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专题24 基因工程
考 点 链 接
考点1 重组DNA 技术的基本工具
1．切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶，这类酶主要是从原核生物中分
离纯化出来的。它们能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部
位的磷酸二酯键断开，产生黏性末端或平末端两种形式的末端。
2．DNA 连接酶分为两类，一类是E.coli DNA 连接酶，另一类是T4DNA 连接酶。后者既可以
“缝合”双链DNA 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA 片段的平末端，但连接
平末端的效率相对较低。
3．质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA 之外，并具
有自我复制能力的环状双链DNA 分子。
4．在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造
的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于
重组DNA 分子的筛选。
5．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在
大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA 片段的大小上也有很大差别。
6．载体必须具备的条件：①能在受体细胞中保存下来并能自我复制；②具有1 个或多个限
制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有标记基因。
7．DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA 与蛋白质。
DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的NaCl 溶液。在一定温度下，
DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA 的试剂。
考点2 基因工程的基本操作程序
1．培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、
将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2．PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参
与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
3．PCR 技术可以分为变性、复性和延伸三步。
4．PCR 反应过程可以在PCR 扩增仪（PCR 仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂
糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物。
5．基因表达载体要包括以下四个基本的结构：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
6．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同
时，使目的基因能够表达和发挥作用。
7．启动子位于目的基因的上游，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位。
8．标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选
出来。（或供重组DNA 的鉴定和选择）。
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9．花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直
接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA 溶液滴加在花柱切
面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的
方法还有农杆菌转化法。
10．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
11．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，
而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，
能将Ti 质粒上的T－DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细
胞的染色体DNA 上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti 质粒的T－DNA 中，
通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
12．检查转基因抗虫棉是否培育成功，首先是分子水平的检测，包括通过PCR 等技术
检测棉花的染色体DNA 上是否插入了Bt 基因或检测Bt 基因是否转录出了mRNA；从转基
因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt 基因是否翻译成Bt 抗
虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂
棉铃虫来确定Bt 基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
13．在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
14．将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的
受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。在基因工程操作中，常用原核生物
作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细
胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达
载体导入其中。
考点3 基因工程的应用
1．科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过
显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳
期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
2．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。
3．目前，科学家正尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体
的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，
然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
考点4 蛋白质工程的原理和应用
1．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或
合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化
过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产
和生活的需要。
3．蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应
有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所
需要的蛋白质。
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真 题 回 顾
1．（2023·江苏·统考高考真题）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是
（ ）
A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
【答案】A
【解析】洋葱鳞片叶内表皮的原生质层具有选择透过性，可代替半透膜探究质膜的透性，A
正确；洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，需要水浴加热才可能出现砖红色沉淀，若出现
砖红色，则可说明洋葱匀浆中含有还原糖，B 错误；制作根尖有丝分裂装片时，解离、按
压盖玻片得目的都是为了获得单层细胞，即这些操作均能更好地将细胞分散开，C 错误；
粗提取的DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可显蓝色，D 错误。
2．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA 损伤，可通过“核苷酸切除修复
（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER 酶系统存在缺陷，受
阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20 岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述
错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA 聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA 有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP 患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
【答案】C
【解析】由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同
时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA 聚合酶，A 正确；填补缺口
时，新链即子链的延伸方向为5’到3’的方向进行，B 正确；DNA 有害损伤发生后，在细
胞增殖中进行修复，保证DNA 复制的正确进行，对细胞最有利，C 错误；癌症的发生是多
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个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP 患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积
解释，D 正确。
3．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因
（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶
酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
（ ）
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中
能形成菌落
【答案】D
【解析】若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不
同，A 正确。 若用Pvu Ⅰ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在
含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B 正确；DNA 凝胶电泳技术可以
分离不同大小的DNA 片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，
C 正确；Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用Sph Ⅰ酶切，重组质粒中含氨苄青
霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能
