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专题05 生物技术与工程模块
1.发酵技术、细胞工程、胚胎工程的命题多以选择题呈现，基因工程的命题多以简答题呈现。
2.试题情境以下列几种居多：(1)以单克隆抗体为情境考查细胞工程。
(2)以胚胎移植为情境考查胚胎工程。
(3)最新的文献资料为情境考查基因工程。
1、（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀
粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问
题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
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(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
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（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA 为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
2、（2022·辽宁·高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N 蛋白胞外段，制备相应的
单克隆抗体，增加其对N 蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N 蛋白胞外段抗原制备，流程如图1
(1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 。用脂质体将重
组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 （填“双分子层中”或“两
层磷脂分子之间”）。
(2)质粒在包装细胞内组装出由 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化
N 蛋白胞外段。
Ⅱ．N 蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2
(3)用N 蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 酶处理，制成细胞悬液，置
于含有混合气体的 中培养，离心收集小鼠的B 淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
(4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔板，进行 培
养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N 蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂
交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ，提取单克隆抗体。
(5)利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ，实现特异性治疗。
【答案】(1) 检测目的基因是否成功导入受体细胞 双分子层中
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(2)蛋白质外壳和含N 蛋白胞外段基因的核酸
(3) 胰蛋白酶或胶原蛋白 CO2 培养箱
(4) 克隆化 抗原抗体杂交 细胞培养液
(5)抗体-药物偶联物/ADC
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已
经免疫的B 淋巴细胞；诱导B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，
筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从
培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特
异性抗体的细胞群。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
【详解】（1）构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性
基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体
双分子层中（即磷脂双分子层）。
（2）由于目的基因为N 蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N 蛋白胞外段基因的
核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N 蛋白胞外段。
（3）进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有
95%空气和5%的CO2 混合气体的CO2 培养箱中培养。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔板，进行克隆化培养
和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N 蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的
单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。
（5）利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。
3、（2021·辽宁·高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫
颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为
0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR 反
应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
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“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
