cry 蛋白的改造是通过改造Cry 蛋白的相关基因来实现的，A 正确；
B、蛋白质的结构决定功能，Cry 蛋白的毒性提高了3~7 倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构，B 正
确；
C、改造Cry 蛋白应从Cry 蛋白的结构和功能出发设计其特有的结构，并改造或合成相关基因，C 错误；
D、蛋白质工程的基础是基因工程，需要改造或合成相关的基因，故使用蛋白质工程改造Cry 蛋白过程中
需要使用限制酶和DNA 连接酶，D 正确。
故选C。
13．下列关于PCR 的叙述，错误的是（ ）
A．PCR 只能扩增引物之间的DNA 片段而非整个完整的模板DNA 分子
B．PCR 过程中变性的目的是让引物与模板DNA 单链结合
C．PCR 的原理是DNA 半保留复制
D．PCR 的过程需要耐高温的DNA 聚合酶但不需要解旋酶
【答案】B
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。其原理是DNA
复制。该技术的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。需要的条件为：模板
DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）。
过程：①高温变性：DNA 解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
【详解】A、DNA 聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA 序列，而非整个完整的模板DNA 分
子，A 正确；
B、变性的目的是破坏DNA 分子内碱基对之间的氢键，打开双链DNA 模板，在PCR 过程中通过高温处理
实现，B 错误；
C、PCR 技术依据的原理是DNA 的半保留复制，C 正确；
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D、PCR 的第一步是加热高温DNA 变性，也就是DNA 的解旋，因为有高温破坏氢键，所以无须解旋酶的
参与，复性过程中引物与DNA 模板链的结合依靠碱基互补配对原则，在DNA 聚合酶的催化作用下完成，
D 正确。
故选B。
14．新冠病毒通过表面刺突蛋白（S 蛋白）的活性域（RBD）与人体细胞表面的ACE2 受体相互作用感染
细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S 蛋白的RBD 紧密结合，以干扰新冠病毒
的感染。下列叙述不合理的是（ ）
A．生产LCB1 用到了基因工程的操作技术
B．可直接从细胞中获取基因用于LCB1 的生产
C．LCB1 的结构可能与S 蛋白的抗体有相似之处
D．S 蛋白的RBD 结构可以为设计LCB1 提供信息
【答案】B
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基
因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
2、蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。
3、蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。
4、基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应
的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径。
【详解】A、生产LCB1 用到了蛋白质工程，其中一些步骤用到了基因工程的操作技术，例如人工合成
DNA，A 正确；
B、由题意可知蛋白质LCB1 是一种自然界中不存在的蛋白质，故不能从细胞中获取相应的基因，B 错误；
C、S 蛋白的抗体能与S 蛋白RBD 特异性结合，而根据题干可知：LCB1 可与S 蛋白RBD 紧密结合，说明
LCB1 的结构可能与S 蛋白的抗体类似，C 正确；
D、由于LCB1 可与S 蛋白RBD 紧密结合，故LCB1 可依据S 蛋白的RBD 结构进行设计，D 正确。
故选B。
15．新冠病毒是一种RNA 病毒，极易产生变异，其通过表面刺突蛋白（S 蛋白）的受体结合域（RBD）与
人体细胞表面的ACE2 受体相互作用而感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可
与S 蛋白RBD 紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列有关说法错误的是（ ）
A．LCB1 的作用效应与抗S 蛋白抗体类似
B．LCB1 可以通过细胞中原有的基因表达产生
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C．LCB1 的设计和合成遵循中心法则
D．LCB1 的设计和合成是通过蛋白质工程实现的
【答案】B
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合
成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程能够
生产自然界中不存在的蛋白质。
【详解】A、LCB1 能S 蛋白结合，干扰新冠病毒对人体细胞的感染，说明其作用与抗体类似，A 正确；
B、LCB1 是人工设计并合成的一种自然界不存在的蛋白质，故LCB1 并不是通过细胞中原有的基因表达产
生的，B 错误；
C、LCB1 的设计和合成属于蛋白质工程，遵循中心法则，C 正确；
D、基因工程只能合成自然界已经存在的蛋白质，而LCB1 蛋白药物是自然界不存在的，是通过蛋白质工
程设计和合成的，D 正确。
故选B。
16．某二倍体动物种群有100 个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基
因A1、A2、A3进行PCR 扩增，凝胶电泳及统计结果如图所示。该种群中A1的基因频率是（ ）
A．52%
B．27%
C．32%
D．2%
【答案】C
【分析】基因频率是指在一个种群基因库中，某个基因占全部等位基因数的比率。群体中某一特定基因的
频率可以从基因型频率来推算。
【详解】据图可知，该动物种群中基因型为A3A3 的有2 个，A2A2 的有8 个，A1A1 的有9 个，A1A3 的
有15 个，A1A2 的有31 个，A2A3 的有35 个，A1 的基因数为2×9+15+31=64，则种群中A1 的基因频率为
64÷200×100%=32%，C 正确，ABD 错误。
故选C。
17．某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图
甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子
小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩增，PCR 产物电泳
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结果如图乙所示。
下列叙述错误的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子可以控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．4 号条带的小鼠是野生型，2 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】D
【分析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA
复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在编码区的左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录
后，可以在Gata3 基因转录后，使GFP 基因转录，Gata3 基因的启动子也能控制GFP 基因的表达，A 正确；
B、基因的转录和翻译均是从5′→3′，因启动子在左侧，转录和翻译方向均为从左向右，Gata3 蛋白在GFP
蛋白的左侧，所以翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只有
小片段，是野生型，C 正确；
D、若用引物1 和引物3 进行PCR，杂合子和Gata3-GFP 基因纯合子都能扩增出相应的片段则不能区分杂
合子和纯合子，D 错误。
故选D。
18．研究人员通过PCR 扩增质粒PDNR-LIB 中的sacB 基因，该基因的产物对蔗糖敏感，是一种常见的反
选择标记基因。tetA 是四环素抗性基因，利用基因工程将sacB 基因插入到质粒pAH162 上，构建含有tetA-
sacB 双重选择系统的重组质粒，即pAH162-sacB，具体过程如下图所示。将pAH162-sacB 导入大肠杆菌验
证其双重选择作用。下列分析错误的是（ ）
