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专题05 基因工程
近几年高考题通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，
PCR 技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大：其中启
动子的插入位点和插入方向等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解
决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。预测2024 年难度系数
也会非常大，不排除出现细胞工程的可能。
1、（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果
酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1
为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
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(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂
质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
2、（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀
粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问
题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
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(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
3、（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为抗原来
制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原
代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
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能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．TAT 基因可以表达出一种转录激活因子，并能有效引导蛋白质穿透细胞膜。绿色荧光蛋白基因
（EGFP）是一种报告基因。研究人员通过构建TAT 基因与EGFP 的融合表达载体，在大肠杆菌内表达得到
纯化的TAT—EGFP 融合蛋白。将人工合成编码TAT 蛋白的DNA 片段插入载体pET28a 得到pET28a—TAT
重组质粒，再利用引物对EGFP 进行PCR，并利用限制酶EcoRI 和XhoⅠ连接得到pET28a—TAT—EGFP 重
组质粒，操作流程如图所示。回答下列问题：
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(1)图中TAT 基因结构中，每个磷酸基团直接连着 个脱氧核糖。构建pET28a—TAT 重组质粒使用
两种限制酶切割目的基因和PET28a 质粒的优点是 、 。
(2)PCR 扩增EGFP 基因的过程中，引物Ⅰ与引物Ⅱ的序列不能太短，且两者间不能 ，两种引
物的5'端必须分别添加 序列，以保证正确连接形成pET28a—TAT—EGFP 重组质粒。
(3)将上述重组质粒转化到大肠杆菌E·coliBL21 时，需先用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，目的是
。筛选转化成功的E·coliBL21 时，需要在LB 平板上添加 ，并运用平板划线法进行分离。
(4)将稳定的高表达菌株扩大培养后，再研究测定其融合蛋白表达的情况。利用超声波法裂解大肠杆菌，将
提取的全菌蛋白在100g/L 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，发现加入IPTG 组与未加入IPTG 组相比较，
泳带有明显的差异，如图所示：
注：1：未加入IPTG；2：37℃时0.2mmol/LIPTG 诱导1h；3～5：37℃时0.5mmol/LIPTG 分别诱导1h、
2h、3h
①电泳是指 。
②根据泳带结果可得出的结论是：IPTG 能够 ，在 的实验条件下作用
效果最佳。
(5)研究人员将TAT 和EGFP 融合在一起研究，目的除了用于筛选成功导入TAT 基因的受体细胞外，还可用
于 （举一例）等。
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2．将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖
转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG 基因敲
除质粒构建过程如图1 所示，其中KanR 是抗生素抗性基因，SacB 是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖
积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI 的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回