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(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】(1)逆转录
(2) EcoRI PvitⅡ T4DNA 连接酶
(3)感受态
(4)3
(5)G2/M
【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI 在质粒上有
两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4 中G1 期和S 期细胞减少，而G2 期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
【详解】（1）利用RNA 获得cDNA 的过程称为逆转录。
（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间
存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI 在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI 和PvitⅡ两种不
同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA
连接酶连接质粒和目的基因。
（3）转化时用CaCl2 处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
（4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基
因和质粒，如果用EcoRI 和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于
phb2 基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
（5）比较图4 中G1 期和S 期细胞减少，而G2 期细胞数目明显增多，说明了G1 期和S 期细胞可以进入
G2 期，而G2 期的细胞没有能够完成分裂进入G1 期，因此PHB2 蛋白应该作用于G2/M 期。
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【点睛】本题考察基因工程的知识，需要考生分析质粒的酶切位点，结合目的基因转入的位置进行分析，
结合题干中目的基因的大小分析电泳图。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．某科研团队以一种对四环素有抗性的天然大肠杆菌作为受体，通过转基因技术获得了一种大肠杆菌工
程菌，可作为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”。其监测原理如图1 所示。天然大
肠杆菌不具备图1 中所示基因。
回答下列问题：
(1)在上述研究中，必须导入天然大肠杆菌的基因有 （填写编号）。
①四环素合成基因②RNA 聚合酶基因③TetR 基因④GFP 基因
(2)据图1，当环境中含四环素时，成功构建的大肠杆菌工程菌 （填“能发出”或“不发
出”）绿色荧光，该过程的机制为 。
(3)图2 表示2 个DNA 片段、质粒及其上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布情况；其中质粒上的Ampr
代表青霉素抗性基因。
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下表为相关限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点。
限制酶
EcoRI
XbaI
SpeI
BamHI
识别序列及切割位点
5'-G↓AATTC-3'
3'-CTTAA↑G-5'
5'-T↓CTAGA-3'
3'-AGATC↑T-5'
5'-A↓CTAGT-3'
3'-TGATC↑A-5'
5'-G↓GATCC-3'
3'-CCTAG↑G-5'
若要拼接DNA 片段1 和2，结合图2 和表中信息，应使用 和 分别切割DNA 片段1 和
2，成功拼接的位点处碱基序列可以表示为 （填编号）。
编号
①
②
③
④
拼接位点处的碱基序列
5'-TCTAGT-3'
3'-AGATCA-5'
'5'-TCTAGA-3'
3'-AGATCT-5'
5'-ACTAGT-3'
3'-TGATCA-5'
5'-ACTAGA-3'
3'-TGATCT-5
(4)下列操作可用于证明重组质粒和大肠杆菌工程菌构建成功的方法及现象有_________。
A．转化后的大肠杆菌可以在含青霉素的培养基上生长
B．通过琼脂糖凝胶电泳证明重组质粒的大小符合预期
C．不同浓度的四环素溶液中大肠杆菌的荧光强度不同
D．显微观察重组质粒上的外源DNA 片段的核苷酸序列
【答案】(1)③④
(2) 能发出 四环素能抑制（或减弱）tetR 蛋白对启动子2 的抑制作用，使GFP 基因能表达出绿色
荧光蛋白（GFP 蛋白）而发光
(3) XbaI SpeI ①④
(4)BC
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
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记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）据图分析可知，启动子1 可与RNA 聚合酶结合，促进TetR 基因的表达TetR 蛋白，TetR 蛋
白抑制启动子2 与RNA 聚合酶的结合，抑制GFP（绿色荧光蛋白）基因的表达绿色荧光蛋白。四环素可
以抑制TetR 蛋白的作用，因此当环境中没有四环素时，GFP（绿色荧光蛋白）基因不表达；当环境中有四
环素时，四环素能够解除TetR 蛋白对启动子2 的抑制作用，最终使菌体发出绿色荧光。因此可以通过检测
荧光强弱来判定环境中的四环素浓度，因此需导入天然大肠杆菌的目的基因有③④。
（2）当环境中含四环素时，抑制TetR 蛋白作用增强，解除TetR 蛋白对启动子2 的抑制作用，使GFP 基因
能表达出绿色荧光蛋白（GFP 蛋白）而发光，因此成功构建的大肠杆菌工程菌能发出绿色荧光。
（3）据图2 分析可知，DNA 片段1 两端的限制酶识别序列分别是XbaⅠ和EcoRⅠ，而DNA 片段2 两端的限
制酶识别序列是SpeⅠ和BamHⅠ，若要让两个DNA 片段连接在一起，需要经酶切后获得相同的粘性末端。
据表格分析，XbaⅠ和SpeⅠ酶切能获得相同的粘性末端，因此DNA 片段1 用XbaⅠ酶切，DNA 片段2 用