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A．将sacB 基因插入到pAH162 上需要用到的酶有BamHI、EcoRI 和DNA 连接酶
B．大肠杆菌能在含四环素的培养基中生长说明双重选择系统的重组质粒构建成功
C．为保证正向连接，进行PCR 前，应在sacB 基因上游引物添加BamHI 识别序列
D．需用Ca2+处理大肠杆菌细胞使其处于一种能吸收周围环境中的DNA 分子的生理状态
【答案】B
【分析】PCR 扩增目的基因需要用耐高温的DNA 聚合酶，根据图示信息，还应该利用PCR 技术在目的基
因的两侧加入BamHI、EcoRI 酶的切割位点。
【详解】A、根据图示信息，将sacB 基因插入到pAH162 上需要利用BamHI、EcoRI 将质粒切割，利用
DNA 连接酶将质粒和目的基因连接，A 正确；
B、具有双重选择系统的大肠杆菌应同时满足在含四环素的培养基中生长，在含蔗糖的培养基中不生长的
条件，而不是仅仅能在含四环素的培养基中生长，B 错误；
C、根据图示箭头方向，箭头位置是目的基因的上游，为保证正向连接，PCR 前应在sacB 基因上游引物添
加BamHI 识别序列，C 正确；
D、导入重组质粒前，需用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状
态，使重组质粒容易进入受体细胞，D 正确。
故选B。
19．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基
因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况
不同，如图表示外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③
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三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况
细菌在含四环素培养基上生长情况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a 和b；②是a；③是b
C．①是a 和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
【答案】A
【分析】分析图形可知：（1）a 是抗氨苄青霉素基因，如果外源基因插入到a 中，此基因结构被破坏，细
菌无抗氨苄青霉素能力。将细菌放入含有氨苄青霉素培养基上生长，则会死亡；相反，会存活。（2）b 是
抗四环素基因，如果外源基因插入到b 中，抗四环素基因结构被破坏，细菌无抗四环素能力。将细菌放入
含有四环素培养基上生长，则会死亡；相反，会存活。
【详解】第①组：细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含
四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏。由此可知，外源基因插入的位置不是a、b，而是
c；
第②组：细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素
培养基上的生长，说明抗四环素基因被破坏。说明了外源基因插入位置是b，不是a；
第③组：细胞不能在含氨苄青霉素培养基上生长，能在含四环素培养基上的生长，说明抗氨苄青霉素基因
被破坏，抗四环素基因没有被破坏，由此可知，外源基因插入的位置是a，而不是b。
综上所述，A 正确，BCD 错误。
故选A。
20．将山核桃miRNA169 基因转入到拟南芥中，可促进拟南芥提前开花，部分流程如下图。下列叙述错误
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的是（ ）
A．过程①通常需要逆转录酶催化
B．过程②中可利用 PCR 技术扩增并筛选出目的基因
C．过程中转化农杆菌一般需要农杆菌的Ti 质粒作为表达载体
D．过程④收获转化的种子需经植物组织培养才能获得提前开花的植株
【答案】D
【分析】植物组织培养是一种将植物体的部分细胞或组织与母体分离,在适当的条件下加以培养,使它们能
够生长、发育、分化与增殖的技术。原理是来自植物细胞的全能性。
【详解】A、过程①为mRNA 逆转录得到cDNA 的过程，需要逆转录酶的催化，A 正确；
B、过程②序列已知，可利用PCR 技术筛选并扩增出目的基因，B 正确；
C、过程③中转化农杆菌一般需要Ti 质粒（农杆菌质粒）作为表达载体，C 正确；
D、过程④收获转化的种子，直接在土壤中培养也可以长成植株，不需要经植物组织培养，D 错误。
故选D。
21．下列关于生物技术的安全性及伦理问题的观点，正确的是（ ）
A．基因编辑技术可改变人类进化的速度和方向，有利于人类的进化
B．若转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
C．中国政府不反对治疗性克隆，可以有限制地进行生殖性克隆研究
D．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术设计婴儿性别
【答案】D
【分析】1、“治疗性克隆”将使人胚胎干细胞（简称ES 细胞）造福于人类的一种非常重要的途径。治疗
性克隆是指把患者体细胞移植到去核卵母细胞中构建形成重组胚胎，体外培养到一定时期分离出ES 细胞，
获得的ES 细胞定向分化为所需的特定类型细胞（如神经细胞、肌肉细胞和血细胞），用于治疗。
2、“生殖性克隆”就是以产生新个体为目的克隆。即用生殖技术制造完整的克隆人。目的是产生一个独
立生存的个体。与此相对的是研究性克隆或医学性克隆，指的是产生研究所用的克隆细胞。不产生可独立
生存的个体。
【详解】A、基因编辑技术只是对个别人的个别基因进行编辑，不一定改变人类进化的速度和方向，A 错
误；
B、转基因技术的安全问题需要验证才能得到证实，若转基因植物的外源基因来源于自然界，也有可能存
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在安全问题，B 错误；
C、中国政府的态度是禁止生殖性克隆人，坚持四不原则（不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性
克隆人实验），不反对治疗性克隆，C 错误；
D、反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术设计婴儿性别，我国不允许利用体外受精技术筛选早
期胚胎性别，D 正确。
故选D。
22．下列有关生物技术的说法中，合乎伦理道德的是（ ）
A．运用试管婴儿技术解决不孕问题
B．进行生殖性克隆人的实验研究
C．利用个人基因资讯决定是否聘用就业申请者
D．为生男孩而设计试管婴儿
【答案】A
【分析】生殖性克隆指将克隆技术用于生育目的，即用于产生人类个体。治疗性克隆：指利用克隆技术产
生特定细胞和组织(皮肤、神经或肌肉等)用于治疗性移植。中国政府：禁止生殖性克隆人，坚持四不原则
(不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验)，不反对治疗性克隆人。
【详解】A、运用试管婴儿技术解决不孕问题，合乎伦理道德，A 正确；
B、我国政府禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆，违背伦理道德，B 错误；
C、个人基因资讯的泄露容易带来安全性和伦理问题，不合乎伦理道德，C 错误；
D、为生男孩而设计试管婴儿，也会带来关于伦理的争论，不合乎伦理道德，D 错误。
故选A。
23．转基因抗虫棉的安全性问题是社会关注的热点，下列叙述正确的是（ ）
A．需要积极推广转基因抗虫棉，这样能够杀死啃食棉花的所有昆虫
B．若保证抗虫基因均来自于自然界，则培育出的转基因抗虫棉不会有安全问题
C．转基因抗虫棉周围种植非转基因棉花，可有效降低棉铃虫抗性基因的突变率
D．将目的基因导入棉花体细胞的叶绿体中，可防止花粉传播造成的基因污染
【答案】D
【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物
多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。
【详解】A、种植抗虫棉可以减少农药的使用量，保护环境，但转基因植物可能会与野生植物杂交，造成
基因污染，可能会对生物多样性构成潜在的风险和威胁，故种植转基因抗虫棉应适度，并采取合适的措施，
A 错误；
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B、抗虫基因虽然来自自然界，但由于插入宿主细胞的位置是随机的等原因，培育出的抗虫棉仍可能存在
安全问题，B 错误；
C、基因突变可以自发突变，且具有不定向性，突变频率与环境没有直接关系，因此在转基因棉田周围种
植非抗虫棉，不能降低棉铃虫抗性基因的突变率，C 错误；
D、将目的基因导入受体细胞的叶绿体中，因为叶绿体的遗传是细胞质遗传，卵子中可能存在该叶绿体，
所以可防止花粉传播造成的基因污染，D 正确。
故选D。
24．下列有关生物技术安全性的观点，合理的是（ ）
