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专题05 生物技术与工程模块
近几年山东卷25 题通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，
PCR 技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大；其中启动子
的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运
用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。
1、（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的
（填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
2、（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶识别并降解，药
物A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融
合蛋白FLAG-P 和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨基
端，使融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介质结合，但不影响P 或P△的功能。
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(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物需满足的条件是
、为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引
物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，
其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA 序列正
确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同。据图甲分析，
出现该问题的原因是 。修改扩增P 基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修
改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A 和UBC 按照图乙中的组合方式分成5 组。各组
样品混匀后分别流经含FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC 抗体检测，检测结果如图
丙所示。已知FLAG-P 和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是 ；
由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A 治疗该病的机理是 。
3、（2021·山东·高考真题）人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结
合 BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ 基因表达的抑制，可对
某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达
载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
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（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图
可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。
本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表
达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细
胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R
扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的
结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
山东高考生物试卷情境化试题以科技论文为情境材料的居多，其次是以生产生活实际为材料。纵观近三年
的山东高考题，25 题以科技论文为情境的频率比较高，也有基础知识的考查，但是分值不多，在有限的时
间内，很多同学做不到最后一个大题，或者是走马观花式的做了，没有深入研究题干信息，匆匆作答，正
答率可想而知。针对这种情况，在平时的训练中，多搜集科技论文背景素材，比如各种PCR 技术可以做专
题复习，多总结归纳，对于考查基础知识的填空，做到零失误，提高生物总成绩。
1．人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶
性肿瘤细胞的hCGβ 基因也有表达，hCGβ 与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ 疫苗已成
为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题：
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注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1 为甲醇氧化酶基因的启动子，
只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。
(1)图示hCGβ 基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并
保证连接的方向性，可在其两端添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10 个核苷
酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序
列是5＇ -3＇。
(2)图示 hCGβ 基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。从生产控制的角度分析，选用
AOX1 作为hCGβ 基因启动子的优点是 。
(3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌 的特点，从而实现重组DNA 的扩增，然后在含有
的培养基中筛选得到含hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。
(4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a.氨苄青霉素
b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ 基因表达载体的目的菌株。将此
菌株扩大培养后，离心取上清液，依据 原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ 蛋白，则说明hCGβ
基因得以表达。
2．“凤凰虫”是一种重要的药用昆虫，其H 基因编码的抗菌肽HI-3 具有良好的抗菌、抗癌作用。科研人
员开展了利用酵母菌生产抗菌肽HI-3 的一系列研究。
(1)利用PCR 技术从“凤凰虫”基因组中扩增H 基因时发现，引物长度越短，扩增得到的DNA 片段种类越
（填“单一”或“复杂”），原因是 。
(2)已知H 基因编码链序列：5'- GGATCCTCTAGA∙∙∙∙∙∙TCGAGATGCTGCTG -3'，PCR 扩增H 基因时，结合
到编码链上的引物序列是 （要求：按照5'→3'方向写出5'端的前8 个碱基）。
(3)由于抗菌肽HI-3 会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H 基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了
最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3 对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA 中