SpeⅠ酶切，然后在用DNA 连接酶将两个DNA 片段连接在一起，所以在特定工具酶作用下能成功拼接的位
点处碱基序列为①④。
（4）A、含普通质粒和重组质粒的大肠杆菌均含有青霉素抗性基因，从而都能在含有青霉素的培养基上生
长，A 错误；
B、通过琼脂糖凝胶电泳实验证明重组质粒的大小符合预期，说明重组质粒建构成功，B 正确；
C、大肠杆菌工程菌建构的目的是监测残留在生物组织或环境中的四环素水平，因此构建成功的标志就是
四环素浓度变化能引起大肠杆菌工程菌荧光强度的相应改变，C 正确；
D、显微镜无法观察到重组质粒上的外源DNA 片段的核苷酸序列，D 错误。
故选BC。
2．为研究干旱胁迫基因LEA 和VOC 对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。
其中基因LEA 与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，基因VOC 和标记基因构建成基因表达载体
乙，相关序列及酶切位点如图所示。箭头表示转录方向。
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(1)利用PCR 扩增LEA 基因时，需要在引物的 （填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，
添加序列对应的限制酶是 ，若产物中除了目的基因外有其他DNA 片段存在，从引物角度考
虑，原因可能是 。
(2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR 扩增仪中加入的引物的碱基序列为5'-
-3'和5' -3'。基因表达载体中启动子的作用是 。
(3)常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入Ti 质粒的
上，经过转化作用，进入油菜细胞，并将其插入 ，从而使其得以维持稳定和表达。
(4)乙酰-CoA 羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解
过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环
境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC 和ATGL 基因的表达水平，结果如下图。
正常植株
转基因A 植株
转基因B 植株
AC 酶
ATGL 酶
①在分子水平上，用 方法检测AC 酶和ATGL 酶的含量可得到上述表格结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA 和VOC 在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是 。
【答案】(1) 5'端 EcoR V 和Xbal 引物特异性差；复性温度较低，引物与模板结合随意性大
(2) -GATATCATGGGC- -TCTAGACTAGTG- 启动和调控基因的转录
(3) T-DNA 染色体DNA
(4) 抗原-抗体杂交 LEA 通过促进AC 的表达使植物油脂增加；VOC 通过抑制ATGL 的表达从而
减弱油脂的降低
【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基
因导入受体细胞；目的基因的检测与表达。
2、基因工程的工具：限制酶、DNA 连接酶和运载体。
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【详解】（1）耐高温的DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从引物的3'端延伸DNA 链，因此
PCR 扩增需要引物。扩增LEA 基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。题干信息：基因LEA
与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲；由于Luc 中存在BamH I 识别序列，BamH I 会将Luc 切断；
一种酶切会导致载体、LEA 基因自身环化及LEA 反向连接等，因此引物添加序列对应的限制酶是 EcoR V
和Xbal。若产物中除了目的基因外有其他DNA 片段存在，从引物角度考虑，原因可能是设计的引物特异
性不高，或退火温度过低，导致引物与模板结合随意性大。
（2）为了构建基因表达载体甲，在LEA 基因左右两端分别添加相应的限制酶 EcoRV 和Xbal.识别序列，
由于引物只能引导子链从5'→3'延伸，根据碱基互补配对原则，用PCR 扩增时的两个引物对应的序列为:5'-
GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'。启动子是DNA 上的一段特殊序列，是RNA 聚合酶的结合
位点，基因表达载体中启动子的作用是启动和调控基因的转录。
（3）Ti 质粒含有一段特殊的区域——T-DNA，其是可以转移的DNA，常用农杆菌转化法将目的基因导入
油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入Ti 质粒的T-DNA 上，经过转化作用，进入油菜
细胞，并将其插入染色体DNA 中，从而使其得以维持稳定和表达。
（4）①AC 酶和ATGL 酶的化学本质是蛋白质，检测其含量，在分子水平上采用抗原-抗体杂交技术。
②根据检测结果，转基因A 植株的AC 酶表达量变高了，转基因B 植株的ATGL 酶表达量变低了，可以推
测在干旱胁迫的环境下，LEA 通过促进AC 的表达使植物油脂增加；VOC 通过抑制ATGL 的表达从而减弱
油脂的降低。
3．干扰素（IFN）是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上广泛用于治疗病毒感染性疾病。传统
生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取，每300L 血液只能提取出1mg 干扰素。科学家利用基因
工程的方法从酵母菌中获得干扰素，每1kg 培养物可以获得20-40mg 干扰素。下图表示重组人干扰素相关
的生产过程及相关限制酶识别序列。注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，甲序列可以合成信号肽引导核糖
体附着到内质网上。
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限制酶种类
Mun I
Sal I
EcoR I
BamH I
Xho I
切割位点（5＇-3