形成菌落，在含Tet 的培养基中不能形成菌落，D 错误。
4．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因
（GFP）整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质
的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得
的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙
所示。
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下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【解析】分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转
录后，可以使GEP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；因启动
子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所
以翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；整合GFP 基因后，核酸片段变长，
2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只有小片段，是野生型，C
错误；用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片
段，D 错误。
5．（2023·广东·统考高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离
→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【解析】裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A 正确；DNA 在不同浓度的
NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl 溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多
糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多
次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 纯度，C 正确；将DNA 溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水
浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D 错误。
6．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连
接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、
连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
【答案】C
【解析】酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；质粒用酶3 切
割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；质
粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目
的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；若用酶2
和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体
缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。
7．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用
重组酶技术构建质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增
程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
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A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转
化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F
和F2-R 进行了PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可
以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是
。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 引物
(2)CD
(3)限制性核酸内切酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的
碱基序列
【解析】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、
片段F2）、引物。PCR 过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补
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配对结合。引物设计是决定PCR 反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是
引物的设计。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-
GACGAG-3'能与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中
5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基
因相同的黏性末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物
片段与线性质粒载体混合后，在DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性
核酸内切酶（限制酶）。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，
菌落数可能低于30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错
误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能
发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上
长出的单菌落无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F
和F2-R 进行了PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有
P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子
的碱基序列，因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确
认。
8．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源
于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用
胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来
源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA
的EdU 和BrdU 均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短
时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每
隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标
记细胞占EdU 标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从
点到 点。
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(3)为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导
型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以
下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基
因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；
③Er 基因：编码的Er 蛋白位于细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④
口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线：
→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周
期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，
再过t2时间后检测B 细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源
于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
【答案】(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 将Ce 酶基因和Er 基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B 细胞没有被BrdU 标记
【解析】（1）分析题意可知，EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对
的原则可知，掺入DNA 的EdU 和BrdU 均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA 分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不
同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU 会与A 结合，导致子链
出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU 也会与A 结合，使放射性
增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA 复制所需
时长的是从Q 点到R 点。
（3）分析题意，要制备IK 小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L
基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK 的技术路线为：将Ce 酶基
因和Er 基因连接（Ce 酶可作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失）→连接到表达载体→
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转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er 蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛
中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周
