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专题43 基因工程
一、重组DNA 技术的基本工具
1.基因工程的概念
2．限制性内切核酸酶
(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)作用：识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二
酯键。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。
3．DNA 连接酶
种类
E.coli DNA 连接酶
T4 DNA 连接酶
来源
大肠杆菌
T4 噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，连接两个DNA 片段
4.限制酶和DNA 连接酶的关系
(1)限制酶和DNA 连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA 的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA 连接酶起作用时，不需要模板。
5．基因进入受体细胞的载体
作用
携带外源DNA 片段进入受体细胞
种类
质粒、噬菌体、动植物病毒等
条件
能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因
6.DNA 的粗提取与鉴定
(1)实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理
1
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或化学方法对它们进行提取。
①DNA 不溶于酒精。
②DNA 在不同浓度的NaCl
溶液
中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的NaCl 溶液。
③在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)实验流程
二、基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)获取目的基因的方法
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
②利用PCR 获取和扩增目的基因。
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
3．将目的基因导入受体细胞
(1)导入方法
项目
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、
花粉管通道法
显微注射技术
Ca
2 ＋ 处理法
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
2
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(2)农杆菌转化法
①转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。侵染时将Ti 质
粒上的T DNA
转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA 上。
4．目的基因的检测与鉴定
项目
步骤
检测内容
方法
分子水平
的检测
第一步
转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因
PCR 技术
第二步
目的基因是否转录出了
mRNA 技术
第三步
目的基因是否翻译出了蛋白质
抗原—抗体
杂交技术
个体生物
学水平的
鉴定
抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度
5．DNA 片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验原理
①DNA 扩增：利用PCR 可以在体外进行DNA 片段的扩增。
②电泳鉴定：DNA 分子在一定的pH 下，可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，DNA 向着与
它所带电荷相反的电极移动。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶中的DNA 分子通过染色，
可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。
(2)实验步骤
①DNA 片段的扩增
②DNA 片段电泳鉴定的基本过程
三、基因工程的应用
3
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1.基因工程在农牧业方面的应用
(1)转基因抗虫植物；(2)转基因抗病植物；(3)转基因抗除草剂植物；(4)改良植物的品质；(5)提高动物
的生长速率；(6)改善畜产品的品质。
2．基因工程在医药卫生领域的应用
(1)对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物。基因工程药物主要包括细胞因子、
抗体、疫苗和激素等。
(2)让哺乳动物批量生产药物，如乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
(3)可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。
3．在食品工业方面的应用：利用工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
四、蛋白质工程的原理和应用
1.概念
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，
或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．蛋白质工程的基本原理
(1)基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，而蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能
的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
(2)基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改
