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专题05 基因工程
近几年高考题通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，
PCR 技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大：其中启
动子的插入位点和插入方向等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解
决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。预测2024 年难度系数
也会非常大，不排除出现细胞工程的可能。
1、（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果
酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1
为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
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(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂
质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
【答案】(1)溶解度
(2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME 基
因”）
(3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME 基因序列整合
到硅藻细胞基因组中”）
(4) 增加 细胞数量
(5)有氧呼吸生成的ATP 增多
(6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生
产”）
【分析】1、PCR 的含义：PCR 是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在生物
体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、PCR 原理：DNA 半保留复制。
3、PCR 基本条件：DNA 模板、4 种脱氧核苷三磷酸、2 种引物、耐高温的DNA 聚合酶、缓冲液。
【详解】（1）DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA 和蛋白质。
因此，根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到
的粗提DNA 可以作为PCR 扩增目的基因的模板。
（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有
特殊序列结构的DNA 片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果
酸酶（ME）基因。
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（3）PCR 是一项根据DNA 半保留复制原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的
基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链
核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA 作为
PCR 模板，而在实验组中以转ME 基因的硅藻细胞基因组DNA 作为模板。如此比较两个实验扩增结果可
以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME 基因序列是否整合到硅藻细胞基
因组中。
（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3 分析
可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B 的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定
硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A 与B 的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高
产生物柴油的优良硅藻细胞品系。
（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B 线
粒体中ME 含量显著高于品系A。据此分析可知，ME 基因的超表达导致线粒体中的NADH 水平升高，
NADH 进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。
（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、
不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
2、（2022·河北·高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制
剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列
问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上，此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有 （写出两点
即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。下图为三种
不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析 （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋
StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是 。
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(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫
朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白
酶抑制剂的能力，其分子机制可能是 （写出两点即可）。
【答案】(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的
(2)基因表达载体的构建/表达载体的构建
(3) T-DNA 该方法不适用与单子叶植物
(4)基因--DNA 分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术
(5) 效果 NaPI＋StPinlA 饲喂NaPI＋StPinlA 转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多
(6) 定向改变 由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，
从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了
mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗
虫的目的。
（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建。
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（3）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色
体的DNA 上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti 质粒的T-DNA 上，通过农杆菌的转化作