答下列问题：
(1)图1 中利用PCR 获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增 轮。从引物角度分析，扩增得到
上、下同源臂能拼接到一起的关键是 。ptsG 基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI 和EcoRI 双酶
切的优点是 。
(2)将敲除ptsG 基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、
含10%蔗糖培养基， （填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上
生长的为目的菌。
(3)将筛选得到的敲除ptsG 基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG 基因（如
图2）。
①两次同源重组共有 个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定
的引物进行PCR，通常将扩增产物利用 方法鉴定。
②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG 基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别
培养在以葡萄糖为唯一碳源的 培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌 。
3．毒物诱导型启动子S 在毒物诱导下可启动转录。研究人员将PCR 扩增得到的毒物诱导型启
动子S（如图2，图中箭头表示转录方向）插入图1 载体的P 区，构建表达载体并转入大肠杆菌，获得能够
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检测水中毒物的大肠杆菌M。回答下列问题：
(1)基因中启动子是 识别和结合的部位。
(2)切割质粒载体最好用两种限制酶，而启动子S 上不含有这些限制酶的酶切位点，需要在引物上添加。图
2 中引物I、Ⅱ分别加入限制酶 的识别序列。
(3)表达载体的P 区有一段核苷酸序列为“5'-ATCTCGAGCGGG—3'”，则对该序列进行剪切的XhoI（酶切
后产生黏性末端）识别的核苷酸序列（6 个核苷酸）最可能为 。
(4)用 处理大肠杆菌，便于转入构建好的表达载体。可以使用添加 的培养基筛
选转入载体的菌株。
(5)请写出利用大肠杆菌M 检测水体是否被毒物污染的实验思路，并预期实验结果及结论。
实验思路： 。
预期实验结果及结论： 。
4．干扰素是抗病毒的特效药，科学家利用基因工程和细胞工程技术制得了重组干扰素。请回答下列问题：
(1)获取干扰素基因的途径之一是：提取总RNA，利用 酶合成总cDNA，然后以cDNA 为模板，
采用PCR 技术扩增干扰素基因，已知干扰素基因一条链两端的序列为5'—AAGGGCGG—干扰素基因—GG
—GAAACT—3'，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是 （填字母）。若某一双链
cDNA 在PCR 仪中进行了4 次循环，需要消耗 个引物。
A．引物I 是5'—AAGGGCGG—3'，引物Ⅱ是5'—GGGAAACT—3'
B．引物I 是5'—AAGGGCGG—3'，引物Ⅱ是5'—AGTTTCCC—3'
C．引物I 是5'—CCGCCCTT—3'，引物Ⅱ是5'—GGGAAACT—3'
D．引物I 是5'—CCGCCCTT—3'，引物Ⅱ是5'—AGTTTCCC—3'
(2)图甲为获取的含有干扰素基因的DNA 片段，中间一段为干扰素基因。Sau3AI、EcoRI、BamHI 为三种
限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土
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壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti 质粒结构示意图。
为保证目的基因和质粒正确连接，切割含有目的基因的DNA 片段和质粒经常都会用到两种限制酶，在该
实验中，切割含有目的基因DNA 片段的两种限制酶和切割质粒的两种限制酶是否完全相同?
（填“是”或“否”），原因是 。
(3)若要在水稻胚乳细胞中提取重组干扰素，需要用到植物组织培养技术，该技术的原理是 ；若
要利用乳腺生物反应器来生产重组干扰素，则应将构建的基因表达载体导入 中。
5．筛选出能与SARS 病毒的S 蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S 蛋白末端添加TAP 标签（能特
异性地与人和哺乳动物体内IgG 类抗体结合），再利用该标签在病毒敏感细胞（如非洲绿猴肾细胞）中快
速纯化出S 蛋白及其相互作用的蛋白质，具体过程如下图。其中XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI 表示限制酶，
PCMV、T7 表示启动子，Kozak 序列是翻译起始因子结合位点的编码序列，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，
ori 表示复制原点。请回答问题：
(1)为成功构建重组质粒pcDNA3.1-S-TAP，在利用PCR 扩增S 基因时，应在S 基因的5'端引入 序列，
3'端删除 的编码序列。
(2)将S 基因和TAP 序列的扩增产物进行 鉴定，结果显示两个片段均得到扩增且与预期值大小相一
致。再经测序证实正确后，将这两个片段经限制酶切割并通过 酶连接定向克隆入质粒pcDNA3.1.