期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU 饲喂小鼠IK，各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，
t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU 标记，实验假设是变胖过程中增
加的B 细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B 细胞直接分裂，
不会再有DNA 复制过程，故t2时间后用BrdU 饲喂则不起作用，即大多数B 细胞没有被BrdU
标记。
9．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室
合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1
与图2 分别是利用常规转化法和CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
(1)图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需
要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的
。图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是
。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/
Cas9 基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导
入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的
方法是 ，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，
依据是 。
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(5)与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是 （答出2 点即可）。
【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能
制造有机物的需要
(2) 遗传特性 转基因标识
(3)Ti 质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到
一起
(4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS
缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除
(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【解析】（1）图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是
使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和
细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶
绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。
（2）图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A
的遗传特性。图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注转基因
种子，即进行转基因标识。
（3）图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti 质粒的作用，Ti 质
粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/
Cas9 基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导
入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标
记的毛状根即为阳性毛状根段，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作
用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS 缺失会导致植株白化，而白化苗的出
现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需
要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
10．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食
物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖
氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基
中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变
体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011 年我国首次利用转基因和体细胞核
移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的
基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基
因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与
BEF 膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
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③核移植。将转基因的BEF 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核
后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了
重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，
直至小牛出生。
⑤检测。DNA 水平检测：利用PCR 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以
为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA 水平检测：从非转基因牛
乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对
总RNA 进行 处理，以去除DNA 污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用
特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而
不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
【答案】(1)负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF
DNA 酶 PCR 的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细
胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
【解析】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该
系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合
成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持
在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变
体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF 膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使
细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活
重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入
代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的
对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当
前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影
响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存
在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA 污染，可以
使用DNA 酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR 的模板进行扩增。目的基因在转
基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只
含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
11．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分
解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的
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基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因
直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已
知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，
则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧
啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，
需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，再重新导入。研究人员在
UGA 基因序列两端加上酵母菌DNA 中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA 基因进行切除。
C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可
以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该
如图 。
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【答案】(1)细胞外
(2)P1和P6
(3) 缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸
(4)图3
【解析】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以
发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体
上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧
啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生
存；
方式一，C 和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，
连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清
酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有
毒物质，不能形成菌落。
（4）根据前面分析，C 和C'的中间插入UGA，A 和B 之间插入的目的基因，所以图3 正确。
12．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了
检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还
需具备的结构有 （答出2 个结构即可）。
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(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若
仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由
此可知引物F1 与图甲中J 基因的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相
同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是
否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，
条带2 所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达
的。
【答案】(1) RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a 链
(3) J-V5 融合蛋白 不是
【解析】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要
转录，因此RNA 聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：
①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛
选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体
细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位
点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了
确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图
甲中的引物F2和R1或F1与R2。b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方
向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a 链）是
5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所
以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是
3’-5'的b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是
J-V5 融合蛋白。抗J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2
所检出的蛋白不是由重组质粒上的J 基因表达的。
13．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该
病毒外壳蛋白A 为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所
示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不
需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中
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PEG 对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对
和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
【答案】(1) 不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【解析】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数
量。脂溶性物质PEG 可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的
亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技
术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA 连接酶能连接DNA 片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH 位于3'端，
①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA 连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧
核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH 相连，④符合题意。
故选④。
14．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的
使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA 病毒。重组
乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回
答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导
入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是
。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
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(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提
取 进行DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
【答案】(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
(2) 筛选 RNA 聚合酶
(3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA 片段
(4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA 是否翻译形成蛋白质
【解析】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，
无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA 聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查
目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗
体杂交技术。
15．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基
因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程
包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得
高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体
是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进
行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植
体。
(2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行
去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体
的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密
度。两种原生质体1∶1 混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过
量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散
固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于
。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再
生植株。
(5)用PCR 技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA 序列a，乙植物细胞质具
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有特异性DNA 序列b；M1、M2为序列a 的特异性引物，N1、N2为序列b 的特异性引物。完善
实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的 。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方
法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经 后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预
期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
【答案】(1) 再生 叶
(2) 纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG 浓度，使其失去融
合作用
(3) 同一个杂种融合原生质体 ABD
(4) 再分化 根和芽
(5) 模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【解析】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否
具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，
若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去
壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质
体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失
活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微
镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1 混合后，通过添加适宜
浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG
浓度,使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分
散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个
杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分
裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、
分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组
织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的模板。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩
增序列b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预期
的1 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
16．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟
南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型
DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与
其有关，开展相关实验。
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回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，
则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用
DNA 连接酶将两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备
。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可
以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位
点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因
与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性
个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约
%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体
杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养
基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增
野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行
突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。
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【答案】(1)野生型
(2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子
(3) DAI 基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【解析】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI 基因为显性基
因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变
造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR 技术扩增DAI 基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI 基因和运载体进
行切割，再用DNA 连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首
端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序
列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA 上含有DAI 基
因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉
素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，
即表示其基因组中插入DAI 基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI 基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可
在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点
插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1 的性
状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中
幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基
上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到
100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的
长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X 的切割位点，而突变型的基因有限制酶X 的切
割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp 和
100bp，如图：
。
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新 题 尝 鲜
1．（2023 春·高二课时练习）从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插
入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（ ）
A．②，BamH Ⅰ
B．①，EcoR Ⅰ
C．①，EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ
D．②，EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ
【答案】C
【解析】分析图1 可知，重组质粒被EcoR Ⅰ酶切后，得到5.8kb 的片段，说明重组质粒中
只有一个EcoR Ⅰ的酶切位点；重组质粒被BamH Ⅰ酶切后产生3.8kb 和2.0kb 两种片段，
说明重组质粒中有2 个BamH Ⅰ的酶切位点；重组质粒被EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后，产生
4.5kb 和1.3kb 两种片段，说明重组质粒中有EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点，且二种酶切位
点之间的片段为4.5kb 和1.3kb。结合图2 分析可知，重组质粒①符合上述分析的结果，重
组质粒②中EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间的片段为2.3kb 和3.5kb，不符合图1 酶切的结
果。综上所述，C 正确，ABD 错误。
2．（2023 春·高二课时练习）下列关于基因工程各种工具的叙述，错误的是（
）
A．E .coliDNA 连接酶只能“缝合”黏性末端
B．限制酶主要来自原核生物，限制酶一般不切割自身DNA
C．载体上必须有2 个以上限制性内切核酸酶的切割位点
D．限制酶断开磷酸二酯键，T4DNA 连接酶能恢复磷酸二酯键
【答案】C
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【解析】E•coliDNA 连接酶只能“缝合”黏性末端，T4DNA 连接酶能“缝合”平末端和黏性
末端，A 正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，细胞内含有的限制酶一般不对自
身DNA 进行剪切，只切割外源DNA，这是在长期的进化过程中形成的一种保护，B 正确；
载体上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA 片段（基因）插入其中，C 错误；限制
酶能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷
酸之间的磷酸二酯键断裂；DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键，D 正确。
3．（2023 秋·河南·高三校联考开学考试）水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要
施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥
厂”,让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述
错误的是（ ）
A．PCR 技术可用于固氮基因的获取和检测
B．实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选
C．为了提高 PCR 扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度
D．PCR 实验中使用的微量离心管和枪头等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
【答案】C
【解析】PCR 技术的原理是模拟生物体内DNA 分子复制过程，故用PCR 技术可从根瘤菌DNA
中获取固氮基因，也可用于固氮基因的检测，A 正确；若要检测转基因水稻是否成功，可
将该水稻种于缺氮的培养液，若无缺乏症，则可证明转基因成功，B 正确；若要提高PCR
扩增固氮基因的特异性，因引物延长，与模板特异性结合能力更强，可耐受较高的复性温
度，所以应可适当增加引物长度并提高复性温度，C 错误；为避免杂菌的DNA 污染，所用
装置应该严格灭菌，D 正确。
4．（2023 秋·重庆万州·高三重庆市万州第二高级中学校考阶段练习）图甲、乙中标注
了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（ ）
A．若通过PCR 获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2+转化法
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
【答案】D
【解析】引物是根据目的基因两侧序列获得，需要与目的基因两端互补，故若通过PCR 技
术大量扩增该目的基因，应该选用引物甲和引物丙，A 正确；图甲中BamH Ⅰ会破坏两种抗
性基因，不能选用，故图乙中目的基因左侧只能选Bcl Ⅰ，而质粒上没有目的基因右侧
Sau3A 的切点，两者都有Hind Ⅲ的切点，为了防止目的基因与质粒随意连接，故质粒和目
的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切，B 正确；若将基因表达载体导入受体
细胞大肠杆菌时，需用钙离子等处理，使其处于易于吸收外源DNA 的状态，C 正确；在受
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体细胞中，插入目的基因时氨苄青霉素抗性基因被破坏，不能和目的基因同时表达，D 错
误。
5．（2023 春·高二课时练习）科学家运用基因工程技术，将人血清白蛋白基因导入山羊
的受精卵中，培育出羊乳腺生物反应器，使羊乳汁中含有血清白蛋白。以下相关叙述正确
的是（ ）
A．该转基因羊中的血清白蛋白基因只存在于乳腺细胞中
B．可用显微注射技术将含有目的基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中
C．血清白蛋白基因需要与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件进行重组
D．利用乳腺生物反应器生产药物不受性别和生殖期的限制
【答案】C
【解析】本过程是把人血清白蛋白基因导入山羊的受精卵中，因此在山羊的各个细胞中都
含有血清白蛋白基因，A 错误；以动物细胞作为受体细胞时，常采用显微注射技术将含有
目的基因的表达载体导入羊的受精卵（全能性高）中，B 错误；若想血清白蛋白基因在乳
腺中表达，则应将血清白蛋白基因需要与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件进行重组，C
正确；
由于只有雌性动物在哺乳期才会分泌乳汁，因此药物的生产会受到转基因动物性别和年龄