用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA 上。其不足之处是该方法不适用与单子叶植物。
（4）目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因、
是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗
虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--DNA 分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术
等。
（5）抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以鉴定其抗性程度。
由图可知，NaPI＋StPinlA 转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂NaPI＋StPinlA 转基因的虫体质量最小、
棉铃数量最多。
（6）在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫
发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂
的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂。
3、（2021·河北·高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修
复技术将土壤中的Cd 富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降
低土壤中Cd 的含量。为提高植物对Cd 污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd 转运蛋白（YCF1）基
因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，
这个群体称为 。
（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体
中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1 基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
。研究者进一步获得了转YCF1 基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是
。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd 污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同
器官中Cd 含量（图2）。据图1 可知，与野生型比，转基因植株对Cd 具有更强的 （填“耐
性”或“富集能力”）；据图2 可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd 污染最
为方便有效。
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（5）已知YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高
Cd 环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd 污染土壤修复植物
的优势在于 （写出两点即可）。
【答案】 基因组文库 限制酶和DNA 连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化
法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1 可通过主动运输将Cd 离子运到液
泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区
等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【分析】1、基因文库包括基因组文库和cDNA 文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA 文库是部
分基因文库。
2、据图1 可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2 可知，转基因植
株的茎、叶中Cd 含量高于野生型。
【详解】（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体
中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA 和质粒，以产生相同的黏性
末端，然后用DNA 连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA 可转移并插入到受体细胞DNA 中，将含有YCF1 基
因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，
采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株
在Cd 污染的土壤中生长较好，即对Cd 具有更强的耐性；据图2 分析，转基因植株的茎、叶中Cd 含量高
于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd 的作用，对于缓
解土壤Cd 污染最为方便有效。
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（5）YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd 离子运到液泡中，提高了细胞
液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd 环境。相较于草本植物，杨树
具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运
输、利用，作为Cd 污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在
考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，
或运用所学知识解释生活中的一些现象。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．TAT 基因可以表达出一种转录激活因子，并能有效引导蛋白质穿透细胞膜。绿色荧光蛋白基因
（EGFP）是一种报告基因。研究人员通过构建TAT 基因与EGFP 的融合表达载体，在大肠杆菌内表达得到
纯化的TAT—EGFP 融合蛋白。将人工合成编码TAT 蛋白的DNA 片段插入载体pET28a 得到pET28a—TAT
重组质粒，再利用引物对EGFP 进行PCR，并利用限制酶EcoRI 和XhoⅠ连接得到pET28a—TAT—EGFP 重
组质粒，操作流程如图所示。回答下列问题：
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(1)图中TAT 基因结构中，每个磷酸基团直接连着 个脱氧核糖。构建pET28a—TAT 重组质粒使用
两种限制酶切割目的基因和PET28a 质粒的优点是 、 。
(2)PCR 扩增EGFP 基因的过程中，引物Ⅰ与引物Ⅱ的序列不能太短，且两者间不能 ，两种引
物的5'端必须分别添加 序列，以保证正确连接形成pET28a—TAT—EGFP 重组质粒。
(3)将上述重组质粒转化到大肠杆菌E·coliBL21 时，需先用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，目的是
。筛选转化成功的E·coliBL21 时，需要在LB 平板上添加 ，并运用平板划线法进行分离。
(4)将稳定的高表达菌株扩大培养后，再研究测定其融合蛋白表达的情况。利用超声波法裂解大肠杆菌，将
提取的全菌蛋白在100g/L 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，发现加入IPTG 组与未加入IPTG 组相比较，
泳带有明显的差异，如图所示：
注：1：未加入IPTG；2：37℃时0.2mmol/LIPTG 诱导1h；3～5：37℃时0.5mmol/LIPTG 分别诱导1h、