插入P 基因（指导合成P 蛋白）和S 基因（指导合成S 蛋白），使质粒上H 基因的表达受红光控制。红光
调控H 基因表达的原理如下图所示。
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由图可知，S 蛋白与启动子Jub 结合后会抑制 发挥作用，导致H 基因无法转录；红光下，P 蛋白能
够 ，解除S 蛋白的抑制作用，从而启动H 基因的表达。
(4)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F 蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而
沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E 蛋白的基因
（E1、E2），使F 基因的表达受到蓝光控制，如下图所示。
图中E2 基因持续性表达少量的E 蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力；蓝光照射后，F 基因的表达
被激活，原因是 。
3．为获得转R—GFP 融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因（RFP）插入含Gata3 基因的载体
中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成
像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP 转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，
A、B、C、F、R 为不同引物。
(1)在PCR 反应溶液中常添加 ，其作用是 。在利用PCR 扩增RFP 编码区序列的过程中，需要设计引
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物F 和R，在两个引物的（填“3'”或“5'”） 端需分别插入 的限制酶识别序列，以使RFP 基因能正确
插入载体中。用于扩增RFP 编码区序列的引物需满足的条件是 。
(2)在RFP 基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有 。
(3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，选取1～5 五只小鼠，从中提取含
Gata3 基因的相关DNA 片段，设计了引物A 和C 用于PCR 扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则 小
鼠是Gata3—RFP 基因纯合子小鼠；若用引物A 和B 进行PCR 扩增， （填“能”或“不能”）区分
RFP 转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是 。
(4)为制备大量单链DNA 片段，研究人员常采用不对称PCR 技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，
经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引
物）的延伸产物，结果获得大量单链DNA（ss—DNA）。若反应体系中原有100 个模板DNA，最初10 个
循环后限制性引物耗尽，再进行20 个循环，理论上可制备ss—DNA 个（用科学计数法表示），在这30
个循环中ss—DNA 的产生量主要受 的影响。
4．植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生长和发育，决定作物的
产量和品质。SUT 基因家族中的StSUT2 基因主要在花和老叶中表达，科学家借助Gateway 克隆技术通过
构建StSUT2 植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway 克隆技术包括TOPO 反应和LR 反应（如
图一、图二所示）。
(1)获得大量StSUT2 基因：首先从植物的 细胞中提取总mRNA，经过 过程获得cDNA，根据StSUT2
基因两端的序列设计引物进行PCR 扩增，获得大量的StSUT2 基因。
(2)构建入门载体：利用图一中的TOPO 反应将目的基因PCR 产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被
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拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，
并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保
StSUT2 基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2 基因时，可在引物中引入5'— —3'序列。
(3)构建StSUT2 基因超表达载体：LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和超表达载体上的attR 位点，将入
门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，得到所需载体。请结合图二中的LR 反应
过程，在下图三的方框中画出含StSUT2 基因的超表达载体 。
(4)StSUT2 基因超表达及检测：通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2 基因超表
达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定StSUT2 基因是否成功超量表达。
5．某研究所为研究水稻叶肉细胞中miR5810（一种小分子RNA）和MRLP6 蛋白之间的关系，分别探究了
两者对水稻光合色素含量和净光合速率的影响，结果如图一所示。同时，研究人员利用双荧光素酶技术探
究了转录因子NFYB7 与miR5810 基因表达的关系。该项研究揭示了一种调节光合作用的分子机制，为水
稻高光合育种提供了新思路。
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(1)水稻中的光合色素分布在 ，可用 提取。矿质元素是指除C、H、O 以外，植物根系从土壤中吸收
的元素，合成叶绿素分子所需要的矿质元素是 。
(2)miR5810 会 （填“促进”或“抑制”）MRLP6 蛋白合成， （填“升高”或“降低”）光合色素
的含量，进而调节光合作用速率。
(3)双荧光素酶技术可通过测定荧光强度的比值（LUC/REN），实现对目标基因表达水平的定量分析。LUC
和REN 是两种催化不同底物的荧光素酶，通过分别添加不同的荧光素测其荧光强度，计算荧光强度之比。
相比较NFYB7 基因表达载体（如图二）与双荧光素酶基因表达载体（如图三）共转化细胞，只转化双荧
光素酶基因表达载体的细胞中，荧光强度LUC/REN 比值降低，原因是 。
(4)综上所述，NFYB7—miR5810—MRLP6 调节水稻光合作用速率的可能分子机制是 。
6．研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，
从而引起细胞死亡。TAT 是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD（多肽）的融合
蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA 作为抑制肿瘤细胞增
殖的活性分子，利用TAT 的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD 的作用减轻RTA 对正常细胞
的毒性，分别构建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融合基因的表达载体，并成功得到
相关融合蛋白。
(1)可采用PCR 的方法获取融合基因TAT-RTA，需要根据TAT 和RTA 基因设计引物，引物的作用是
。已知RTA 基因和欲得到的TAT-RTA 融合基因的结构如图1 所示，TAT 基因编码链序列
5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1 的5′端
加入 酶切位点，引物2 的5′端加入 酶切位点，利用TAT 和RTA 核酸序列设计引
物时，要求在RTA 蛋白的前端引入TAT 短肽，请根据要求写出引物1 （写出引物5′端的12 个
碱基即可）。
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(2)载体的部分结构如图2 所示，His 标签由连续的6 个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，