的限制，D 错误。
6．（2023 春·河南许昌·高二校考期中）蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强
的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等，还可被制成人造韧带等。科学家研究出集中
生产蜘蛛丝的方法—一培育转基因蜘蛛羊作为乳腺生物反 应器。下列有关乳腺生物反应器
的说法，错误的是（ ）
A．将蜘蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等结合在一起构建成表达载
体
B．将含有丝蛋白基因的表达载体导入动物乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
D．转基因动物产生的生殖细胞中可能含有药用蛋白基因
【答案】B
【解析】该过程需要将蜘蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等结合在一起
构建成表达载体，再通过显微注射导入受精卵中，A 正确；将含有丝蛋白基因的表达载体
导入动物受精卵中才可获得乳腺生物反应器，B 错误；与乳腺生物反应器（只能选雌性）
相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛，C 正确；转基因动物产生的生
殖细胞可能含有药用蛋白基因，因为体细胞中含有药用蛋白基因，D 正确。
7．（2023 春·高二课时练习）下列有关生物工程的叙述，不正确的有（ ）
①基因工程的核心步骤是构建基因表达载体
②蛋白质工程可通过直接改造蛋白质的结构从而改变其功能
③克隆羊的培育涉及细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
④PCR 技术需要酶打开DNA 双链
⑤利用核移植技术可以培育试管婴儿
⑥牛胚胎发育的历程是：受精卵→桑椹胚→囊胚→原肠胚→幼体
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⑦利用动物细胞培养技术和细胞融合技术可以制备单克隆抗体
③利用植物茎尖培养脱毒苗时，需要对离体的茎尖、培养基等进行灭菌
A．一项
B．两项
C．三项
D．四项
【答案】D
【解析】①为了使目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能
够表达和发挥作用，需要构建基因表达载体，该步是基因工程的核心步骤，①正确；
②蛋白质工程通过对基因修饰或基因合成间接改造蛋白质的结构从而改变其功能，②错误；
③克隆羊的培育是借助核移植技术完成的，涉及到细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植
等技术，③正确；
④PCR 技术利用高温打开DNA 双链，④错误；
⑤利用体外受精技术可以培育试管婴儿，⑤错误；
⑥哺乳动物牛的胚胎发育过程均为：受精卵→桑葚胚→囊胚→原肠胚→幼体，⑥正确；
⑦单克隆抗体的制备是利用动物细胞融合技术将免疫的B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合
以获得杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞进行克隆化培养而获得的抗体即为单克隆抗体，而细
胞融合技术的基础是动物细胞培养技术，⑦正确；
⑧利用植物茎尖培养脱毒苗时，植物的茎尖病毒极少、甚至没有病毒，不需要对其进行灭
菌处理，但为了防止杂菌污染，需要对培养基等进行灭菌处理，⑧错误。综上所述，A、
B、C 错误，D 正确。
8．（2023 春·高二课时练习）天然胰岛素制剂容易发生聚合，会在一定程度上延缓药效。
科学家通过蛋白质工程将胰岛素B 链28 位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29 位的赖氨
酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素。下列说法错误的是（
）
A．设计速效胰岛素首先要从避免胰岛素形成聚合体这一预期功能开始
B．该过程通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造
C．速效胰岛素在受体细胞中合成时遵循中心法则
D．该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，可直接生产有生物活性的胰岛素
【答案】D
【解析】对胰岛素进行分子设计的主要依据是胰岛素的预期功能，而后再进行预期蛋白质
结构的设计，A 正确；设计胰岛素的改造中，要对胰岛素基因的结构进行改造，因此，蛋
白质工程又叫做第二代基因工程，B 正确；速效胰岛素的化学本质是蛋白质，因此其在受
体细胞中合成时遵循中心法则，C 正确；该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，不能直接
生产有生物活性的胰岛素，因为大肠杆菌是原核生物，细胞中没有内质网和高尔基体，因
而不能对多肽链进行加工，D 错误。
9．（2023 秋·福建龙岩·高三上杭一中校考阶段练习）为使水稻获得抗除草剂性状，科
研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。
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注：GUS 基因表达产物经染色能从无色变成蓝色
(1)将草甘膦抗性基因作为 ，与Ti 质粒用相同的 和DNA 连接酶处理构建基
因表达载体。
(2)用 处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添
加 的培养基中，经筛选1 得到含基因表达载体的农杆菌。
(3)取某品种水稻的幼胚，先进行 处理，然后接种到培养基中，水稻幼胚细胞发生
形成愈伤组织。用含基因表达载体的农杆菌侵染该愈伤组织。
(4)PCR 扩增时需要根据草甘膦抗性基因序列设计 种引物，引物是
。
(5)利用PCR 技术，可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基
因的部分序列如下：
5’---ATGGCT………AGGAAC---3’
3’---TACCGA………TCCTTG---5’
根据上述序列应选择引物 （填字母）进行PCR。
A．引物：5’-TACCGA-3’
B．引物：5’-GTTCCT-3’
C．引物：5’-AUGGCU-3’
D．引物：5’-ATGGCT-3’
(6)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用GUS 基因表达产物的鉴定进行
图中的筛选2，以确定目的基因是否 。两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的
过程，获得转基因水稻。
【答案】(1) 目的基因 限制性核酸内切酶
(2) CaCL2溶液 潮霉素
(3) 消毒 脱分化
(4) 2 使DNA 聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸
(5)BD
(6) 表达 再分化
【解析】（1）构建的基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点，
目的基因与运载体要用限制酶切割获得相同的末端才能进行连接，本实验中，草苷膦抗性
基因为目的基因。
（2）细菌最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞成为感受态细胞，再将重组
表达载体DNA 分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收
DNA 分子，完成转化过程。若农杆菌得到含目的基因的表达载体，则也同时含有潮霉素抗
性基因，因此可以用加有潮霉素的选择培养基把它筛选出来。
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（3）外植体脱离了母体，易受微生物感染，在体外培养的条件下要消毒处理，再接种。外
植体在培养基中发生脱分化，进行细胞分裂，形成愈伤组织。
（4）PCR 技术要用到两种引物，使DNA 聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸。
（5）已知草甘膦抗性基因的部分序列，由于PCR 技术中，子链合成的方向是从5，到3，，
因此应选择引物BD 进行PCR 技术。
（6）SUS 基因表达产物经染色能从无色变成蓝色，还可以利用GUS 基因表达产物的鉴定进
行图中的筛选2，以确定目的基因是否表达。两次筛选后得 到的转基因愈伤组织经过细胞
的再分化过程，获得转基因水稻。
10．（2023 秋·浙江·高三校联考开学考试）研究者改造与肠道共生的大肠杆菌，口服该
工程菌后激活机体特异性免疫，实现肿瘤的预防和治疗。部分肠道细菌能够分泌外膜囊泡
（OMV），OMV 能穿越肠道上皮屏障活化肠黏膜内丰富的免疫细胞（如图1）。细菌溶素A
（ClyA）是外膜囊泡上含量较高的特异蛋白。
(1)构建表达载体：研究者利用含图2 所示元件的表达载体转化大肠杆菌制备工程菌，ClyA
基因的作用是表达ClyA，使 定位至OMV 表面；Fc 表达产物能够与树突状细胞表面的
特异性受体结合，提高树突状细胞 OMV 的能力。
(2)工程菌的制备与培养：为了便于将表达载体导入大肠杆菌，可用CaCl2处理，以提高细
菌 （结构）的通透性。然后将已改造的工程菌置于LB 培养基中培养，并不断进
行搅拌。
(3)检测：可用核酸分子杂交技术，或先对融合基因进行 ，然后再进行凝胶电泳加以
鉴定。琼脂糖凝胶的孔隙可起到 的作用，一般来说，DNA 分子量越小，配制琼脂糖凝
胶的浓度越 。凝胶浸没于电泳缓冲液中，电泳缓冲液的作用是 。DNA 本身是无
色的，可以用 将DNA 染色。如果最终在凝胶上出现多个条带，推测可能的原因有
。（写出两点）
(4)使用：患者应将工程菌与 一同口服，在肠道繁殖并表达后，使人体产生对 的
特异性免疫反应。
【答案】(1) OVA 和Fc 识别（识别、摄取）
(2) 细胞膜 液体
(3) PCR 分子筛（筛选） 大（高） 维持合适的PH，并使溶液具有一定
的导电性 亚甲基蓝（溴化乙锭、荧光） 引物设计不合理，退火温度过低
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(4) 阿拉伯糖 黑色素瘤
【解析】（1）ClyA 是外膜囊泡上含量较高的特异蛋白，而OMV 能穿越肠道上皮屏障活化
肠黏膜内丰富的免疫细胞。所以，ClyA 基因的作用为表达出细菌溶素A(ClyA)，使OVA 和
Fc 定位至OMV 表面，进而融合基因可以被免疫细胞识别。Fc 表达产物能够与树突状细胞表
面的特异性受体结合，进而提高树突状细胞识别、摄取和传递抗原信息的能力。
（2）基因表达载体导入大肠杆菌细胞最常用转化法：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一
种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，以提高细菌细胞膜的通透性。然后将重组表达
载体DNA 分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA
分子，完成转化过程。改造后的细菌要大量增殖，要用液体培养基。
（3）DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH（用缓冲液来维持）下，这些基团可以带上
正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，
这个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，琼脂糖凝胶的孔隙可起
到分子筛的作用。在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等
有关。一般来说，DNA 分子量越小，配制琼脂糖凝胶的浓度越高；凝胶中的DNA 分子通过
亚甲基蓝或溴化乙锭染色，或荧光标记后，可以在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来。
如果最终在凝胶上出现多个条带，说明PCR 过程中，由于引物设计不合理、退火温度过低
等原因，产生多种DNA 片段。
（4）依图2 中信息，基因表达载体的启动子在有阿拉伯糖存在时，才会起作用，因此患都
应同时服用工程菌和阿拉伯糖，才能表达出抗原信息，使人体产生对黑色素瘤的特异性免
疫反应。
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