A．对于转基因技术，我们应该趋利避害，理性看待
B．由于存在生殖隔离，大田种植转基因抗旱、抗除草剂农作物不存在生物安全性问题
C．转基因作物被动物食用后，目的基因会转入动物体细胞中
D．转基因抗虫植物对昆虫群体抗性基因频率没有影响
【答案】A
【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物
多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。转基因技术本身是中性的，理性看待转基因技
术需要以完备的相关科学知识为基础，还应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的
影响，最重要的是我们要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
【详解】A、转基因技术本身是中性的，对于转基因技术，我们应该趋利避害，理性看待，而不能因噎废
食，A 正确；
B、大田种植转基因抗旱、抗除草剂农作物可能会存在生物安全性问题，如造成基因污染，形成“超级杂
草”，B 错误；
C、转基因作物被动物食用后，目的基因会被分解为小分子物质被人体吸收，因此目的基因不会转入动物
体细胞中，C 错误；
D、由于转基因抗虫植物对昆虫有选择作用，因此可能会导致昆虫群体抗性基因频率增大，D 错误。
故选A。
二、多选题
25．科学家将Oct3/4、Sox2、c－Myc 和Klf4 基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES
细胞的培养基上培养这些细胞。2～3 周后，这些细胞显示出ES 细胞的形态、具有活跃的分裂能力，它们
就是iPS 细胞。这一研究成果有望为人类某些疾病的治疗带来福音。下列有关该实验的分析，不正确的是
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（ ）
A．实验中逆转录病毒作为外源基因的载体，需经显微注射才能转入小鼠成纤维细胞
B．要排除iPS 细胞的产生不是培养基作用的结果，需要将小鼠成纤维细胞直接在培养基上培养作为对
照
C．若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS 细胞再使其转化为需要的细胞移植也会发生免疫排斥反应
D．由于iPS 细胞具有活跃的分裂能力，用它进行治疗时可能存在安全风险
【答案】AC
【分析】胚胎干细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具
有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不
发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
【详解】A、若用病毒作为基因的载体，则不需要进行显微注射导入受体细胞，A 错误；
B、对照组可以排除干扰因素，所以要排除iPS 细胞的产生不是由培养基作用的结果需将小鼠成纤维细胞
直接在培养基上培养作为对照，B 正确；
C、由于用病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS 细胞，其来源于病人，不属于异物，不会引起免疫反应，C 错
误；
D、由于iPS 细胞具有活跃的分裂能力，若不受控制可能转化为癌细胞，所以用它进行治疗时可能存在安
全风险，D 正确。
故选AC。
26．2022 年3 月11 日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组决定在核酸检测基础上，
增加抗原检测作为补充，并组织制定了《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》。以下关于新冠肺炎的叙
述正确的是（ ）
A．新冠病毒可在人体肺上皮细胞中大量增殖
B．抗原检测法采用了DNA 分子杂交的原理
C．核酸检测指的是检测待测人体内有无新冠病毒的核酸
D．接种加强针的目的是提升人体浆细胞和抗体的含量
【答案】AC
【分析】1、病毒是一类没有细胞结构的特殊生物，只有蛋白质外壳和内部的遗传物质构成，不能独立的
生活和繁殖，只有寄生在其他生物的活细胞内才能生活和繁殖，一旦离开了活细胞，病毒就无法进行生命
活动。
2、记忆细胞可以在抗原消失后很长时间内保持对这种抗原的记忆，当再接触这种抗原时，能迅速增殖、
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分化，快速产生大量的抗体，故二次免疫反应快而且强烈。
【详解】A、新冠病毒无细胞结构，不能在内环境中独立生存和繁殖，需要寄生在活细胞（人体肺上皮细
胞）内才能增殖，A 正确；
B、抗原检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理；核酸检测法采用了DNA 分子杂交的原理，B 错误；
C、新冠病毒含有核酸和蛋白质，由于其核酸中的核苷酸具有特定的序列，因此通过核酸检测可排查新冠
病毒感染者，C 正确；
D、接种新冠疫苗的主要目的是让体内产生针对新冠病毒的抗体和相应的记忆细胞，接种加强针可以提升
人体记忆细胞和抗体的含量，D 错误。
故选AC。
27．微滴式数字PCR（ddPCR）是一种检测新冠病毒等病原体的手段，原理如图所示，分为样本分散、
PCR 扩增、检测三个过程。下列有关叙述正确的是（ ）
A．新冠病毒样本在进行ddPCR 检测时，需要先进行逆转录处理
B．多孔板中如果某个孔没有核酸分子，就不需要加入引物和Taq 酶
C．检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸
D．相对于传统手段，ddPCR 更加灵敏，更容易检测出微量病毒，但成本相对较高
【答案】ACD
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】A、PCR 是一项体外扩增DNA 分子的技术，新冠病毒的遗传物质是RNA，故新冠病毒样本在进
行ddPCR 检测时，需要先进行逆转录处理得到DNA，A 正确；
B、由于核酸分子无法肉眼观察到，即使某个孔中不含核酸分子也无法得知，故为避免有遗漏，每个多孔
板中都需要加入引物和Taq 酶，最终通过阳性反应进行鉴定，B 错误；
C、阳性结果意味着有核酸分子能与试剂发生碱基互补配对，故检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可
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以说明原样本中有病毒核酸，C 正确；
D、相对于传统手段，ddPCR 在每个孔中含有少量核酸的条件下即可检测，故更加灵敏，更容易检测出微
量病毒，但成本相对较高，D 正确。
故选ACD。
28．琼脂糖凝胶电泳可用于鉴别DNA 分子的长度，下图为琼脂糖凝胶电泳图像，图中显示了空载体（不
含目的基因X 的质粒载体）和重组载体（含有基因X 的质粒载体）在限制酶的作用下呈现的线性DNA 的
电泳结果。SalI 和XhoI 为两种限制酶，且切割DNA 均形成黏性末端，下列说法错误的是（ ）
A．凝胶中DNA 分子的迁移速率仅取决于DNA 分子的大小
B．该质粒上SalI 和XhoI 的识别序列和切割位点均相同
C．基因X 的长度是2kbp，空载体的长度为5kbp
D．限制酶识别的DNA 序列均由6 个核苷酸组成
【答案】ABD
【分析】限制酶能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷
酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。
【详解】A、凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关，A 错误；
BD、SatI 和XhoI 的识别序列和切割位点可能相同，也可能不同。大多数限制酶的识别序列由6 个核苷酸
组成，也有少数限制酶的识别序列由4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成，BD 错误；
C、由题图分析可知，空载体的长度为5kbp，重组载体长度为7kbp，则基因X 的长度是2kbp，C 正确。
故选ABD。
29．研究者通过如图所示的操作过程，获得导入S 基因的基因编辑小鼠。下列相关叙述不正确的是
（ ）
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A．过程①用促性腺激素处理以获得更多卵母细胞
B．过程②在雌鼠a 的输卵管内完成受精
C．过程③需将表达载体注射到子宫中
D．过程④需抑制雌鼠b 对植入胚胎的免疫排斥
【答案】BCD
【分析】胚胎移植的生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。
这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎
的收集提供了可能。③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可
能。④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
【详解】A、过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，获得更多的卵母细胞，A 正确；
B、过程②是体外受精，体外受精是将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时
间，来促使它们完成受精，B 错误；
C、③是导入含S 基因的表达载体，应该将含S 基因的表达载体通过显微注射法注射至小鼠的受精卵中，C
错误；
D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程④不需要抑制雌鼠b 对植入胚胎的免疫排斥，
D 错误。
故选BCD。
30．RT－PCR 是将RNA 逆转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取
目的基因，具体过程如图所示，以下说法正确的是（ ）
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A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C 含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高
C．该技术用于对某些微量RNA 病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、TaqDNA 聚合酶和引物A 等
【答案】ABC
【分析】设计引物时，引物应当可以与表达载体两端的序列进行互补配对。
PCR 原理：利用DNA 双链复制原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。
【详解】A、利用PCR 技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序
列合成引物，因此需要考虑目的基因两端的碱基序列，A 正确；
B、G/C 对之间有三个氢键，G/C 含量高时稳定性高，所以需要更高的复性温度，来减少引物与非特异性
DNA 的结合，进而减少非特异性扩增产物的出现，B 正确；
C、该技术可用于获取并大量扩增目的基因，因此当RNA 病毒量较少时，可以利用此技术增加病毒核酸含
量，提高检测的灵敏度，C 正确；
D、过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶酶和引物A 等，D 错误。
故选ABC。
31．紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9 倍的花青素（紫色）。紫色花青素能降低人类患心
脏病、糖尿病的风险。如图是花青素基因（S）的cDNA（cDNA 为某种生物发育的某个时期的mRNA 经
反转录产生的互补DNA）和Ti 质粒图。下列叙述错误的是（ ）
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A．据图可知，最好选用XbaI、HindⅢ酶切割S 基因的cDNA 和Ti 质粒
B．在用农杆菌侵染后，常要使用一些抗生素，其目的一是抑制农杆菌生长，二是筛选转化细胞
C．用于扩增S 基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链5'端的碱基序列互补配对
D．若检测出标记基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞
【答案】CD
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技
术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、据图可知，最好选用XbaI、HindⅢ酶切割S 基因的cDNA 和Ti 质粒，既能保证目的基因与载
体产生相同的黏性末端，又不破坏目的基因，A 正确，
B、在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，既要让农杆菌的Ti 质粒上的T-DNA 整合到植物细胞
的染色体中，又要避免农杆菌的大量繁殖，因此培养基中通常加入抗生素，既能抑制农杆菌生长，又能根
据标记基因筛选转化细胞，B 正确；
C、用于扩增S 基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对，以保证
子链从5'端向3'端延伸，C 错误；
D、若检测出目的基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞，D 错误。
故选CD。
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32．DNA 聚合酶不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA 链，因此在复制过程中需要RNA 引物，如图
表示DNA 复制过程。下列相关分析正确的是（ ）
A．DNA 复制时存在A、U 碱基配对现象
B．DNA 复制是多种酶参与的物质合成过程
C．两条子链延伸的方向都是由5′－端到3′－端
D．DNA 聚合酶与DNA 连接酶的底物相同
【答案】ABC
【分析】引物是一小段单链DNA 或RNA，作为DNA 复制的起始点，存在于自然中生物的DNA 复制
（RNA 引物）和聚合酶链式反应（PCR）中人工合成的引物（通常为DNA 引物），之所以需要引物是因
为在DNA 合成中DNA 聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA 链上，DNA 聚合酶的移动方向即子
链合成方向是从3'到5'端，这和脱氧核苷酸的基本结构有关，DNA 的合成，不论体内或体外，都需要一段
引物，原因是在DNA 合成中DNA 聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA 链上。
【详解】A、DNA 复制过程中需要RNA 引物，所以在复制时存在A、U 碱基配对现象，A 正确；
B、DNA 复制是解旋酶、DNA 聚合酶等多种酶参与的物质合成过程，B 正确；
C、DNA 分子的2 条链是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA 聚合酶作用下合成的，其
合成方向是从子链5′－端向3′－端延伸，C 正确；
D、DNA 聚合酶与DNA 连接酶的底物不同，前者作用于单个脱氧核苷酸，而后者作用于DNA 片段，D 错
误。
故选ABC。
三、综合题
33．金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是由动植物和微生物产生的一类低分子量、富含半胱氨酸、具有
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金属结合能力的多肽，具有多种生物学功能。近年来，因其具有与Zn、Cu、Cd 等重金属的较强结合能力，
而用于生态修复。科研人员成功地将人MT 蛋白基因用农杆菌转化法转入番茄，成功培育转基因番茄。回
答下列问题：
(1)感受态农杆菌的制备：取保存的根癌农杆菌菌落用 接种于相应的液体培养基中，并置于
中进行振荡培养，完成菌种的活化和扩大培养；取适量菌液置于低浓度、 的CaCl2溶液中处理，
制得感受态农杆菌。
(2)MT 目的基因的获取和转化：取人肝脏细胞破碎后提取mRNA，在逆转录酶的作用下形成cDNA，经
PCR 技术扩增后的产物分别与Ti 质粒连接形成重组质粒（如图)，将其与制备好的感受态农杆菌混合，最
后进行短暂的 处理，使外源DNA 转入细胞；经适宜条件培养一段时间，再加入适宜浓度的
筛选出转化的农杆菌。
(3)转化番茄：取番茄子叶进行 处理后切段，再与转化的农杆菌菌液进行共培养适宜时间，
取出子叶放在 上吸取多余菌液，再将子叶放在适宜的以 培养基为基础配制的培养基中
进行活化和除菌培养。
(4)育成转基因番茄：取上述处理的番茄子叶先经 过程形成愈伤组织，再经发芽和生根，最
后经过 过程，育成成熟的番茄植株。
(5)转基因番茄性状的检测和生产应用：为了检测番茄中是否成功导入目的基因，可依据 设计引物进行
PCR 扩增，再用凝胶电泳技术进行检测，进行此实验的同时应以 作为阴性对照，以农杆菌Ti 质粒
的番茄作为阳性对照；已知某转基因番茄植物能大量吸收Zn、Cd 等元素，且主要富集在根，生产应用时
需对其定期拔除并实施无害处理，原因是 （答出2 点即可）。
【答案】(1) 接种环 摇床 低温
(2) 热刺激 卡那霉素
(3) 消毒 无菌滤纸 MS
(4) 脱分化 炼苗和移栽
(5) T-DNA 片段的(部分)序列 未导入质粒的野生型番茄 避免死亡后根等遗体被分解，锌再
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度返回土壤，造成二次污染；及时拔除植物后，缓解锌随食物链不断富集的危害