将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但是在研究时，发现融合
蛋白中没有His 标签蛋白，据图分析原因是 。可通过引物2 的特殊设计使His 标签正常表达，
请结合图1 和图2 写出引物2 （引物中如需添加碱基补足对应的密码子，可以添加任意碱
基）。
7．fat1 基因和fat2 基因控制的酶分别调控两种多不饱和脂肪酸的合成，两种酶的共同表达对于细胞内多不
饱和脂肪酸的合成具有协同效应。2A 肽是一种来源于病毒的短肽，受2A 基因序列控制。2A 基因的转录
产物可以通过“核糖体跳跃”断开位于2A 肽尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，将2A 基因编码的蛋白分割
成2 个独立蛋白。图甲表示科研人员利用重叠延伸PCR 技术成功构建融合基因fat1—2A—fat2 的过程。图
乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1~F4、R1~R4 表示引物。通过基因工程成功实
现了fat1 基因和fat2 基因在小鼠体内的共同表达，大大提高了细胞内多不饱和脂肪酸的含量。
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(1)利用PCR 技术可以实现在体外快速大量进行DNA 扩增，其与细胞内DNA 复制的共同点是 （答出2
点）。若图乙中融合基因的b 链为模板链，则图甲PCR1 中的引物甲与图乙中的引物 的绝大部分序列相
同。
(2)PCR1 和PCR2 需要分开单独进行，原因是 。PCR3 不需要引物，高温加热后fatl—2A 和2A—fat2 的
双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是 （填序号）形成的杂交链。
(3)为了确定fatl 基因连接到质粒中且插入2A 序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图
乙中的引物_ 。融合基因经下图中的过程表达产生fatl 和fat2 两种蛋白，经检测发现通过该技术表达的fat1
蛋白的分子量较正常fat1 蛋白的分子量大，依据该融合基因的结构和表达原理推测，原因是 。
8．磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA 的动态变化，研
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究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA 结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建
有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA 含量。无缝克隆技术连接DNA 片段的机理和
构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。
注：bar 为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5 核酸外切酶沿 （填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成 。
T5 核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性， 。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是 ，过程③所需的酶有 。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。
A．不受限制酶切位点的限制
B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变
C．操作相对简单，成功率高
D．不需要使用PCR 技术扩增目的基因
(4)PCR 扩增PABD 基因时需依据 的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的片段的所用的引物
F1 和R2 可对应下表中的 （填序号）。
①
5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´
②
5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´
③
5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´
④
5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有 的MS 培养基上
进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，
了解PA 的分布和含量。
9．经过不懈努力，我国科研人员从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控
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制高蛋白含量的优良基因 THP9，将此高蛋白基因克隆出来并转移到玉米细胞内，获得转基因高蛋白玉米
新品种。
EcoRⅠ
BamHⅠ
KpnⅠ
MfeⅠ
HindⅢ
5′-G↓AATTC-3′
5′-CTTAA↑G-3′
5′-G↓GATCC-3′
5′-CCTAG↑G-3′
5′-G↓GTACC-3′
5′-CCATG↑G-3′
5′-C↓AATTG-3′
5′-GTTAA↑C-3′
5′-A↓AGCTT-3′
5′-TTCGA↑A-3′
(1)THP9 基因游离的磷酸基团侧为 （填“5′”或“3′”）端，已知图中THP9 基因转录方向为
从左往右，则 THP9 基因转录时的模板链是 链。
(2)构建基因表达载体时，若科研人员需将 THP9 基因整合到如图质粒上，应使用限制酶
切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含 THP9 基因的DNA 片段，以获得能正确
表达THP9 基因的重组质粒。
(3)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加 的选择培养基上培养，培养后获得的菌
落不能判定是否含有重组质粒，原因是 。
(4)研究人员常用DNA 分子杂交技术检测 THP9 基因有没有整合到受体细胞的染色体 DNA 上。检测时常
使用 标记的目的基因单链片段作为探针。
10．CRISPR-Cas12a 系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas 系统，该系统主要包含crRNA
和Cas12a 蛋白两部分，crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA 序列，从而引导Cas12a 蛋白到相应位置剪
切DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a 系统对宫颈癌细胞中的KIFC1 基因进行敲除，来探讨KIFCI 基
因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa 细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含
种核苷酸；细菌细胞中的 也能起到类似Cas12a 蛋白的作用。若要将KIFCI 基因从目标DNA 上
剪切下来，需要设计 种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458 质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中
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P1 的碱基序列为5′ 3′（写出前9 个碱基）。采用PCR 技术对一个DNA 进行扩增时，第n 次循
环共需要引物 个。
(3)
在目的基因
与PX458 质粒连接时，可用 （填“E.coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a 重组载体成功转染至HeLa 细胞，与对照组相比，实验组中KIFCl 蛋白表达量如图2 所
示，细胞数目的变化如图3 所示，由此可得出的结论是 ，判断依据是 。
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