＇）
C↓AATTG
G↓TCGAC
G↓AATTC
G↓GATCC
C↓TCGAG
(1)从产生干扰素的细胞中提取出总RNA，通过 获得相应的cDNA。
(2)为了能顺利与质粒A 构建基因表达载体，在对干扰素基因进行PCR 扩增时，需在引物 （a 或b）的
5’端添加限制酶 的切割位点，在需在引物 （c 或d）的5’端添加限制酶 的切割位点。
(3)将基因表达载体导入酵母菌前先导入大肠杆菌的目的是 。
(4)⑤用于发酵前，需先对菌种进行筛选，培养基中不需要添加的成分包括___。
A．无机盐
B．琼脂
C．组氨酸
D．碳源
E．氨苄青霉素
【答案】(1)逆转录（反转录）
(2) a XhoI d EcoRI
(3)扩增基因表达载体
(4)CE
【分析】基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因，其中启动子是RNA 聚合酶特异性识
别和结合的DNA 序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度；终止
子是给予RNA 聚合酶转录终止信号的DNA 序列。
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【详解】（1）从细胞中提取出总RNA，通过逆转录（反转录）获得相应的cDNA。
（2）在对干扰素基因进行PCR 扩增时，需在引物a 的5’端添加限制酶XhoI 的切割位点，在需在引物d 的
5’端添加限制酶EcoRI 的切割位点，方便切出相同切口，才能顺利与质粒A 构建基因表达载体。
（3）将基因表达载体导入酵母菌前先导入大肠杆菌是为了大量扩增基因表达载体。
（4）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含
有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌， 培养基中不需要再加入组氨酸和
氨苄青霉素，但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体，CE 符合题意，ABD 不符合
题意。
故选CE。
4．草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与植物体内的PEP（磷酸烯醇式丙酮
酸）结构相似，可与PEP 竞争结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植物细胞正常代谢。我国科学家从草
甘膦施用土壤中的微生物体内获取草甘膦抗性基因GR29，并将其导入大豆体细胞中获得抗草甘膦的转基
因大豆。
(1)结合上述信息推测GR29 发挥抗草甘膦作用的途径可能是GR29 表达的产物 （答出1
点即可）。
(2)将GR29 导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P 连接获得 。因GR29 基因序列两端无所需的
限制酶切位点，图1 与引物1 互补的为基因的非模板链，据图推测扩增该基因时需向引物1 和引物2 的5′
端分别加上 限制酶的识别序列。
(3)荧光定量PCR 技术可实现对转基因大豆中目的基因的定量检测。在PCR 反应体系中，加入的荧光探针
与模板DNA（目的基因）的某条链互补结合，当合成的子链延伸至探针处，探针被酶切降解，此时荧光监
测系统就会接收到荧光信号，具体原理如图2 所示。
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①若样品中不含模板DNA，则实验现象是 。荧光达到某一特定强度所需的循环次数越 ，模
板DNA 含量越高。
②通过上述技术定量检测目的基因，需从设计的多对引物和多种探针中选择特异性最好的组合，为此需进
行多组实验，每个实验组需向反应体系中加入转基因大豆的DNA 模板外，还需加入 。（填字母）
a、足量的待测引物
b、定量的待测引物
c、定量的待测荧光探针
d、耐高温的DNA 聚合酶
e、解旋酶
h、足量的脱氧核苷酸（dNTP）
③预期随时间变化，荧光强度达到一定值后将不再增加，这是由于 （答出2 点即可）。
【答案】(1)阻止草甘膦与PEP 竞争结合EPSP 合酶
(2) 重组质粒（或基因表达载体） XhoI 、PstI
(3) 几乎无法检测到荧光 少 b、c、d、h Taq 酶的扩增效率已经饱和，引物等反应物耗
尽
【分析】分析题意可知，草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与植物体内的
PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）结构相似，可与PEP 竞争结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植物细胞正常
代谢。所以若想阻止草甘膦杀死农作物，可以培养抗草甘膦的农作物，草甘膦抗性基因GR29 编码抗草甘
膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，通过该酶的作用，可以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从
而使菌种或植物不被草甘膦杀灭，因此，农作物中转入该基因，可使施用于农田的草甘膦只作用于杂草，
而不影响作物的正常生长。
【详解】（1）根据题意可知，草甘膦与植物体内的PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）结构相似，可与PEP 竞争
结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植物细胞正常代谢。推测草甘膦抗性基因GR29 表达的产物应能阻
止草甘膦结合EPSP 合酶，从而抑制其对PEP 生物合成途径的干扰；
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（2）GR29 为目的基因，将GR29 导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P 连接获得重组质粒。根据质
粒P 上的酶切位点可知，目的基因需要插入PstI 和XhoI 之间，以保证目的基因能正常复制和转录，同时又
可以防止目的基因自连，因此需要在两个引物的5'端分别加上PstI 和XhoI 限制酶的识别序列；
（3）①若样品中不含模板DNA，缺乏模板，则实验现象是几乎无法检测到荧光；荧光达到某一特定强度
所需的循环次数越少，模板DNA 含量越高；
②通过上述技术定量检测转基因大豆中目的基因，则模板应为转基因大豆的DNA，另外每个实验组还需向
反应体系中加入定量的待测引物、定量的待测荧光探针、耐高温的DNA 聚合酶、足量的脱氧核苷酸