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】（1）感受态农杆菌的制备：取保存的根癌农杆菌菌落用接种环接种于相应的液体培养基中，并
置于接种环摇床中进行振荡培养，使其大量繁殖；取适量菌液置于低浓度、低温的CaCl2 溶液中处理，制
得感受态农杆菌，即此时的农杆菌处于容易吸收外源DNA 的状态。
（2）取人肝脏细胞破碎后提取mRNA，在逆转录酶的作用下形成cDNA，经PCR 技术扩增后的产物分别
与Ti 质粒连接形成重组质粒，将其与制备好的感受态农杆菌混合，最后进行短暂的热刺激处理以便提高农
杆菌的活性，进而使外源DNA 转入细胞；由于图中的启动子是真核细胞表达系统，因此能在农杆菌中表
达的是卡那霉素抗性基因，因此，经适宜条件培养一段时间，再加入适宜浓度的卡那霉素筛选出转化的农
杆菌。
（3）取番茄子叶进行消毒处理，其目的是防止杂菌污染，而后切段，再与转化的农杆菌菌液进行共培养
适宜时间，取出子叶用无菌滤纸上吸取多余菌液，再将子叶放在适宜的以MS 培养基为基础配制的培养基
中进行活化和除菌培养，以便获得较纯净的外植体。
（4）取上述处理的番茄子叶先经脱分化过程形成愈伤组织，再经分化培养基上培养让其发芽和生根，最
后经过炼苗和移栽过程，育成成熟的番茄植株，而后对该植株进行鉴定。
（5）为了检测番茄中是否成功导入目的基因，可依据T-DNA 片段的序列设计引物进行PCR 扩增，再用凝
胶电泳技术进行检测，进行此实验的同时应以未导入质粒的野生型番茄作为阴性对照，以农杆菌Ti 质粒的
番茄作为阳性对照，而后对PCR 扩增获得的DNA 片段进行电泳检测并与对照组作比对；已知某转基因番
茄植物能大量吸收Zn、Cd 等元素，且主要富集在根，由于这些元素不易被分解且容易在生物体内富集，
因此，生产应用时需对其定期拔除并实施无害处理，这样可以避免死亡后根等遗体被分解，这些元素再度
返回土壤，造成二次污染；同时及时拔除植物，也能缓解锌等元素随食物链不断富集造成的危害。
34．某动物体内含有某目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素
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抗性基因（AmpR）、LacZ 基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。回答下列问题：
(1)保存基因技术的成熟使构建某种生物的基因文库成为可能，重组DNA 技术是保存生物基因的关键技术。
据图总结在受体菌中保存基因的基本步骤： （用→将各步骤连接）。
(2)在第③步中，为了使质粒DNA 能与目的基因连接，需要在混合物中加入 酶。若第②步用同一种限
制酶处理质粒和目的基因，仅考虑1 个目的基因和1 个质粒，则在第③步的混合物中，会形成 种含目
的基因的重组产物。进行第④步之前一般用Ca2+对大肠杆菌进行处理，目的是 。
(3)在仅添加了氨苄青霉素的培养基上筛选出的细胞不一定是目的细胞，请说明理由： 。请对筛选目的
细胞的操作提出完善意见： 。
【答案】(1)目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与
鉴定→保存含目的基因的细胞（或细菌）
(2) DNA 连接 2 使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态
(3) 导入不含目的基因的质粒的细胞也能在含有氨苄青霉素成分的培养基上存活 在培养基中加入
氨苄青霉素成分的同时加入X-gal 物质，培养一段时间后，菌落颜色为白色的即为目的菌落
【分析】1、基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋
予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的
基因的检测与鉴定。
3、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸
之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA 连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【详解】（1）利用重组DNA 技术是保存生物基因的基本步骤：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的
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构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定→保存含目的基因的细胞。
（2）若用同一种限制酶处理质粒和目的基因，则可能会出现目的基因与质粒的正向连接和反向连接；用
Ca2+对大肠杆菌进行处理的目的是使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态。
（3）含有目的基因的重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，同时LacZ 基因被破坏，因此可以用添加了氨
苄青霉素成分和X-gal 物质的培养基进行筛选。
35．人的血清蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲用乳腺生物反应器来大量生产HSA。下图所
示为HSA 基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新
霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4 种限制酶的切割位点。请据图回答问题：
(1)人工构建pBR322 质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有 （答
出两点）等，
(2)若选用牛作为受体动物，可将人血清蛋白基因与 等调控组件重组在一起，通过 方
法将目的基因导入牛的受精卵中，然后使其发育成转基因牛。
(3)据图分析，在构建基因表达载体时，选择 作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因
和载体的正确连接效率，其原因是 。
(4)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322 质粒而非重组质粒）的干扰，
目的基因导入后，进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基含新霉素，乙培养基含新霉素和
氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上 （填“能”或“不能”）生存，在乙培养基
上 （填“能”或“不能”）生存。
(5)据下图分析，利用PCR 技术获取HSA 基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 ，需扩
增 次后得到HSA 目的基因。
【答案】(1)启动子、终止子
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(2) 在乳腺中特异表达的基因的启动子（牛乳腺蛋白基因的启动子） 显微注射
(3) EcoRⅠ和PstⅠ 这两种酶能切割质粒和目的基因，能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基
因自连及反接（这两种酶切割DNA 形成不同的黏性末端，可避免质粒和目的基因的自身环化和反向连
接）
(4) 能 不能
(5) 乙、丙 3
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核
心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：
根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和
花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法
是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记
基因和终止子组成，因此人工构建pBR322 质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还
必须有启动子、终止子等。
（2）因为乳腺蛋白基因只能在乳腺细胞中表达，故要从奶牛的乳汁中获得人血清白蛋白，选用牛作为受
体动物，则在构建基因的表达载体时，要将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子调控组件重组在一
起。根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法。
（3）据图可知，BamH Ⅰ会切割目的基因，Tth Ⅲ 1 会切割质粒中的复制原点，而EcoRⅠ和PstⅠ这两种酶能
