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大题05 基因工程类
1.基因工程的概念
按照人们的愿望，通过体外DNA 重组和转基因技术，在DNA 分子水平上对生物进行设计和施工，赋予生
物新的遗传特性，创造新的生物类型和生物产品。
2.基因工程的基本工具
限制性核酸内切酶：主要从原核生物中分离纯化，能识别特定核苷酸序列并断开磷酸二酯键，产生黏性末
端或平末端。
DNA 连接酶：E·coli DNA 连接酶只能连接互补黏性末端，T4 - DNA 连接酶能连接两种末端，但平末端连
接效率低，二者都缝合磷酸二酯键。
载体：常用质粒，也可用λ 噬菌体衍生物、动植物病毒等。载体需能在受体细胞中复制并稳定保存，有多
个限制酶切点和标记基因，且对受体细胞无伤害。
3.基因工程的基本操作程序
包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
4.基因工程的应用
在植物方面可培育抗虫、抗病、抗逆植物及改良品质；在动物方面能提高生长速度、改善畜产品品质、生
产药物；还可用于基因治疗。
5.蛋白质工程
以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过基因修饰或合成，对现有蛋白质改造或制造新
蛋白质。
6.关于基因工程类高考生物的考试趋势，可能有以下几点：
情境更贴近科研和生活实际：如2024 年全国甲卷第38 题以基因工程表达目的蛋白为背景，考查关键环节
的原理和目的。未来可能会出现更多以最新科研成果、农业生产、医学实践等为情境的题目，考查学生运
用知识解决实际问题的能力。
注重实验探究能力考查：像2024 年全国甲卷第30 题要求设计实验方案验证相关结论，考查学生实验设计、
分析等能力。后续可能继续加大对实验探究能力的考查力度，包括实验思路设计、实验结果预测与分析等。
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考查内容更深入和综合：基因工程知识点较多，高考可能会将基因工程与细胞工程、胚胎工程等其他生物
技术综合考查，也可能对基因工程某一环节的原理、操作细节等进行更深入的考查，如质粒载体的双酶切
原理等。
关注新技术新进展：随着基因编辑等新技术的发展，高考可能会引入CRISPR - Cas9 等相关内容，考查学
生对新知识的理解和应用能力。
典例一： 基因工程的工具及其操作步骤
（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的
多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小
段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用
同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点
可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟
乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，
因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，再重新导入。研究人员在UGA 基因序列两端加上酵母
菌DNA 中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA 基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序
列的配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
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（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。
基因工程的工具
限制酶：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子。例如，EcoRⅠ限
制酶识别GAATTC 序列，在G 与A 之间切割。切割后通常产生黏性末端，也有产生平末端的，如SmaⅠ限
制酶切割后产生平末端。
DNA 连接酶：将双链DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
载体：常用的载体是质粒，它是一种小型的环状双链DNA 分子。具备能自我复制、有多个限制酶切点、
有标记基因等特点，以便目的基因的插入、筛选和在受体细胞中稳定存在并表达。
基因工程的操作步骤
目的基因的获取：可从基因文库中获取，包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA 文库）；也可用PCR
技术扩增目的基因，该方法需要已知目的基因的部分序列以便合成引物，在耐高温的DNA 聚合酶作用下
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大量扩增目的基因；还可以人工合成目的基因，如当基因较小，核苷酸序列已知时，可通过化学方法直接
人工合成。
基因表达载体的构建（核心步骤）：将目的基因与载体用同种限制酶切割，产生相同的黏性末端或平末端，
再用DNA 连接酶连接，形成重组DNA 分子。基因表达载体包含目的基因、启动子、终止子和标记基因等
元件。启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动目的基因转录；终止子使转录在需要的地方停止；
标记基因用于筛选含有目的基因的受体细胞。
将目的基因导入受体细胞：植物细胞常用农杆菌转化法，利用农杆菌的Ti 质粒可将目的基因导入植物细胞
并整合到染色体DNA 上；动物细胞常用显微注射技术，将含有目的基因的表达载体注射到受精卵中；微
生物细胞常用感受态细胞法，用Ca²⁺处理微生物细胞，使其成为感受态细胞，能吸收周围环境中的DNA
分子。
目的基因的检测与鉴定：分子水平上，用DNA 分子杂交技术检测目的基因是否插入受体细胞的染色体
DNA 上，用分子杂交技术检测目的基因是否转录出mRNA，用抗原 - 抗体杂交技术检测目的基因是否翻
译成蛋白质。个体水平上，可通过观察受体生物是否表现出相应的性状来鉴定，如抗虫棉是否能抗虫等。
（2023·湖南·统考高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样
本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码
产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色
体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1 和1-2 生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率
是 。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
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正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR 扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为
）酶切检测甲
基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6 个碱基即可）。用上
述引物扩增出家系成员Ⅱ-1 的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的
基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低
NTDs 的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1 个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为
0.4~1.0mg.d-1，NTDs 生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇
（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
典例二：生物技术伦理
（2021·河北·统考高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物
修复技术将土壤中的Cd 富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可
降低土壤中Cd 的含量。为提高植物对Cd 污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd 转运蛋白（YCF1）
基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，
这个群体称为 。
（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体
中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1 基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
。研究者进一步获得了转YCF1 基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是
。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd 污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同
器官中Cd 含量（图2）。据图1 可知，与野生型比，转基因植株对Cd 具有更强的 （填“耐
性”或“富集能力”）；据图2 可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd 污染最
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为方便有效。
（5）已知YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高
Cd 环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd 污染土壤修复植物
的优势在于 （写出两点即可）。
克隆技术引发的伦理问题
克隆人：分为治疗性克隆和生殖性克隆。治疗性克隆是利用克隆技术产生特定细胞和组织用于治疗疾病，
存在伦理争议较小；生殖性克隆是克隆出完整的个体，引发诸多伦理问题，如违反人类伦理道德、冲击传
统家庭观念、可能导致基因单一性等。许多国家禁止生殖性克隆人，但对于治疗性克隆存在不同观点和政
策。
试管婴儿技术引发的伦理问题
设计试管婴儿：在试管婴儿技术基础上，对胚胎进行基因检测，选择符合特定要求的胚胎植入母体孕育。
这可能引发对基因选择、“定制婴儿”等问题的担忧，如是否会导致基因歧视，是否违背自然规律和伦理
道德等。而普通试管婴儿主要是解决不孕不育问题，伦理争议相对较小。
基因编辑技术引发的伦理问题
人类基因编辑：涉及对人类生殖细胞基因进行编辑，可能带来不可预测的遗传风险，改变人类基因库的多