变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
3．蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面：利用蛋白质工程研发药物。
(2)其他工业方面：被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面：科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加粮食
产量。
五、生物技术的安全性与伦理问题
1．对转基因产品安全性的争论
(1)基因工程对原本是自然造就的生命形式进行了人为改造，使之具有了全新特征。
(2)人们所生活的国家或社会的政治制度、意识形态、宗教信仰、经济发展水平、历史背景、传统文化
和伦理道德观念等的差异，决定了人们具有不同的价值观取向。
2．理性看待转基因技术
(1)以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
(2)应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
(3)要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(4)我国对转基因技术的方针是研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上
要严格，坚持依法监管。
3．生殖性克隆人面临的伦理问题
生殖性克隆与治
疗性克隆
①生殖性克隆：指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
②治疗性克隆：指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用来修
4
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复或替代受损的细胞、组织和器官，达到治疗疾病的目的
生殖性克隆人面
临的伦理问题
①生殖性克隆人“有违人类尊严”。②生殖性克隆人是人为地制造在心
理上和社会地位上都不健全的人。③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人
会面临流产、死胎和畸形儿等问题
4.我国禁止生殖性克隆人
(1)对生殖性克隆人的实验研究，我国政府的四原则是：不赞成、不允许、不支持、不接受。
(2)对治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张进行有效监控和严格审查。
5．生物武器的种类
包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
6．我国对生物武器的态度
我国政府支持《禁止生物武器公约》的宗旨和目标，全面、严格履行公约义务，并主张全面禁止和彻
底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
一、单选题
1．科学家利用PCR 技术扩增人乳头瘤病毒HPV-16L1 基因，构建了含HPV-16L1 基因的表达载体pBI-L1，
经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度
较高的HPV-16L1 蛋白。下列说法错误的是（ ）
A．利用PCR 扩增HPV-16L1 基因的前提是已知该基因的一段碱基序列
B．构建表达载体pBI-L1 时可使用两种不同限制酶以确保正确连接
C．必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因
D．可以用抗原一抗体杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1 蛋白
2．以下关于农杆菌转化法的叙述错误的是（ ）
A．若用Ti 质粒作载体，目的基因的插入位置应该在T－DNA 片段内
B．将重组Ti 质粒导入农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌
C．农杆菌能将重组Ti 质粒转移到被侵染的植物细胞内，并将其整合到染色体上
D．能在植物细胞中检测到目的基因，还不能说明转化成功
3．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由正确的是（ ）
A．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．对宿主细胞无伤害，以便于重组 DNA 的筛选
D．能在宿主细胞中稳定保存并复制，以便产生大量的目的基因
4．CAR-T 细胞疗法是通过设计CAR 基因，并导入癌症患者的T 细胞中，使其转化为CAR-T 细胞，CAR-
5
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T 细胞膜上的CAR 蛋白与癌细胞表面抗原特异性结合后，可激活CAR-T 细胞使其增殖、分化，从而实现
对癌细胞的特异性杀伤和记忆，主要过程如下图。下列叙述正确的是（ ）
A．CAR 基因缺少启动子，进行过程②有利于实现其在T 细胞中的复制和表达
B．CAR 蛋白的胞外结合区相当于抗原-MHC 复合体，可与癌细胞特异性结合
C．CAR-T 细胞经过程④形成的效应细胞能准确识别癌细胞并引发癌细胞凋亡
D．CAR-T 细胞因在体内可以增殖分化，故在体外转化完成后无需扩大培养即能使用
5．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR)、四环素抗性基因（TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有
目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒），并导入受体菌中。
根据题目所提供的信息，下列叙述正确的是（ ）
A．若用ScaI 酶切质粒，所得产物经凝胶电泳可形成3 个条带
B．若用HindIII 和ScaI 酶切，一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C．若用PvuI 酶切，在含四环素培养基中形成的菌落，一定含有目的基因
D．若用SphI 酶切，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落，再影印接种到
含氨苄青霉素的培养基中
6．人们对转基因生物安全性的关注，随着转基因成果的不断涌现而与日俱增。下列有关转基因成果的叙
述，错误的是（ ）
A．对微生物的基因改造是基因工程取得实际应用成果最多的领域