切割质粒和目的基因，不破坏抗性基因和复制原点等，且能能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因
自连及反接，因此在构建基因表达载体时，选择EcoRⅠ和PstⅠ作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目
的基因和载体的正确连接效率。
（4）分析题图可知，PstI 破坏了氨苄青霉素抗性基因（Ampr），构建的重组质粒无氨苄青霉素抗性，但
具有新霉素抗性基因，而甲培养基中含有新霉素，因此，含重组质粒的受体细胞能在甲培养基上生存；乙
培养基中含有新霉素和氨苄青霉素，能杀死含有目的基因的受体细胞，不能在乙培养基中生存。
（5）PCR 时，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的
5'端向3'端延伸的，因此据图分析，利用PCR 技术获取HSA 基因时，应选择乙、丙作为引物。扩增3 次后
得到HSA 目的基因（第一次循环扩增出来的新片段很长，第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段
的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离
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出目的基因。第三次循环，当以第二次循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的
长度，当第三次循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了）。
36．已知镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β 肽链第6 位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代
替，导致功能异常；而人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。
乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。回答下列问题：
(1)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操
作 （填“属于”或“不属于”）蛋白质工程，理由是该操作 。
(2)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的 ，以其作为模板，在 酶的作用下
反（逆）转录合成cDNA．cDNA 与载体需在限制酶和 酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体
菌后进行表达。
(3)如图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程，质粒中lacZ 基因可使细菌利用加入培养基的物质X－
gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色。图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别
是 或 。
(4)获取目的基因的方法除了图中用酶切的方法从细胞中分离以外，还可以通过 来获得。据图可知，
该目的基因的具体功能是 。
(5)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 ，培养一段时
间挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。
【答案】(1) 不属于 没有对现有的蛋白质进行改造（或没有对基因进行修饰）
(2) mRNA（或RNA） 逆转录 DNA 连接
(3) 只用BamHⅠ 同时用EcoRⅠ和BamHⅠ
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(4) 人工合成（或PCR 技术扩增） 指导乙肝病毒蛋白质外壳的合成
(5) 青霉素和X－gal 白
【分析】基因工程技术的基本步骤：
(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取利用PCR 技术扩增和人工合成。
(2)基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因
等。
(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法
有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法:将目的基因导入动物细胞最有效的方法是是微注射法:将目的
基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-体杂交技术。
【详解】（1）蛋白质工程通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，由于该操
作中没有对蛋白质进行改造或合成新的基因，因此不属于蛋白质工程。
（2）因为血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA 为模板，在逆转录
酶的作用下反（逆）转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA 连接酶协助。
（3）根据图解可知，含有目的基因的外源DNA 和载体上都有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRV 的识别序列
和切割位点，用EcoRV 切割会破坏目的基因，因此图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别是只用
BamHⅠ或同时用EcoRⅠ和BamHⅠ。
（4）获取目的基因的方法：从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。根据图中④目的基因最
终产生乙肝病毒外壳进行接种，说明该目的基因具体功能是指导合成乙肝病毒蛋白质外壳。
（5）用限制酶BamHⅠ切割时破坏了lacZ 基因，但没有破坏青霉素抗性基因，因此为了筛选含目的基因的
重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X－gal，根据题干信息“质粒中
lacZ 基因可使细菌利用加入培养基的物质X－gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色”
可知，培养一段时间挑选出白色的菌落进一步培养获得大量目的菌。
37．红景天中的HMA3 基因能编码Cd 转运蛋白，科研人员将红景天中的HMA3 基因转入栾树，以实现栾
树的定向改良，使其增强对Cd 的富集能力，从而更有效治理Cd 污染。实验的主要流程如下，其中Hygr为
潮霉素抗性基因，Kanr为卡拉霉素抗性基因，请回答：
(1)重组质粒的构建、扩增、保存
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① 从红景天细胞中提取总RNA 为模板，进行RTPCR。其中PCR 的反应条件：98 ℃10 s，55 ℃30 s，72
℃1 min，35 个循环，其中55 ℃30 s 过程称为 。若模板双链cDNA 的数量为a 个，经过35 个循环
需要消耗引物的数量是 。
② 为构建Cd 转运蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质
粒时用 酶切PCR 纯化产物(已添加相应酶切位点)及Ti 质粒，然后通过DNA 连接酶进行
连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。
(2)栾树愈伤组织的诱导
切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加 (填植物激素的名称)，放入培养箱，
经过21 d 的黑暗诱导，茎段经 形成愈伤组织。
(3)农杆菌介导转化体系的建立
将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加 的培养基筛选出转化成功的愈
伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。
(4)原生质体制备及目的基因的检测和鉴定
①取4 g 筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含
的酶解液中处理一段时间获得原生质体。
②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP 与Cd 转运蛋白构建融合蛋白的目的
是 。若要从个体生物学水平上进行目的基因的检测与鉴定，则可以检测比较转基因栾树