（dNTP），PCR 技术中不需要添加解旋酶，故答案为b、c、d、h；
③由于Taq 酶的扩增效率已经饱和，或引物等反应物消耗尽，所以随着实验的变化，荧光强度达到一定值
后将不再增加。
5．人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。
下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr
表示氨苄青霉素抗性基因），五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NotⅠ
识别序列及切割位点
(1)要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是 。基因工程技术
中通常选择 种限制酶进行酶切。
(2)人乳铁蛋白基因可利用PCR 技术进行扩增，扩增需要引物 （在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选
择），连续扩增5 次后至少需要引物 个。
(3)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有 （填“四环素”或“氨苄
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青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用 工程技术获
得转基因小牛。
(4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用 技术，若 ，则表明目的基因已翻译形
成蛋白质。
(5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是 。
【答案】(1) BamHⅠ 2/两
(2) Ⅱ、Ⅲ 62
(3) 氨苄青霉素 胚胎
(4) 抗原-抗体杂交 检测结果呈阳性
(5)转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有生物
活性
【分析】基因表达载体的构建使基因工程的核心步骤，表达载体元件包括启动子、终止子、目的基因、标
记基因和复制原点。
【详解】（1）要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白两端的识别序列
可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切除相同的黏性末端
，结合质粒上的识别序列可知，只用一种酶且切除
相同的黏性末端，则应选择的限制酶是BamHⅠ。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程
技术中通常选择2 种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。
（2）引物的作用是使耐高温DNA 聚合酶从引物的3'端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5'端应该于模板
链的3'端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ，连续扩增5 次后至少需要引物为（25-1）×2=62 个。
（3）据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青
霉素的培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。
（4）检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原-抗体杂交技术，若检测结果呈阳性，则表明目的基因
已翻译形成蛋白质。
（5）对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是转基因动物细胞
具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有生物活性。
6．与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，从而导致可溶性糖含量高，汁多质脆，
研究发现这与甜玉米G 蛋白含量较高有关。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G 蛋白
的转基因甜玉米新品种。在超量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti 质粒的酶切位点如图1、2
所示。
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(1)图1 中，强启动子是一段在特殊序列结构的DNA 片段。位于基因的 驱动基因持续转录，该转录
过程中模板链的5’端位于 （填“M”或“N”）端。
(2)图2 所示载体为农杆菌的Ti 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的 转移到被侵染
的细胞，并且将其整合到 。
(3)结合图1 和图2，为使DNA 片段能定向插入Ti 质粒中，可用PCR 技术在DNA 片段的两端添加限制酶识
别序列，M、N 端添加的序列分别是限制酶 的识别序列。
(4)外植体经脱分化过程形成的愈伤组织放入农杆菌液（含重组Ti 质粒）浸泡后，进行植物组织培养时培养
基中需加入 进行筛选，最终获得玉米植株Y1、Y2、Y3.通过对3 个植株的G 蛋白表达量和还原
糖的含量进行测定，发现Y3 植株的G 蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，原因可能是
。
(5)下图为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA 需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后
方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将
吗啉反义寡核苷酸（RNA 剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制
提出一种假说：吗啉反义寡核苷酸可能导致RNA 前体上内含子1 和外显子2 的对应序列同时被剪切，而不
是内含子1 对应序列被单独剪切。（外显子：基因中编码蛋白质氨基酸的片段。内含子：基因中不编码蛋
白质氨基酸的片段。）
为证明该假说，设置两组实验，一组玉米受精卵中导入吗啉反义寡核苷酸，另一组不导入。提取两组受精