样性。如果被滥用，可能导致“设计婴儿”等违背伦理的现象出现，还可能引发社会歧视等问题。同时，
在非生殖细胞基因编辑用于疾病治疗方面，也存在如何规范应用以避免过度治疗和伦理风险的问题。
生物武器相关伦理问题
生物武器的危害：生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂等，具有传染性强、污染面广、难以防治等特
点，会对人类生命和健康造成极大危害，严重违反伦理道德和国际公约。禁止生物武器的使用是国际社会
的共识，各国应共同努力防止生物武器的扩散和滥用。
（2022·北京·统考高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E 物质）污染会
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导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细
胞等存在E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济
且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。
(2)为监测E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE 和酵母来源的UAS 是
两种诱导型启动子，分别被E 物质-受体复合物和酵母来源的Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1 相比，方案2 的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，
需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将
选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子： 。
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P 生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P 肌）
Ⅱ.基因：
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM 不育的原因是：成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM 不育的目的是 。
1.（2022·江苏·统考高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤
毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
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(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能
是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进行了PCR 扩
增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，溶
液中添加NaC1 至2．0mo1/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在 催化
下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，
可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M 重组质粒（在
EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ
中融合片段M 中有白色的箭头，代
表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR 目的产物约为 bp。
确保M 及连接处序列正确，Y-M 的
连接处上游含有Hind III+EcoR V 的
识别序列，下游含有EcoR V+BamH
I 的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细
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胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛
基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量
相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环
数）。从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
倍。
2.（2022·重庆·统考高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途
径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui 基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
(1)花药培养能缩短育种年限，原因是 。在步骤I 的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将
其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I 中能用于制造人工种子的材料是
。
(2)步骤II 中，eui 基因克隆于cDNA 文库而不是基因组文库，原因是 ；在构建重组Ti 质粒时使用
的工具酶有 。为筛选含重组Ti 质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴
定后，应侵染I 中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui 基因的鉴定方法是 ，
移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
3.（2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃
的 中保温一段时间，其目的是 。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂
布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大
小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、
等技术获得。
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（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，
二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转
基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培
养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过
观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短
等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
4.（2023·全国·统考高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因为
材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP
基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表
达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作
用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧
光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变基因
进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白基
因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为抗原
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来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原
代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
5.（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分
结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的
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（填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
6.（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径
I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了
L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和
BrdU 均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一
组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的百分
比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
(3)为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，
即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌
体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于
细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细
胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选
目标小鼠→ →获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的
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三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被标