(3)重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 转染细胞前，需将vero 细胞置于37℃、 （填气体条件）下培养
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18~24h 进行传代。将传代的细胞与重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 以适宜比例混合，在转染试剂的作用下转染
细胞（实验组），为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。将转染24h 的细胞置于
载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血清稀释液和荧光素标记的羊抗人IgG 抗体稀释液，荧光显微镜下观察，
若 ，则说明S-TAP 融合蛋白在vero 细胞中得以表达。
(4)通过上述检测发现，S-TAP 融合蛋白表达量较低，其原因可能有 （填序号）。
①重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 在vero 细胞中大量复制
②S-TAP 融合基因在vero 细胞中转录出的mRNA 量较少
③S 基因与病毒宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA 的tRNA 数量不足
6．抗菌肽是一类具有广谱抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,细菌不易对其产生耐药性且无残留等,被认为
是理想的抗生素替代品。为了突破抗菌肽在畜禽养殖业广泛应用的瓶颈，我国研究人员运用小分子泛素蛋
白（SUMO）融合技术将含有重组抗菌肽LLv 基因的质粒导入大肠杆菌，表达融合蛋白SUMO-LLv,并优化
了表达条件,从而能高效获得重组抗菌肽 LLv。所用质粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)、LacZ 基因及
SacⅠ、XhoⅠ酶切位点等，其结构和构建重组质粒的过程如图1 所示。据此分析回答以下问题：
注：LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
(1)扩增LLv 基因时，PCR 反应体系中含有的酶有 ；已知该基因序列不含图1 中限制酶的识
别序列，为了使其能与已被酶切的质粒连接，需根据 设计引物。
(2)LLv 基因以a 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5'→3'。该基因内部没有SacⅠ、XhoⅠ这
两种酶切位点。图1 中酶切位点1 和2 所对应的酶分别是 。
(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，需用CaCl2处理大肠杆菌，其目的是 。
(4)为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal 等成分的培养基中进
行接种，结果如图2，该同学采用的接种方法是 。图2 中出现的 菌落即成功导入重组
质粒的大肠杆菌菌落，判断的理由是 。
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7．遗传学技术在突变检出领域中有着重要的贡献与作用。
(1)Muller-5 技术常用于果蝇X 染色体上突变的检出，已知果蝇棒眼对圆眼为显性，红眼对杏色眼为显性，
且控制这两对相对性状的基因皆位于X 染色体上。下图为利用Muller-5 品系雌果蝇检测基因突变的过程图。
不考虑交叉互换。
为检测出果蝇X 染色体上是否发生了突变，F1代需进行 （填“自由交配”“自交”或“单对交
配”）获得F2代。现有某纯合致死突变基因被检出，则在F2代中，最好选取性状为 果蝇进一步研究
该突变基因的作用。
(2)PCR 扩增法可用于基因点突变的检出，其基本原理是，如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用耐
热DNA 聚合酶无法延伸。已知某变异果蝇品种在Badh2 基因的EXON7 区出现了一个8bp 的碱基对缺失和
三个位置的碱基替换（其他序列与野生型一致），为了检测该变异，现设计以下四条引物进行PCR（如图
所示）。
除了题干中提到的引物、耐热DNA 聚合酶和DNA 模板外，PCR 反应体系中还需添加 。若在8bp 缺
失型的DNA 样本中同时加入四条引物进行PCR 扩增，实验结束后应使用 技术对产物进行检测，且理
论上可以得到 种序列不同的DNA 片段。
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(3)在检出突变基因后，科学家往往利用基因工程的方式获得该基因对应的蛋白质并进行下一步研究。如图
为构建重组质粒的流程示意图，在该过程中，应使用 对质粒S 进行酶切。将重组质粒通过转化导入
亮氨酸合成缺陷细菌后，应使用 （填“添加亮氨酸”或“不添加亮氨酸”）的选择培养基，同时挑
取 （填“有绿色荧光”或“没有绿色荧光”）的菌落进行进一步鉴定。
8．磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA 的动态变化，研
究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA 结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建
有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA 含量。无缝克隆技术连接DNA 片段的机理和