B．利用转基因小鼠Ⅰ型糖尿病模型可以模拟该病的发生和发展过程
C．啤酒酵母双乙酰浓度过高会影响啤酒的风味和口感，利用转基因工程菌可以减少它的生成
D．种植的转基因作物中大豆和棉花最多，其次是玉米和油菜
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7．乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒
酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙
酯高产菌株，该过程如下图所示。下列关于该过程的分析不合理的是（ ）
A．转入的L-PG 基因表达产物不能影响酿酒酵母活性
B．可以利用PCR 技术筛选含有L-PG 基因的受体细胞
C．L-PG 基因可在乳酸乙酯高产菌株体内复制与表达
D．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
8．图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（ ）
A．若通过PCR 获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2+转化法
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
9．若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性内切核
酸酶的酶切位点分别是BglⅡ（－A↓GATCT－），EcoRⅠ（－G↓AATTC－）和Sau3AⅠ（－↓GATC－）。
下列分析合理的是（ ）
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A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1 噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRI 切割目的基因和P1 噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1 噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1 噬菌体载体
10．野生型的λ 噬菌体具有DNA 分子量大、限制酶切割位点过多等特点，但经人工改造后可作为载体将
目的基因导入大肠杆菌。下列相关说法正确的是（ ）
A．改造λ 噬菌体时，需除去其全部的限制酶切割位点
B．转化前必须用Ca2﹢将大肠杆菌处理成能吸收外源DNA 的生理状态
C．λ 噬菌体载体可自我复制并含有标记基因
D．人工改造λ 噬菌体是获取转基因大肠杆菌的核心工作
11．用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA 片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。
下列关于电泳技术叙述错误的是（ ）
A．电泳是指带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程
B．泳道①、②分别是用XhoⅠ、SalⅠ处理得到的产物
C．若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA 片段后电泳，其泳道可能只有5 个条带
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D．电泳技术可以用于亲子鉴定、生物间亲缘关系鉴定
12．苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry 具有杀虫毒性，但Cry 蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，
制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry 蛋白第168 位的组氨酸替换为精氨酸
后，Cry 蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3 倍；将Cry 蛋白第282 位、第283 位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成
甘氨酸和丝氨酸后，Cry 蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7 倍。下列有关叙述错误的是（ ）
A．对Cry 蛋白的改造是通过改造Cry 蛋白的相关基因来实现的
B．Cry 蛋白的毒性提高了3~7 倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构
C．改造Cry 蛋白应从Cry 蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构
D．使用蛋白质工程改造Cry 蛋白过程中需要使用限制酶和DNA 连接酶
13．下列关于PCR 的叙述，错误的是（ ）
A．PCR 只能扩增引物之间的DNA 片段而非整个完整的模板DNA 分子
B．PCR 过程中变性的目的是让引物与模板DNA 单链结合
C．PCR 的原理是DNA 半保留复制
D．PCR 的过程需要耐高温的DNA 聚合酶但不需要解旋酶
14．新冠病毒通过表面刺突蛋白（S 蛋白）的活性域（RBD）与人体细胞表面的ACE2 受体相互作用感染
细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S 蛋白的RBD 紧密结合，以干扰新冠病毒
的感染。下列叙述不合理的是（ ）
A．生产LCB1 用到了基因工程的操作技术
B．可直接从细胞中获取基因用于LCB1 的生产
C．LCB1 的结构可能与S 蛋白的抗体有相似之处
D．S 蛋白的RBD 结构可以为设计LCB1 提供信息
15．新冠病毒是一种RNA 病毒，极易产生变异，其通过表面刺突蛋白（S 蛋白）的受体结合域（RBD）与
人体细胞表面的ACE2 受体相互作用而感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可
与S 蛋白RBD 紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列有关说法错误的是（ ）
A．LCB1 的作用效应与抗S 蛋白抗体类似
B．LCB1 可以通过细胞中原有的基因表达产生
C．LCB1 的设计和合成遵循中心法则