与野生型栾树 。
【答案】(1) 复性/退火 2a×（235-1） Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ
(2) 细胞分裂素和生长素(等) 脱分化
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(3)潮霉素
(4) 纤维素酶和果胶酶 通过观察绿色荧光来确定Cd 转运蛋白是否表达以及分布场所 Cd 的
富集能力
【分析】1、PCR 全称为聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。其原理是DNA
的复制。PCR 的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）。PCR 共
包括三步：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自
动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①55℃30s 过程称为退火（复性），处理的目的是使引物与模板DNA 单链的互补序列结合，
模板双链cDNA 的数量为a 个，则经过35 个循环DNA 分子共有a×235 个，但是cDNA 作为模板时不需要
引物，所以需要引物的个数为2a×（235-1）个。②限制酶的选择原则是：不能破坏了质粒的启动子、终止
子及抗性基因，同时为了确保目的基因与质粒正确连接，所以可以用Bgl Ⅱ和SpeⅠ对目的基因与质粒进行
酶切。
（2）栾树愈伤组织的诱导过程所需培养基需要加入一定比例的生长素与细胞分裂素，脱分化是指在一定
的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞经脱分化形成愈伤组织的过程。
（3）由于选择的限制酶Bgl Ⅱ已经将卡拉霉素抗性基因破坏，所以只能用潮霉素进行筛选转化成功的愈伤
组织。为了让幼苗能适应野外环境，需要将幼苗长出较为发达的根系后进行移栽炼苗。
（4）①植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，所以可以用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织获得原生质
体。②通过观察绿色荧光来确定Cd 转运蛋白是否表达以及分布场所，所以本研究中选择GFP 与Cd 转运蛋
白构建融合蛋白。可以检测比较转基因栾树与野生型栾树Cd 的富集能力，这是个体生物学水平上进行目
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的基因的检测与鉴定。
38．嗜热土壤芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB 酶）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地
应用，开展了以下实验：
I．利用大肠杆菌表达BgIB 酶
(1)PCR 扩增bglB 基因时，选用 的基因组DNA 作模板。
(2)如图为质粒限制酶酶切图谱。bglB 基因不含图中限制酶的识别序列。为使PCR 扩增的bglB 基因重组进
该质粒，扩增的bglB 基因两端需分别引入限制酶 的识别序列。
(3)先用Ca2+处理大肠杆菌后再将上述构建好的表达载体与之混合，原因是： 。请提出
在个体生物学水平筛选出重组大肠杆菌的简要实验思路及依据： 。
Ⅱ．温度对BgIB 酶活性的影响
(4)温度会影响BglB 酶活性及其稳定性，从而影响其对纤维素的分解效率，该实验为实际生产应用中对反
应温度的控制提供理论依据。综合分析图1，2 实验结果，可得出实验结论：
。
注：酶的热稳定性是酶在一定温度下，保温一段时间后通过其活性的保持程度来反映的。
Ⅲ．利用分子育种技术提高BglB 酶的热稳定性
(5)在PCR 扩增bglB 基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB 基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热
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稳定性高的BglB 酶的基因。与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比，上述育种技术获得热稳定性高
的BglB 酶基因的效率更高，其原因是在PCR 过程中 （写出一点即可）。
【答案】(1)嗜热土壤芽孢杆菌
(2)NdeⅠ、BamHⅠ
(3) 使大肠杆菌处于能够吸收周围环境中的DNA 分子的状态 配制以纤维素为唯一碳源的选择培
养基培养混合大肠杆菌，重组大肠杆菌能产生BglB 酶因而能在选择培养基中生存而普通大肠杆菌不能生
存
(4)BglB 酶的最适温度在60℃-70℃，在70℃下酶的热稳定性下降，而在60℃下基本不变，在实际应用中
反应温度应控制在60℃
(5)仅针对bglB 基因进行诱变；bglB 基因可快速累积突变（写出一点即可）
【分析】基因工程的操作步骤有，目的基因的获取、基因表达载体的构建（核心步骤）、将目的基因导入
受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由“嗜热土壤芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB 酶）是一种耐热纤维素酶”可知bglB 基
因存在于嗜热土壤芽孢杆菌基因组中，故应以该菌的基因组进行基因扩增bglB 基因。
（2）目的基因与质粒进行重组时，需将目的基因插入到启动子和终止子之间，且应靠近启动子和终止子，
结合示意图可知，应在扩增的bglB 基因两端分别引入 Ndel 和BanHI 两种限制酶的识别序列。
（3）一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后再
将重组的基因表达载体导入其中。重组大肠杆菌的基因组中有耐热纤维素酶基因，可以表达出BglB 酶，
即可以在高温条件下分解纤维素，故在个体生物学水平筛选出重组大肠杆菌，可配制以纤维素为唯一碳源
的选择培养基培养混合大肠杆菌，重组大肠杆菌能产生BglB 酶因而能在选择培养基中生存而普通大肠杆
菌不能生存。
（4）由图2 可知，BglB 酶在80℃保温 30 分钟后，就会失活；由图1 可知，当温度为60~70℃时，酶活性
较高，而由图 2 可知70℃时保温30 分钟，酶活性开始减弱，而60℃保温30 分钟后酶活性基本不发生变
化，由此可知为高效利用BglB 酶降解纤维素， 反应温度最好应控制在60℃。
（5）在bglB 基因扩增过程中加入诱变剂进行诱变处理，相比于诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌，针对
性更强；基因突变是不定向的；由于 PCR 过程基因扩增即 DNA 复制快速进行，发生突变后可进行快速
积累， 进而便于筛选。
39．口服肿瘤疫苗可以借由肠道丰富的免疫环境来刺激强烈的抗肿瘤免疫反应，从而达到良好的免疫效果。
研究人员对大肠杆菌（肠道中最丰富的共生菌）进行基因工程改造获得工程菌。该工程菌可作为口服肿瘤
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疫苗激活机体特异性免疫，实现肿瘤的预防和治疗。具体研究如下：
(1)疫苗载体构建及工程菌的制备
部分肠道细菌能够分泌外膜囊泡（OMV），OMV 能穿越肠道上皮屏障，活化肠黏膜内丰富的免疫细胞。
研究人员利用如图1 所示元件构建表达载体转化大肠杆菌来制备工程菌：
（注：ClyA：OMV 表面特异蛋白的基因；Ag：肿瘤细胞表面特异性抗原基因；mFc：小鼠Fc 基因）
①选择大肠杆菌来制备工程菌的原因有 （答出两点即可）。
②图1 中，ClyA 基因的作用是 ；mFc 基因的表达产物能够与树突状细胞（DCs）表面的特异性
受体结合，从而提高DCs OMV 的能力。
(2)免疫效果调节及评估
为避免长期抗原刺激引起的免疫耐受，研究人员引入阿拉伯糖诱导型启动子来控制ClyA-Ag-mFc 融合蛋白
基因的表达，即只有在阿拉伯糖存在的情况下，才会诱导表达融合蛋白。为进一步证实按上述流程操作制
备的工程菌在人为可控条件下引发特异性免疫反应的效果，研究人员用健康的小鼠进行如下实验：
组
别
载体构建具体操
作
第0、4、8 天口
服阿拉伯糖
结果检测
A
组
空载体
+
第12 天，每组随机取5 只小鼠的等量的脾脏细胞与肺转移性
黑色素瘤细胞共培养，检测黑色素瘤细胞存活率，结果如图
2。
B
组
ClyA-mFc
+
c
组
ClyA-OVA
+
D
组
ClyA-OVA-mFc
（a）
E
组
（b）
（c）
（注：“+”代表口服、“-”代表不口服；OVA：肺转移性黑色素瘤细胞表面特异性抗原基因）
①D、E 组的操作和口服情况分别是a： ；b： ；c 。图2 结果说明
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工程菌在人为可控条件下引发了特异性免疫反应，理由是 。