2h、3h
①电泳是指 。
②根据泳带结果可得出的结论是：IPTG 能够 ，在 的实验条件下作用
效果最佳。
(5)研究人员将TAT 和EGFP 融合在一起研究，目的除了用于筛选成功导入TAT 基因的受体细胞外，还可用
于 （举一例）等。
【答案】(1) 1 或2 防止质粒和 TAT 基因的反向连接 防止质粒和TAT 基因的自身环化
(2) 进行碱基互补配对 限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ识别的核苷酸
(3) 使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 卡那霉素
(4) 在电场的作用下，带电（的蛋白质）分子会向着与其所带电荷相反的电极移动的过程 促进融
合蛋白（TAT—EGFP）的表达 37℃、0.5mmol/LIPTG 诱导3h
(5)追踪转录激活因子的位置，及其引导蛋白质穿透细胞膜的过程
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
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链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】（1）图中TAT 基因为双链结构，除了5'端一个游离的磷酸基团与1 个脱氧核糖相连外，其他每一
个磷酸基团都连接2 个脱氧核糖。双酶切目的基因和质粒，可产生不同的黏性末端，防止目的基因和质粒
反向连接及目的基因、质粒自身环化。
（2）PCR 中使用的两种引物的碱基之间不能互补配对，否则引物不能与模板DNA 链结合，导致不能合成
目的基因。根据题意，是利用限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ连接获得pET28a—TAT—EGFP 重组质粒的，所以在两
种引物的5'端必须添加限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ识别的核苷酸序列。
（3）为使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，提高转化效率，在将重组质粒导入
大肠杆菌之前，需先用一定浓度的Ca²⁺溶液处理大肠杆菌。重组质粒含有卡那霉素抗性基因，抗性基因作
为特殊的标记基因，有利于重组DNA 分子的筛选。成功导入重组质粒的大肠杆菌，能表达抗卡那霉素的
产物，故能在含卡那霉素的培养基中存活。
（4）①电泳是指在电场的作用下，带电（的蛋白质）分子会向着与其所带电荷相反的电极移动的过程。
②由电泳图可知加入IPTG 组菌株蛋白中含有TAT—EGFP 融合蛋白的电泳条带，且在37℃、0.5mmol/
LIPTG 诱导3h 时电泳条带最宽，由此说明IPTG 能够促进融合蛋白（TAT-EGFP）的表达，且在37℃、
0.5mmol/LIPTG 诱导3h 的实验条件下表达量最高。
（5）该研究除了用于筛选成功导入TAT 基因的受体细胞外，还可用于追踪转录激活因子的位置，及其引
导蛋白质穿透细胞膜的过程等。
2．将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖
转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG 基因敲
除质粒构建过程如图1 所示，其中KanR 是抗生素抗性基因，SacB 是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖
积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI 的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回
答下列问题：
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(1)图1 中利用PCR 获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增 轮。从引物角度分析，扩增得到
上、下同源臂能拼接到一起的关键是 。ptsG 基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI 和EcoRI 双酶
切的优点是 。
(2)将敲除ptsG 基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、
含10%蔗糖培养基， （填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上
生长的为目的菌。
(3)将筛选得到的敲除ptsG 基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG 基因（如
图2）。
①两次同源重组共有 个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定
的引物进行PCR，通常将扩增产物利用 方法鉴定。
②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG 基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别
培养在以葡萄糖为唯一碳源的 培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌 。
【答案】(1) 2/二/两 引物2 和引物3 的5'端具有配对序列(引物2 和引物3 配对序列也可得分)
避免质粒或目的基因的自我拼接、避免目的基因倒接
(2)仅能在含卡那霉素
(3) 8/八 琼脂糖凝胶电泳 选择 低
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
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（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）第一轮扩增出来的DNA 双链不等长，再经第二轮的扩增才能得到上同源臂或下同源臂区段，
所以至少需要扩增2 轮；从引物角度分析，扩增得到上、下同源臂拼接到一起的关键是引物2 和引物3 的
5'端有配对序列，这样热变性后再复性时上同源区段和下同源区段有互补序列可以通过氢键连接，从而拼
接到一起；ptsG 基因敲除质粒构建选用XhoI 和EcoRI 进行双酶切的优点是由于两种酶切后的黏性末端不
同，从而可以避免质粒或目的基因的自我拼接、避免目的基因倒接。
（2）敲除G 基因质粒进行扩增并导入工程菌中，由于质粒上带有KanR 抗生素抗性基因，因此能在含卡那
霉素培养基上生长，具有SacB 基因，能将蔗糖转变为果聚糖，果聚糖积累对细菌有毒害，所以不能在含
有蔗糖的培养基上生长。
（3）①由图2 可知，每一次同源重组，都涉及DNA 分子双链断开与拼接，因此每一次都有4 个磷酸二酯
键的断裂(合成)，两次同源重组共8 个磷酸二酯键的断裂(合成)；敲除pstG 基因后的同源重组片段与原基
因片段的碱基数量不同，可以用琼脂糖凝胶电泳加以区分。
②将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的选择培养基上，从而起到筛选作用；
ptsG 基因为葡萄糖转运系统关键酶基因，因此敲除后该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌低。
3．热激蛋白是一种普遍具有抗逆作用的保护蛋白，在植物处于逆境下发挥其重要的调控作用。HSP70 是
植物中含量最多的热激蛋白，研究已经证明南瓜细胞中HSP70 基因的表达与植物获得的耐热性呈显著正相
关性。花楸树为蔷薇科落叶小乔木，具有很高的园林观赏价值，但花楸树引种到低海拔地区后面临着严峻
的夏季高温环境胁迫，其正常生长及观赏价值会被影响。欲将南瓜细胞中的HSP70 基因（结构如图1 所示，
其中B 链是转录的模板链）用图2 所示的质粒导入花楸树细胞来研究其表达与耐热性之间的关系。回答下
列问题：
注：XhoI、KpnI、SacI 为三种限制酶，其识别位点分别是5'CTCGA↓G、5'G↓GTACC、5'GAGCT↓C；
AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。
(1)可通过提取南瓜细胞中的 经逆转录获得HSP70 基因，并用PCR 对其进行扩增。在PCR 扩增