D．LCB1 的设计和合成是通过蛋白质工程实现的
16．某二倍体动物种群有100 个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基
因A1、A2、A3进行PCR 扩增，凝胶电泳及统计结果如图所示。该种群中A1的基因频率是（ ）
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A．52%
B．27%
C．32%
D．2%
17．某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图
甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子
小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩增，PCR 产物电泳
结果如图乙所示。
下列叙述错误的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子可以控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．4 号条带的小鼠是野生型，2 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
18．研究人员通过PCR 扩增质粒PDNR-LIB 中的sacB 基因，该基因的产物对蔗糖敏感，是一种常见的反
选择标记基因。tetA 是四环素抗性基因，利用基因工程将sacB 基因插入到质粒pAH162 上，构建含有tetA-
sacB 双重选择系统的重组质粒，即pAH162-sacB，具体过程如下图所示。将pAH162-sacB 导入大肠杆菌验
证其双重选择作用。下列分析错误的是（ ）
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A．将sacB 基因插入到pAH162 上需要用到的酶有BamHI、EcoRI 和DNA 连接酶
B．大肠杆菌能在含四环素的培养基中生长说明双重选择系统的重组质粒构建成功
C．为保证正向连接，进行PCR 前，应在sacB 基因上游引物添加BamHI 识别序列
D．需用Ca2+处理大肠杆菌细胞使其处于一种能吸收周围环境中的DNA 分子的生理状态
19．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基
因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况
不同，如图表示外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③
三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况
细菌在含四环素培养基上生长情况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
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A．①是c；②是b；③是a
B．①是a 和b；②是a；③是b
C．①是a 和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
20．将山核桃miRNA169 基因转入到拟南芥中，可促进拟南芥提前开花，部分流程如下图。下列叙述错误
的是（ ）
A．过程①通常需要逆转录酶催化
B．过程②中可利用 PCR 技术扩增并筛选出目的基因
C．过程中转化农杆菌一般需要农杆菌的Ti 质粒作为表达载体
D．过程④收获转化的种子需经植物组织培养才能获得提前开花的植株
21．下列关于生物技术的安全性及伦理问题的观点，正确的是（ ）
A．基因编辑技术可改变人类进化的速度和方向，有利于人类的进化
B．若转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
C．中国政府不反对治疗性克隆，可以有限制地进行生殖性克隆研究
D．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术设计婴儿性别
22．下列有关生物技术的说法中，合乎伦理道德的是（ ）
A．运用试管婴儿技术解决不孕问题
B．进行生殖性克隆人的实验研究
C．利用个人基因资讯决定是否聘用就业申请者
D．为生男孩而设计试管婴儿
23．转基因抗虫棉的安全性问题是社会关注的热点，下列叙述正确的是（ ）
A．需要积极推广转基因抗虫棉，这样能够杀死啃食棉花的所有昆虫
B．若保证抗虫基因均来自于自然界，则培育出的转基因抗虫棉不会有安全问题
C．转基因抗虫棉周围种植非转基因棉花，可有效降低棉铃虫抗性基因的突变率
D．将目的基因导入棉花体细胞的叶绿体中，可防止花粉传播造成的基因污染
24．下列有关生物技术安全性的观点，合理的是（ ）
A．对于转基因技术，我们应该趋利避害，理性看待
B．由于存在生殖隔离，大田种植转基因抗旱、抗除草剂农作物不存在生物安全性问题
C．转基因作物被动物食用后，目的基因会转入动物体细胞中
D．转基因抗虫植物对昆虫群体抗性基因频率没有影响
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二、多选题
25．科学家将Oct3/4、Sox2、c－Myc 和Klf4 基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES
细胞的培养基上培养这些细胞。2～3 周后，这些细胞显示出ES 细胞的形态、具有活跃的分裂能力，它们
就是iPS 细胞。这一研究成果有望为人类某些疾病的治疗带来福音。下列有关该实验的分析，不正确的是
（ ）
A．实验中逆转录病毒作为外源基因的载体，需经显微注射才能转入小鼠成纤维细胞
B．要排除iPS 细胞的产生不是培养基作用的结果，需要将小鼠成纤维细胞直接在培养基上培养作为对
照
C．若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS 细胞再使其转化为需要的细胞移植也会发生免疫排斥反应
D．由于iPS 细胞具有活跃的分裂能力，用它进行治疗时可能存在安全风险
26．2022 年3 月11 日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组决定在核酸检测基础上，
增加抗原检测作为补充，并组织制定了《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》。以下关于新冠肺炎的叙
述正确的是（ ）
A．新冠病毒可在人体肺上皮细胞中大量增殖