②研究人员在上述实验基础上，增加了实验小组口服阿拉伯糖的频率和天数，其目的是研究 。
(3)该工程菌的开发为不同肿瘤的精准治疗提供了可能。参考本实验，利用下图设计针对治疗皮下结肠肿瘤
的工程菌表达载体元件 。
【答案】(1) 大肠杆菌繁殖速度快、大肠杆菌易培养、便于进行基因工程改造、便于发酵和扩大生产
规模、可快速获取大量OMV、是肠道中最丰富的共生菌、大肠杆菌基因组全序列已知 指导ClyA 蛋
白（OMV 表面特异蛋白）的合成（表达出ClyA），将融合蛋白定位到OMV 表面 识别、摄取
(2) - ClyA-OVA-mFc + D、E 组含有OVA，E 组在人为控制口服阿拉伯糖后产生特异性
抗原，激活特异性免疫，对黑色素瘤细胞的杀伤率较高，黑色素瘤细胞存活率低 增加（OVA）抗原
表达量，是否能增加（或降低、或影响）特异性免疫效果（或：增加（OVA）抗原表达量，是否引发免疫
耐受）
(3)i：ClyA ii：皮下结肠肿瘤表面特异性抗原基因 iii：mFc
【分析】1、树突状细胞为抗原呈递细胞，可识别、摄取和传递抗原信息。
2、根据表格和柱状图可知，服用的工程菌采用“加法原理”，逐渐增加部件，则D 组和E 组工程菌都是
完整的，即D 组：ClyA-OVA-Fc，E 组：ClyA-OVA-Fc，但是D 组不饮用含阿拉伯糖的水，不能激活融合
基因的表达，E 组饮用含阿拉伯糖的水，进而激活融合基因的表达。
【详解】（1）选择大肠杆菌来制备工程菌的原因有：大肠杆菌繁殖速度快，大肠杆菌易培养，便于进行
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基因工程改造，便于发酵和扩大生产规模，可快速获取大量OMV，是肠道中最丰富的共生菌，大肠杆菌
基因组全序列已知；
据题干信息“ClyA 是OMV 表面特异蛋白的基因”可知，ClyA 基因的作用是指导ClyA 蛋白（OMV 表面
特异蛋白）的合成（表达出ClyA），将融合蛋白定位到OMV 表面；mFc 基因的表达产物能够与树突状细
胞（DCs）表面的特异性受体结合，从而提高DCs 识别、摄取OMV 的能力，最终启动特异性免疫反应。
（2）根据表格和柱状图可知，服用的工程菌采用“加法原理”，逐渐增加部件，则D 组和E 组工程菌都
是完整的，均为：ClyA-OVA-mFc，但D 组因不饮用含阿拉伯糖的水，不能激活融合基因的表达，黑色素
瘤细胞存活率高，E 组饮用含阿拉伯糖的水，进而激活融合基因的表达，最终抑制黑色素瘤细胞的存活，
故a 为：-；b 为：ClyA-OVA-mFc；c 为：+；图2 结果说明工程菌在人为可控条件下引发了特异性免疫反
应，理由是第D、E 组含有OVA，E 组在人为控制口服阿拉伯糖后产生特异性抗原，激活特异性免疫，对
黑色素瘤细胞的杀伤率较高，黑色素瘤细胞存活率低，而A、B 组缺乏OVA，D 组无阿拉伯糖诱导，杀伤
率均低，黑色素瘤细胞存活率高；
在上述实验基础上，增加了实验小组口服阿拉伯糖的频率和天数，其目的是研究增加（OVA）抗原表达量，
是否能增加（或降低、或影响）特异性免疫效果，或增加（OVA）抗原表达量，是否引发免疫耐受。
（3）本实验中融合基因里面有OVA（黑色素瘤细胞特异性抗原），所以只需将OVA 替换为皮下结肠肿瘤
特异性抗原即可，即将元件中的OVA 替换为皮下结肠肿瘤特异性表达的抗原基因，故i 为：ClyA；ii：皮
下结肠肿瘤表面特异性抗原基因；iii：mFc。
40．家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，将其添
加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，需使用图1 中质粒作为
载体，图2 为含W 基因的DNA 片段。回答下列问题：
(1)常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有 。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产
生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，请写出相关的反应式
。
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(2)利用PCR 技术扩增W 基因时，用到的DNA 聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是 。扩增完
成后，常采用 法来鉴定PCR 的产物。为得到含W 基因的乳酸杆菌，可采用平板划线法纯化
乳酸杆菌，进行划线操作要注意： （写出2 点即可）。
(3)W 基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA 自身延伸的方向为5'→3'。下表是几种限制酶的识别序列及
切割位点，图1、图2 标注了相关限制酶的酶切位点。为获得能正确表达W 基因的重组质粒，应分别使用
哪些限制酶对质粒和含W 基因的DNA 片段进行切割？ 。
限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
KpnⅠ
MfeⅠ
HindⅢ
识别位
点
5'
G↓AATTC
﹣
﹣
3'
3'
CTTAA↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GATCC
﹣
﹣
3'
3'
CCTAG↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GTACC
﹣
﹣
3'
3'
CCATG↑G
﹣
﹣
5'
5'
C↓AATTG
﹣
﹣
3'
3'
GTTAA↑C
﹣
﹣
5'
5'
A↓AGCTT
﹣
﹣
3'
3'
TTCGA↑A
﹣
﹣
5'
【答案】(1) 乳酸链球菌 C6H12O6
2C3H6O3+能量
(2) 耐高温 琼脂糖凝胶电泳 从第一次划线的末端开始进行第二次划线；不要将最后一次的
划线与第一次的划线相连；每次划线前要灼烧接种环；在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环
(3)质粒：限制酶HindⅢ、MfeⅠ；含W 基因的DNA 片段：限制酶HindⅢ、EcoRⅠ
【分析】1、纯化微生物的常用方法：①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，
将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，在稀释
度足够高的菌液里，微生物将分散成单个细胞，将它们均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的
各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中
才能进行，需提供DNA 模板，分别与两条模板链结合的2 种引物，4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA 聚合
酶；同时通过控制温度使DNA 复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因 DNA 受热变性后解为单链，
引物与单链相应互补序列结合;然后以单链DNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下进行延伸，即将4 种脱氧核
苷酸加到引物的3 端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每
一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增。
【详解】（1）乳酸菌是厌氧细菌，在自然界中分布广泛，还有乳酸链球菌，其只能进行无氧呼吸，其反
应式为：C6H12O6 酶→2C3H6O3+能量。
（2）PCR 是一项体外扩增DNA 的技术，该过程中温度可能达到90℃以上，用到的DNA 聚合酶具有的特
点是耐高温；PCR 产物的鉴定方法是琼脂糖凝胶电泳技术。
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（3）选择限制酶时应注意：不能破坏目的基因，质粒要确保至少含有一个完整的标记基因，目的基因要
以正确方向插入启动子与终止子之间的部位。结合图表，BamHⅠ会切割到启动子，用EcoRⅠ切割质粒后，
质粒也会“自身环化”，只能初步考虑MfeⅠ、KpnⅠ切割质粒，MfeⅠ会破坏目的基因；目的基因的两端需
要能产生不同末端的限制酶切割，所以要选用HindⅢ，据表可知、HindⅢ，需要选择HindⅢ切割质粒的
其中一个位点，转录时mRNA 自身延伸的方向为5'→3'，为了W 基因以正确方向拼接到质粒上、HindⅢ切
割，MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同。所以质粒用限制酶HindⅢ、MfeⅠ切割；含W 基因的DNA
片段用限制酶HindⅢ、EcoRⅠ切割。
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