构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。
注：bar 为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5 核酸外切酶（从核苷酸链的外侧向内侧剪切核苷酸）沿 （填“5’→3’或“3’→5’”）
的方向水解DNA，其目的是形成 。T5 核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为
50℃，目的是 ，防止过度水解DNA。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是 ，过程③所需的酶有 。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有___（多选）。
A．不受限制酶切位点的限制
B．不需要使用PCR 技术扩增目的基因
C．不会出现目的基因的反接和自身环化
(4)PCR 扩增GFP 基因时需依据 的部分核苷酸序列设计引物R2。已知引物F1 的碱基序列是5’-
TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3’，据图分析扩增目的片段的所用的引物R2 可对应下表中的 （填序
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号）。
①
5’-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCG-3’
②
5’-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGACA-3’
③
5’-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATAA-3’
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有 的培养基上进行筛
选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，了解PA
的分布和含量。
9．肌肉生长抑制素MSTN 是骨骼肌生长发育负调控因子，MSTN 在肌肉组织中特异性表达，其活性的丧
失或降低会引起动物肌肉的过度发育，表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加，口感良好。因此，通过基
因敲除获得具有育种能力的MSTN 基因突变牛十分必要。
限制酶
KpnI
MfeI
HindIII
EcoRI
BamHI
识别序列
及切割位
点
图2
(1)科研人员利用打靶载体敲除牛MSTN 基因（以下简称M 基因），载体构建及M 基因敲除过程如图1 所
示。为构建能够敲除M 基因的打靶载体，需先设计引物，通过PCR 技术扩增M 基因。在引物上添加PstI
限制酶识别序列，限制酶识别序列添加至引物的 （填“5'端”或“3'端”），据图1 应选择的引物是
（从a、b、c、d 中选择），将得到的PCR 产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。
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(2)为将抗生素抗性基因neo（抵抗抗生素新霉素）从原载体中切下，随后插入M 基因中。据上图1 及表中
限制酶信息，应选择限制酶 分别对M 基因和neo 基因进行酶切，并用 连接，完成打靶载体构建。
(3)将构建好的打靶载体通过 法导入牛受体细胞中。据图1，受体细胞基因组中的M 基因通过交换被替
换为打靶载体上插入neo 基因的M 基因片段。交换后的打靶载体以及未成功交换的打靶载体（线形DNA
片段）很不稳定，在相关酶的作用下随即降解。
(4)载体可整合到受体细胞基因组DNA 的其他部位，引发K 基因表达，使细胞在加入物质Q 的培养基上无
法存活。在选择培养基中除有细胞培养的必需成分外，还需要加入物质Q 和 ，可筛选出成功敲除M 基
因的受体细胞，其原因是 。
10．谷氨酸脱羧酶在植物生长发育和逆境胁迫中具有重要作用，OsGAD2 是水稻中一种能编码谷氨酸脱羧
酶的基因。南昌大学科研团队用CRISPR/Cas9 技术获得了几个OsGAD2 基因敲除的纯合突变体，发现敲除
了OsGAD2 的突变体水稻在株高、粒长和粒重上都有显著提高。回答下列问题：
(1)科研人员首先将OsGAD2 基因编码区的片段和CRISPR/Cas9 载体连接，得到重组载体，这个过程需要
用到的酶是 。导入受体细胞后，载体上的OsGAD2 基因片段可以转录出一段引导RNA 序列
（sgRNA），sgRNA 可以和受体细胞中OsGAD2 基因的相应位置（靶点）发生 ，从而引导
Cas9 蛋白特异性诱导靶点发生碱基随机突变。若突变后的0sGAD2 基因表达出的蛋白质比原来更短，可能
原因是 。突变后OsGAD2 基因往往会失去原有功能，所以重组载体也可以叫“OsGAD2 基
因敲除载体”，该载体的部分结构细节如下图所示。
(2)用农杆菌转化将OsGAD2 基因敲除载体导入愈伤组织细胞，将转化后的愈伤组织转接培养基上进行培养。
为筛选出含有OsGAD2 基因敲除载体的愈伤组织细胞，培养基中需要加入 。同时，
加入抗生素还可以起到 作用。
(3)要检测是否成功诱变，最好选取下图中的引物 （填编号），以受体细胞染色体DNA 为模
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板进行PCR，对扩增出的产物进行DNA 分子测序。PCR 每个循环有3 个步骤，其中 这个步
骤需要将温度降到50℃左右，其目的是
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