B．抗原检测法采用了DNA 分子杂交的原理
C．核酸检测指的是检测待测人体内有无新冠病毒的核酸
D．接种加强针的目的是提升人体浆细胞和抗体的含量
27．微滴式数字PCR（ddPCR）是一种检测新冠病毒等病原体的手段，原理如图所示，分为样本分散、
PCR 扩增、检测三个过程。下列有关叙述正确的是（ ）
A．新冠病毒样本在进行ddPCR 检测时，需要先进行逆转录处理
B．多孔板中如果某个孔没有核酸分子，就不需要加入引物和Taq 酶
C．检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸
D．相对于传统手段，ddPCR 更加灵敏，更容易检测出微量病毒，但成本相对较高
28．琼脂糖凝胶电泳可用于鉴别DNA 分子的长度，下图为琼脂糖凝胶电泳图像，图中显示了空载体（不
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含目的基因X 的质粒载体）和重组载体（含有基因X 的质粒载体）在限制酶的作用下呈现的线性DNA 的
电泳结果。SalI 和XhoI 为两种限制酶，且切割DNA 均形成黏性末端，下列说法错误的是（ ）
A．凝胶中DNA 分子的迁移速率仅取决于DNA 分子的大小
B．该质粒上SalI 和XhoI 的识别序列和切割位点均相同
C．基因X 的长度是2kbp，空载体的长度为5kbp
D．限制酶识别的DNA 序列均由6 个核苷酸组成
29．研究者通过如图所示的操作过程，获得导入S 基因的基因编辑小鼠。下列相关叙述不正确的是
（ ）
A．过程①用促性腺激素处理以获得更多卵母细胞
B．过程②在雌鼠a 的输卵管内完成受精
C．过程③需将表达载体注射到子宫中
D．过程④需抑制雌鼠b 对植入胚胎的免疫排斥
30．RT－PCR 是将RNA 逆转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取
目的基因，具体过程如图所示，以下说法正确的是（ ）
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A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C 含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高
C．该技术用于对某些微量RNA 病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、TaqDNA 聚合酶和引物A 等
31．紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9 倍的花青素（紫色）。紫色花青素能降低人类患心
脏病、糖尿病的风险。如图是花青素基因（S）的cDNA（cDNA 为某种生物发育的某个时期的mRNA 经
反转录产生的互补DNA）和Ti 质粒图。下列叙述错误的是（ ）
A．据图可知，最好选用XbaI、HindⅢ酶切割S 基因的cDNA 和Ti 质粒
B．在用农杆菌侵染后，常要使用一些抗生素，其目的一是抑制农杆菌生长，二是筛选转化细胞
C．用于扩增S 基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链5'端的碱基序列互补配对
D．若检测出标记基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞
32．DNA 聚合酶不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA 链，因此在复制过程中需要RNA 引物，如图
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表示DNA 复制过程。下列相关分析正确的是（ ）
A．DNA 复制时存在A、U 碱基配对现象
B．DNA 复制是多种酶参与的物质合成过程
C．两条子链延伸的方向都是由5′－端到3′－端
D．DNA 聚合酶与DNA 连接酶的底物相同
三、综合题
33．金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是由动植物和微生物产生的一类低分子量、富含半胱氨酸、具有
金属结合能力的多肽，具有多种生物学功能。近年来，因其具有与Zn、Cu、Cd 等重金属的较强结合能力，
而用于生态修复。科研人员成功地将人MT 蛋白基因用农杆菌转化法转入番茄，成功培育转基因番茄。回
答下列问题：
(1)感受态农杆菌的制备：取保存的根癌农杆菌菌落用 接种于相应的液体培养基中，并置于
中进行振荡培养，完成菌种的活化和扩大培养；取适量菌液置于低浓度、 的CaCl2溶液中处理，
制得感受态农杆菌。
(2)MT 目的基因的获取和转化：取人肝脏细胞破碎后提取mRNA，在逆转录酶的作用下形成cDNA，经
PCR 技术扩增后的产物分别与Ti 质粒连接形成重组质粒（如图)，将其与制备好的感受态农杆菌混合，最
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后进行短暂的 处理，使外源DNA 转入细胞；经适宜条件培养一段时间，再加入适宜浓度的
筛选出转化的农杆菌。
(3)转化番茄：取番茄子叶进行 处理后切段，再与转化的农杆菌菌液进行共培养适宜时间，
取出子叶放在 上吸取多余菌液，再将子叶放在适宜的以 培养基为基础配制的培养基中
进行活化和除菌培养。
(4)育成转基因番茄：取上述处理的番茄子叶先经 过程形成愈伤组织，再经发芽和生根，最
后经过 过程，育成成熟的番茄植株。
(5)转基因番茄性状的检测和生产应用：为了检测番茄中是否成功导入目的基因，可依据 设计引物进行
PCR 扩增，再用凝胶电泳技术进行检测，进行此实验的同时应以 作为阴性对照，以农杆菌Ti 质粒
的番茄作为阳性对照；已知某转基因番茄植物能大量吸收Zn、Cd 等元素，且主要富集在根，生产应用时
需对其定期拔除并实施无害处理，原因是 （答出2 点即可）。
34．某动物体内含有某目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素
抗性基因（AmpR）、LacZ 基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。回答下列问题：
(1)保存基因技术的成熟使构建某种生物的基因文库成为可能，重组DNA 技术是保存生物基因的关键技术。
据图总结在受体菌中保存基因的基本步骤： （用→将各步骤连接）。
(2)在第③步中，为了使质粒DNA 能与目的基因连接，需要在混合物中加入 酶。若第②步用同一种限
制酶处理质粒和目的基因，仅考虑1 个目的基因和1 个质粒，则在第③步的混合物中，会形成 种含目