卵中的RNA，逆转录合成DNA（即cDNA）：
①以cDNA 为模板，选择图示引物 进行PCR，产物进行电泳鉴定，根据是否有扩增产物及产物大
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小判断该假说是否成立。
②若某次电泳结果发现实验组和对照组均没有出现任何条带，从PCR 反应成分的角度分析，
可能的原因是 （至少写出1 点）。
【答案】(1) 上游 M
(2) T-DNA 该细胞的染色体DNA 上
(3)NotⅠ和SacⅠ(顺序不能颠倒）
(4) 卡那霉素 Y3 植株玉米中G 蛋白活性较低（合理即可）
(5) 2 和5 漏加了PCR 反应成分（或反应成分用量不当；或引物设计不合理；合理即可）
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）强启动子是一段在特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游；在基因表达载体的构建时，
G 基因位于启动子的下游，转录时RNA 聚合酶和启动子结合，N 端是DNA 链的3’端，子链延伸的方向是
5’端到3’端，因此模板链的5’端位于M 端。
（2）当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒的T-DNA 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染
色体DNA 上。
（3）为使G 基因在玉米植株中超量表达，应确保强启动子和G 基因不被破坏，故应优先选用EcoRⅠ和
BamH Ⅰ酶切割质粒，为保证强启动子和G 基因能连在质粒上，M、N 端添加的序列所对应的限制酶分别是
NotⅠ和SacⅠ酶，然后再用DNA 连接酶将强启动子和G 基因与质粒连接。
（4）由图2 可知，卡那霉素抗性基因位于T 质粒的T-DNA 中，随T-DNA 整合到该细胞的染色体DNA 上，
所以进行植物组织培养时培养基中需加入卡那霉素进行筛选。筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最
终获得多个转基因玉米株系。发现Y3 植株的G 蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，可能
Y3 植株玉米中G 蛋白活性较低。
（5）①若要证明假说成立，即RNA 前体上外显子2 的对应序列同时被剪切下去，则可以选择图示2 和5
进行PCR，观察是否有杂交带出现，如果RNA 前体上外显子2 的对应序列同时被剪切下去，PCR 后电泳
不会出现杂交带。
②从PCR 反应成分的角度分析，漏加了PCR 反应成分（或反应成分用量不当；或引物设计不合理）均会
导致电泳后的实验组和对照组没有任何条带出现。
7．“中天杨”是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8 年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品
种。该品种以八里庄杨为实验材料，经转mtl-D 基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程，①～
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⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。回答下列问题。
注：Ti 质粒中的 Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。
限制酶
Bcl I
EcoR I
Xba I
Sau3A I
BamHI
切割位点
T↓GATCA
G↓AATTC
T↓CTAGA
↓GATC
G↓GATCC
(1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有 (填序号)。
①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短 ④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂
交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁
(2)过程①需要的酶是 ，过程②需要的工具是 。
(3)采用PCR 技术扩增目的基因时，在PCR 反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，至
少经过 次循环，可获取与目的基因等长的DNA 单链。PCR 完成以后，常采用 法来鉴
定PCR 的产物。
(4)培育转基因杨树的核心工作是 ，在进行该工作时，应在mtl-D 基因的两侧添加限制酶
的识别序列。
(5)将目的基因导入受体细胞除图示方法外，我国科学家还独创了一种方法是 。为了确认目的基
因在植物细胞中是否成功表达，从分子水平通常使用 法进行检测。
【答案】(1)②③④
(2) 逆转录酶和耐高温的DNA 聚合酶 限制酶、DNA 连接酶和质粒（Ti 质粒）
(3) 使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 2 琼脂糖凝胶电泳
(4) 基因表达载体的构建 XbaI、BclI
(5) 花粉管通道法 抗原—抗体杂交
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）与杂交育种相比，基因工程育种的操作方法较复杂，容易造成基因污染进而对生态产生威
胁，但基因工程育种的目的性强，能定向改变生物性状，且育种周期短，不受生殖隔离限制，能克服远缘
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杂交不亲和障碍，故选②③④。
（2）过程①以RNA 为模板合成DNA 并进行PCR，该过程需要逆转录酶和耐高温的DNA 聚合酶。过程②
是将目的基因与质粒进行连接，需要限制酶切割目的基因和Ti 质粒，然后利用DNA 连接酶将二者进行连
接，因此过程②需要的工具是限制酶、DNA 连接酶和质粒（Ti 质粒）。
（3）在PCR 反应体系中需加入引物，引物的作用是使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
在DNA 扩增过程中，由于半保留复制，至少经过2 次循环，方可获取与目的基因等长的DNA 单链，至少
经过3 次循环，才有可能获取与目的基因等长的片段。常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR 的产物。