记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
7.（2021·福建·统考高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛
存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT 基因导入大肠杆菌构建
工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA 的核苷酸序列设计了相应的引物（图1 甲），通过PCR 扩增MT 基因。已知A 位
点和B 位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
(2)本实验中，PCR 所用的DNA 聚合酶扩增出的MT 基因的末端为平末端。由于载体E 只有能产生黏性末
端的酶切位点，需借助中间载体P 将MT 基因接入载体E。载体P 和载体E 的酶切位点及相应的酶切序列
如图1 乙所示。
①选用 酶将载体P 切开，再用 （填“T4DNA 或“E·coli81DNA”）连接酶将MT 基
因与载体P 相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT 基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E 进
行酶切，将切下的MT 基因和载体E 用DA 连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处
理的大肠杆菌，筛出MT 工程菌。
(3)MT 基因在工程菌的表达量如图2 所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT
工程菌，理由是 。
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8.（2021·天津·统考高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能
力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工
程菌株。下图1 为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2 为构建表达载体时所需的关键条件。
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好的ATG，且能通
过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1 和2。其中引物1 的5′端序列应考虑 和
。
②将上述PCR 产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有
，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组
质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
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③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿
酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提
高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件
B．使用乳酸菌LDH 基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
9.（2021·北京·统考高考真题）新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗
是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病
毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S 基因连接到位于载体上的
腺病毒基因组DNA 中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
(1)新冠病毒是RNA 病毒，一般先通过 得到cDNA，经 获取S 基因，酶切后再连接到载体。
(2)重组疫苗中的S 基因应编码________。
A．病毒与细胞识别的蛋白
B．与病毒核酸结合的蛋白
C．催化病毒核酸复制的酶
D．帮助病毒组装的蛋白
(3)为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可
以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→ →
→诱发特异性免疫反应。
(4)重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA
不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因 。
10.（2021·湖南·统考高考真题）M 基因编码的M 蛋白在动物A 的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将
外源DNA 片段F 插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活
的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：
（1）在构建含有片段F 的重组质粒过程中，切割质粒DNA 的工具酶是 ，这类酶能将特定部位
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的两个核苷酸之间的 断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A 成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目
的是 。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是 。从早期胚胎中分
离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为 （答出两点即可），功能上具有 。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制
备M 蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A 中M 基因是否失活的实验思路 。
11.（2024·安徽·芜湖高三第一次摸底）1997 年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到 2015 年，
我国已育成转基因抗虫棉新品种100 多个，减少农药用量 40 万吨，增收节支社会经济效益 450 亿元。
(1)培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤： 、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定。
(2)研究表明，苏云金杆菌中的 Bt 抗虫蛋白基因，是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，其控制合成
的 Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的 性环境中才能表现出毒性。Bt 抗虫蛋白被分解为多肽
后，与害虫肠上皮细胞的 结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
(3)明确了目的基因后，获取目的基因的方法有多种，其中，利用 PCR 获取是常用的一种方法。以下关于
PCR 说法正确的是 （多选）
A．PCR 过程需提供DNA 模板
B．PCR 过程中新链的合成只能从
端→
端
C．PCR 过程需打开磷酸二酯键
D．可以利用 PCR 技术进行目的基因扩增
(4)在基因表达载体的构建过程中，若目的基因经限制酶切开后呈图1 所示的末端，那么图2 中的载体质粒
pCLY15 需用 和 切开，才能与目的基因片段高效连接。
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(5)在基因工程的基础上，延伸出来了第二代基因工程——蛋白质工程。天然蛋白质合成的过程是按照中心
法则进行的，蛋白质工程的基本思路与之 （填“相同”或“相反”）。蛋白质工程是指以
作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白，或制造一种新的蛋白，以满足人类生产和生活的需求。
12.（2024·安徽六校教育联合体高三模拟考） 科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌工程菌，成为监测
残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如图1 所示，天然大肠杆菌不具备图1
中所示基因。启动子有利于RNA 聚合酶识别并启动特定基因的转录，CFP 蛋白可在一定条件下发出荧光。
（1）在上述研究中，必须导入天然大肠杆菌的目的基因有__________（填写编号）。
①TetR 基因 ②GFP 基因 ③四环素合成相关基因 ④RNA 聚合酶基因
（2）据图1，当环境中不含四环素时，该大肠杆菌工程菌__________（填“能发出”或“不发出”）荧光。
试概述该种四环素检测方法的原理__________。
（3）图2 表示2 个DNA 片段、质粒及其上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布情况；其中质粒上的
Ampr代表青霉素抗性基因。下表为相关限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点。
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限制酶
EcoRI
XbaI
SpeI
BamHI
识别序列及
切割位点
5'-G↓AATFC-3'
3'-CTTAA↑G-5'
5'-T↓CTAGA-3'
3'-AGATC↑T-5'
5'-A↓CTAGT-3'
3'-TGATC↑A-5'
5'-G↓GATCC-3'
3'-CCTAG↑G-5'
若要拼接DNA 片段1 和2，结合图2 和表中信息
编号
①
②
③
④
拼接位点处的碱基
序列
5'-TCTAGA-3'
3'-AGATCT-5'
5'-TCTAGT-3'
3'-AGATCA-5'
5'-ACTAGA-3'
3'-TGATCT-5'
5'-ACTAGT-3'
3'-TGATCA-5'
，在特定工具酶作用下能成功拼接的位点处碱基序列为__________（填写编号）。
（4）为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP 的第65 位丝氨酸突变成苏氨酸后，增加
了绿色荧光稳定性和强度。该项技术属于__________（填写编号）。
①基因的定点突变 ②基因的定向进化 ③细胞工程 ④蛋白质工程
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