的基因的重组产物。进行第④步之前一般用Ca2+对大肠杆菌进行处理，目的是 。
(3)在仅添加了氨苄青霉素的培养基上筛选出的细胞不一定是目的细胞，请说明理由： 。请对筛选目的
细胞的操作提出完善意见： 。
35．人的血清蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲用乳腺生物反应器来大量生产HSA。下图所
示为HSA 基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新
霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4 种限制酶的切割位点。请据图回答问题：
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(1)人工构建pBR322 质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有 （答
出两点）等，
(2)若选用牛作为受体动物，可将人血清蛋白基因与 等调控组件重组在一起，通过 方
法将目的基因导入牛的受精卵中，然后使其发育成转基因牛。
(3)据图分析，在构建基因表达载体时，选择 作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因
和载体的正确连接效率，其原因是 。
(4)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322 质粒而非重组质粒）的干扰，
目的基因导入后，进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基含新霉素，乙培养基含新霉素和
氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上 （填“能”或“不能”）生存，在乙培养基
上 （填“能”或“不能”）生存。
(5)据下图分析，利用PCR 技术获取HSA 基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 ，需扩
增 次后得到HSA 目的基因。
36．已知镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β 肽链第6 位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代
替，导致功能异常；而人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。
乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。回答下列问题：
(1)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操
作 （填“属于”或“不属于”）蛋白质工程，理由是该操作 。
(2)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的 ，以其作为模板，在 酶的作用下
反（逆）转录合成cDNA．cDNA 与载体需在限制酶和 酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体
菌后进行表达。
(3)如图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程，质粒中lacZ 基因可使细菌利用加入培养基的物质X－
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gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色。图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别
是 或 。
(4)获取目的基因的方法除了图中用酶切的方法从细胞中分离以外，还可以通过 来获得。据图可知，
该目的基因的具体功能是 。
(5)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 ，培养一段时
间挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。
37．红景天中的HMA3 基因能编码Cd 转运蛋白，科研人员将红景天中的HMA3 基因转入栾树，以实现栾
树的定向改良，使其增强对Cd 的富集能力，从而更有效治理Cd 污染。实验的主要流程如下，其中Hygr为
潮霉素抗性基因，Kanr为卡拉霉素抗性基因，请回答：
(1)重组质粒的构建、扩增、保存
① 从红景天细胞中提取总RNA 为模板，进行RTPCR。其中PCR 的反应条件：98 ℃10 s，55 ℃30 s，72
℃1 min，35 个循环，其中55 ℃30 s 过程称为 。若模板双链cDNA 的数量为a 个，经过35 个循环
需要消耗引物的数量是 。
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② 为构建Cd 转运蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质
粒时用 酶切PCR 纯化产物(已添加相应酶切位点)及Ti 质粒，然后通过DNA 连接酶进行
连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。
(2)栾树愈伤组织的诱导
切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加 (填植物激素的名称)，放入培养箱，
经过21 d 的黑暗诱导，茎段经 形成愈伤组织。
(3)农杆菌介导转化体系的建立
将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加 的培养基筛选出转化成功的愈
伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。
(4)原生质体制备及目的基因的检测和鉴定
①取4 g 筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含
的酶解液中处理一段时间获得原生质体。
②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP 与Cd 转运蛋白构建融合蛋白的目的
是 。若要从个体生物学水平上进行目的基因的检测与鉴定，则可以检测比较转基因栾树
与野生型栾树 。