（4）基因表达载体的构建是基因工程的核心工作，在进行基因表达载体的构建时，BamHⅠ会切割复制原
点，Sau3AⅠ的识别序列包含在BamHⅠ的识别序列中，因此该过程不能用Sau3AⅠ、BamHⅠ切割Ti 质粒。若
选择EcoR I 和Bcl I 或Xba I 切割Ti 质粒，则会破坏两种标记基因（Tetr 四环素抗性基因、Ampr 氨苄青霉
素抗性基因），则应该选择Bcl I 和Xba I 切割Ti 质粒，故应在mtl-D 基因的两侧添加限制酶XbaⅠ、BclⅠ的
识别序列。
（5）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法，花粉管通道法是我国科学家独创
的。目的基因的表达产物是蛋白质，为了确认目的基因在植物细胞中是否成功表达，通常用抗原—抗体杂
交法从分子水平进行检测。
8．大量研究表明，家畜的肉类产量与肌生长抑制素（MSTN）基因有关，MSTN 蛋白在体内主要调控骨骼
肌的生长发育。多种动物研究已经证实，敲除基因MSTN 可以显著增加动物的肌肉质量。科研人员希望利
用CRISPR/Cas9 基因编辑系统获得敲除了基因MSTN 的家禽。请回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 基因编辑系统原理如图1，Cas9 酶可催化DNA 分子的断裂，实现对目的基因的特异性切
割，在切割过程中破坏的化学键是 。图中向导RNA 的作用是定向引导Cas9 蛋白与靶向基因
结合，其原理是 。
(2)科研人员希望在鸡胚细胞中表达CRISPR/Cas9 基因编辑系统，构建的基因表达载体如图2。
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①在对向导RNA 对应的DNA 片段进行PCR 扩增时，需要在其两端分别添加限制酶 、
的识别序列。
②用①中限制酶切割质粒和向导RNA 对应的DNA 片段，选择这种酶切方式的目的是 。
③基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要连接的DNA 片段是 。
(3)将鸡胚分为三组并提取DNA，用图2 中的引物Ⅰ和引物Ⅱ进行PCR 扩增，并对PCR 结果进行电泳检测，
结果如图3。
1 组电泳的结果小于2 组，其原因是 。3 组电泳无结果，其原因是 。
【答案】(1) 磷酸二酯键 碱基互补配对
(2) EcoR I BamHI 可以防止该DNA 片段自身环化，且防止限制酶破坏质粒上其他的重要元
件 Cas9 基因
(3) 1 组导入不含目的基因的空白载体，2 组导入含目的基因的重组载体 3 组不导入任何表达载体
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
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记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录
终止的位置
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）Cas9 酶能剪切特定DNA 片段，类似于限制酶的作用，切割DNA 断开磷酸二酯键。向导
RNA 能通过碱基互补配与目标DNA 进行结合，从而定向引导Cas9 蛋白与靶向基因结合，实现对目的基因
的特异性切割。
（2）①由图2 可知，在对向导RNA 对应的DNA 片段进行PCR 扩增时，应选择两种限制酶对其进行切割，
限制酶Xho I 会切割复制原点，可排除，在向导RNA 对应的DNA 片段左边的选择限制酶EcoR I，由于限
制酶EcoR I 和限制酶Mun I 的识别序列相同，二者容易发生相互连接，可排除限制酶Mun I，故在向导
RNA 对应的DNA 片段右边的选择限制酶BamHI。
②选择限制酶EcoR I、限制酶BamHI 切割质粒和向导RNA 对应的DNA 片段，由于该DNA 片段两端的黏
性末端序列不同，可以防止该DNA 片段自身环化，且防止限制酶破坏质粒上其他的重要原件如复制原点。
③基因表达载体的组成是：目的基因、启动子、终止子、标记基因，因此还需要的序列是Cas9 基因，表达
出Cas9 酶，实现对DNA 的定向切割。
（3）若1 组导入不含目的基因的空白载体，2 组导入含目的基因的重组载体，3 组不导入任何表达载体，
则会导致1 组电泳的结果小于2 组，3 组电泳无结果。
9．东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。
研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活
性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。
(1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，
配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到培养基
中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。
(2)通过上述方法筛选得到6 种乳酸菌，测得它们对霉菌的抑菌率如下表，应选择乳酸菌编号为 的菌
株进行后续操作。
乳酸菌编
Ll
L2
L3
L4
L5
L6
22
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号
抑菌率/%
28．57
19．48
58．44
14．
28
6．49
36．36
(3)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。下面
是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。
①利用PCR 技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 。PCR 过程中，经过4 轮循环，消耗引物
的个数是 。
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5＇端加入
（填“BamH I”或“Nde I”）的识别序列。
③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如
下图。
1：DNA 标准样
2：普通受体菌的DNA
3：转化操作后受体菌的DNA
4：无菌水
设置4 号的目的是 （答出1 点即可），电泳结果表明 。
【答案】(1) 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 平板划线法（稀释涂布平板法）