38．嗜热土壤芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB 酶）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地
应用，开展了以下实验：
I．利用大肠杆菌表达BgIB 酶
(1)PCR 扩增bglB 基因时，选用 的基因组DNA 作模板。
(2)如图为质粒限制酶酶切图谱。bglB 基因不含图中限制酶的识别序列。为使PCR 扩增的bglB 基因重组进
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该质粒，扩增的bglB 基因两端需分别引入限制酶 的识别序列。
(3)先用Ca2+处理大肠杆菌后再将上述构建好的表达载体与之混合，原因是： 。请提出
在个体生物学水平筛选出重组大肠杆菌的简要实验思路及依据： 。
Ⅱ．温度对BgIB 酶活性的影响
(4)温度会影响BglB 酶活性及其稳定性，从而影响其对纤维素的分解效率，该实验为实际生产应用中对反
应温度的控制提供理论依据。综合分析图1，2 实验结果，可得出实验结论：
。
注：酶的热稳定性是酶在一定温度下，保温一段时间后通过其活性的保持程度来反映的。
Ⅲ．利用分子育种技术提高BglB 酶的热稳定性
(5)在PCR 扩增bglB 基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB 基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热
稳定性高的BglB 酶的基因。与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比，上述育种技术获得热稳定性高
的BglB 酶基因的效率更高，其原因是在PCR 过程中 （写出一点即可）。
39．口服肿瘤疫苗可以借由肠道丰富的免疫环境来刺激强烈的抗肿瘤免疫反应，从而达到良好的免疫效果。
研究人员对大肠杆菌（肠道中最丰富的共生菌）进行基因工程改造获得工程菌。该工程菌可作为口服肿瘤
疫苗激活机体特异性免疫，实现肿瘤的预防和治疗。具体研究如下：
(1)疫苗载体构建及工程菌的制备
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部分肠道细菌能够分泌外膜囊泡（OMV），OMV 能穿越肠道上皮屏障，活化肠黏膜内丰富的免疫细胞。
研究人员利用如图1 所示元件构建表达载体转化大肠杆菌来制备工程菌：
（注：ClyA：OMV 表面特异蛋白的基因；Ag：肿瘤细胞表面特异性抗原基因；mFc：小鼠Fc 基因）
①选择大肠杆菌来制备工程菌的原因有 （答出两点即可）。
②图1 中，ClyA 基因的作用是 ；mFc 基因的表达产物能够与树突状细胞（DCs）表面的特异性
受体结合，从而提高DCs OMV 的能力。
(2)免疫效果调节及评估
为避免长期抗原刺激引起的免疫耐受，研究人员引入阿拉伯糖诱导型启动子来控制ClyA-Ag-mFc 融合蛋白
基因的表达，即只有在阿拉伯糖存在的情况下，才会诱导表达融合蛋白。为进一步证实按上述流程操作制
备的工程菌在人为可控条件下引发特异性免疫反应的效果，研究人员用健康的小鼠进行如下实验：
组
别
载体构建具体操
作
第0、4、8 天口
服阿拉伯糖
结果检测
A
组
空载体
+
第12 天，每组随机取5 只小鼠的等量的脾脏细胞与肺转移性
黑色素瘤细胞共培养，检测黑色素瘤细胞存活率，结果如图
2。
B
组
ClyA-mFc
+
c
组
ClyA-OVA
+
D
组
ClyA-OVA-mFc
（a）
E
组
（b）
（c）
（注：“+”代表口服、“-”代表不口服；OVA：肺转移性黑色素瘤细胞表面特异性抗原基因）
①D、E 组的操作和口服情况分别是a： ；b： ；c 。图2 结果说明
工程菌在人为可控条件下引发了特异性免疫反应，理由是 。
②研究人员在上述实验基础上，增加了实验小组口服阿拉伯糖的频率和天数，其目的是研究 。
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(3)该工程菌的开发为不同肿瘤的精准治疗提供了可能。参考本实验，利用下图设计针对治疗皮下结肠肿瘤
的工程菌表达载体元件 。
40．家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，将其添
加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，需使用图1 中质粒作为
载体，图2 为含W 基因的DNA 片段。回答下列问题：
(1)常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有 。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产
生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，请写出相关的反应式
。
(2)利用PCR 技术扩增W 基因时，用到的DNA 聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是 。扩增完
成后，常采用 法来鉴定PCR 的产物。为得到含W 基因的乳酸杆菌，可采用平板划线法纯化
乳酸杆菌，进行划线操作要注意： （写出2 点即可）。
(3)W 基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA 自身延伸的方向为5'→3'。下表是几种限制酶的识别序列及
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切割位点，图1、图2 标注了相关限制酶的酶切位点。为获得能正确表达W 基因的重组质粒，应分别使用
哪些限制酶对质粒和含W 基因的DNA 片段进行切割？ 。
限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
KpnⅠ
MfeⅠ
HindⅢ
识别位
点
5'
G↓AATTC
﹣
﹣
3'
3'
CTTAA↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GATCC
﹣
﹣
3'
3'
CCTAG↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GTACC
﹣
﹣
3'
3'
CCATG↑G
﹣
﹣
5'
5'
C↓AATTG
﹣
﹣
3'
3'
GTTAA↑C
﹣
﹣
5'
5'
A↓AGCTT
﹣
﹣
3'
3'
TTCGA↑A
﹣
﹣
5'
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