(2)L3
(3) 引物2 和引物3 30 BamH I 判断PCR 反应体系是否受到污染 目的基因已成功
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导入受体细胞
【分析】1、筛选和分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法。
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在划线的开始
部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR 的引物长度通常为
20〜30 个核苷酸。引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR 过程需要两种引物，
能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。
【详解】（1）常用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）对培养基进行灭菌。分离微生物常用的接种方法有稀释涂
布平板法和平板划线法，即可采用稀释涂布平板法和平板划线法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈
的菌落并继续进行纯培养。
（2）由表格内容可知，乳酸菌编号为L3 的菌株对霉菌的抑菌率最高，因此应选择乳酸菌编号为L3 的菌
株进行后续操作。
（3）①PCR 过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，因此利用PCR
技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是引物2 和引物3。PCR 过程中，经过4 轮循环，消耗引物的
个数是2×24-2=30。
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，图中细菌素基因转录方向为从右往左，即启动子位于右端，终止
子位于左端，与甲链结合的引物为引物2，即在引物2 的5＇端加入BamH I 的识别序列。
③4 号为无菌水组，设置4 号的目的是判断PCR 反应体系是否受到污染。3 号为转化操作后受体菌的
DNA，提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，3 号中出现500bp 的DNA 片段，已知细菌
素基因为500bp，由此可知目的基因已成功导入受体细胞。
10．当蚊子叮咬时，它会将唾液中一种叫做anophelins 的蛋白质（一种抗凝血因子）注入宿主体内，让血
液更自由地流动。长期以来，研究人员一直试图利用疟蚊创造人用新型血液稀释剂。回答下列问题：
(1)蚊子产生的anophelins 蛋白对于人体来说是异物，免疫系统会对其进行攻击，发生免疫反应，这体现了
免疫系统的 功能
(2)为获取anophelins 基因，需提取蚊子 的总RNA，再经逆转录过程得到DNA，将其作为PCR
反应的模板。并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
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(3)构建基因表达载体时、若科研人员需将anophelins 基因整合到质粒上， 如上图，应使用限制酶
切割如图中含anophelins 基因的DNA 片段，使用限制酶 切割图中质粒，以获得能正确表达的重
组质粒。
(4)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌，提取来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA 并用适当的限制酶
（如BamHI） 切割， 经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段长度。这一操作的目的是 。
(5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产anophelins 蛋白更具有优势。其理由是 。
【答案】(1)免疫防御
(2)唾液腺
(3) EcoRI、HindIII MfeI、HindIII
(4)筛选出导入目的基因的大肠杆菌或检测大肠杆菌是否含有目的基因
(5)动物细胞比大肠杆菌多了复杂的生物膜系统（内质网和高尔基体）， 可对anophelins 基因的表达产物进
行正确地加工与折叠，产生具有生物活性的蛋白质
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
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将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
【详解】（1）免疫系统会对蚊子的anophelins 蛋白质进行攻击，发生免疫反应，这体现了免疫系统的免
疫防御功能。
（2）anophelins 的蛋白质位于蚊子的唾液中，因此为获取anophelins 基因，需提取蚊子的总RNA。
（3）
构建基因表达载体时、若科研人员需将anophelins 基因整合到质粒上， 如上图，anophelins 基因两侧，有
多个酶切位点，获取含目的基因最短的DNA 片段，应使用限制酶EcoRI、HindIII 进行目的基因的切割，
而图中的质粒切除的端口应与目的基因被切除的一致，且不切割启动子和标记基因和抗性基因，因此选择
MfeI、HindIII 切割质粒，获得正确表达的重组质粒。
（4）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌，提取来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA 并用适当的限制酶
（如BamHI） 切割， 经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段长度，与目的基因的长度进行对比，如果有目的
基因大小的片段出现，可以筛选出导入目的基因的大肠杆菌或检测大肠杆菌是否含有目的基因。
（5）由于动物细胞比大肠杆菌多了复杂的生物膜系统（内质网和高尔基体）， 可对anophelins 基因的表
达产物进行正确地加工与折叠，产生具有生物活性的蛋白质，因此转基因动物作为生物反应器生产
anophelins 蛋白更具有优势。
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