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HSP70 基因时应选择的引物组合是引物 。为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接，需在引物
（填“I”“Ⅱ”“Ⅲ”或“IV”）的5'端添加-CTCGAG 序列。
(2)通过农杆菌转化法转化花楸树细胞后，可以使用含 的选择培养基筛选出含有目的基因的花楸树细
胞。将某细胞培育为植株后进行自交，收获子代植株641 株，其中不耐高温的植株为42 株，不考虑突变和
互换，出现该结果的原因最可能是 。
(3)为了检测目的基因是否成功导入并是否稳定维持和表达其遗传特性，可从分子水平上用PCR 技术进行
检测。若用PCR 技术进行检测，以花楸树细胞提取的DNA 为模板，PCR 扩增HSP70 基因片段后进行琼脂
糖凝胶电泳实验，结果如图3（1 号为空白对照，2、3 号为转基因植株）所示。若与1 号相比，2 号花楸树
植株的耐热能力没有增强，原因可能是 。
【答案】(1) （HSP70 基因转录的）mRNA Ⅱ、Ⅲ Ⅲ
(2) 氨苄青霉素 有且只有两个HSP70 基因分别整合到了该花楸树细胞的两条非同源染色体上并成
功表达
(3)2 号转基因植株中HSP70 基因没有转录出mRNA 或没有翻译出HSP70 蛋白
【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA 分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
【详解】（1）题干所示经逆转录获得HSP70 基因，因此需要提取南瓜细胞中的（HSP70 基因转录的）
mRNA，PCR 扩增的前提是依据目的基因两侧的碱基序列设计引物，且引物需要结合在模板链的3’端，因
此在PCR 扩增HSP70 基因时应选择的引物组合是引物Ⅱ、Ⅲ；目的基因内部含SacI 识别序列，因此构建
基因表达载体时不能选该限制酶，根据B 链为转录的模板链，可知目的基因左端应接在靠近启动子的位置，
5'CTCGA↓G 序列为XhoI 的的识别序列，为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接，需要用XhoI、KpnI
两种限制酶切割质粒和目的基因，因此需在引物Ⅲ的5'端添加-CTCGAG 序列。
（2） AmpR 基因为氨苄青霉素抗性基因，因此通过农杆菌转化法转化花楸树细胞后，可以使用含氨苄青
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霉素的选择培养基筛选出含有目的基因的花楸树细胞，将某细胞培育为植株后进行自交，收获子代植株
641 株，其中不耐高温的植株为42 株，即耐高温的∶不耐高温≈15∶1，符合9∶3∶3∶1 的变式，遵循自
由组合定律，因此出现该结果的原因最可能是有且只有两个HSP70 基因分别整合到了该花楸树细胞的两条
非同源染色体上并成功表达。
（3）PCR 扩增HSP70 基因片段后进行琼脂糖凝胶电泳实验，电泳结果显示2 号花楸树植株成功导入目的
基因，但是2 号花楸树植株的耐热能力并没有增强，原因可能是转录或者翻译出现问题，也就是2 号转基
因植株中HSP70 基因没有转录出mRNA 或没有翻译出HSP70 蛋白。
4．多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸，为解决猪肉中PUFAs 含量不足的问题，研究者从线虫
中获得控制PUFAs 合成的必需酶基因fatl，培育转fatl 基因猪，操作过程如图所示。图中GFP 基因表达出
绿色荧光蛋白。据图回答下列问题：
(1)用PCR 技术在体外扩增目的基因时，PCR 扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、 （答出2 点）等。
(2)由图可知，在构建基因表达载体时，为克服目的基因自身环化，即线性DNA 的末端相互连接形成圆环，
以及便于目的基因与载体的连接，切割含目的基因的DNA 和载体的限制酶应选用 和 。
(3)构建的基因表达载体中，GFP 基因的作用是 。除GFP 基因外，未标注出的必需元件还有 。
(4)猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期 ，以防止细胞代谢
物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为 。
此过程中，对于悬浮培养的细胞直接用 法收集细胞处理成细胞悬液。
(5)经检测，fatl 基因成功整合在猪基因组DNA 后，不能说明成功培育转基因猪，还需要 。
【答案】(1)引物、4 种脱氧核苷酸（原料）、（耐高温的）DNA 聚合酶
(2) EcoRⅠ BamHⅠ
(3) 标记基因（使相关细胞发出绿色荧光方便进行筛选） 复制原点
(4) 更换培养液 传代培养 离心法
(5)进行个体生物学水平的鉴定，即检测转基因猪体内的多不饱和脂肪酸（PUFAs）是否增加
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【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：利用PCR 技术扩增。（2）基因表达载体
的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将
目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农
杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生
物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、基因表达载体必需具备的元件有目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点。
3、目的基因的检测和鉴定：（1）分子水平上的检测 ；（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、
活性鉴定等。
【详解】（1）用PCR 技术在体外扩增目的基因时，PCR 扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、4 种
脱氧核苷酸（原料）、（耐高温的）DNA 聚合酶等。
（2）据题图可知，运载体有三种限制酶位点可供选择，目的基因fat1 两侧有EcoRI 和BamHI 两种限制酶
酶切位点，正好运载体上也有这两种限制酶位点，为防止目的基因自身环化使用双酶切，可选用EcoRI 和
BamHI 切割含目的基因的DNA 和载体。
（3）构建的基因表达载体中，GFP 基因的作用是标记基因（使相关细胞发出绿色荧光方便进行筛选）。
基因表达载体必需具备的元件有目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点；所构建的重组基因表
达载体中未标注出的必需元件除了标记基因还有复制原点。
（4）猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期更换培养液，以防
止细胞代谢物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程
称为传代培养，此过程中，对于悬浮培养的细胞直接用离心法收集细胞处理成细胞悬液。
（5）转基因猪已经培育成功的标志是fat1 基因在转基因猪体内成功表达，此时能够检测到转基因猪体内
含有fat1 基因表达的蛋白质，转基因猪体内具有较高的PUFAs 含量。而该实验没有检测fat1 基因是否成功
表达；没有在个体生物学水平鉴定转基因猪的PUFAs 含量，不能说明成功培育转基因猪。
5．透明质酸（HA）又称玻尿酸，是重要的医学材料和化妆品添加原料。枯草芽孢杆菌无透明质酸合成酶
（HAS），但含有HA 代谢的其他途径，而链球菌含有HAS 的基因（H 基因）。研究者通过基因工程来改
变枯草芽孢杆菌代谢通路，以实现枯草芽孢杆菌生产HA。
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(1)目的基因的获取和扩增：从链球菌获取H 基因，为通过外源添加诱导剂来控制H 基因的表达，研究者选
择含木糖诱导型启动子的p 质粒作为H 基因的运载体，其中EcoRV 识别序列为5'—GATATC—3'，XbaI 识
别序列为5'-TCTAGAH—3'，H 基因以a 链作为转录模板链，据此推测H 基因的转录从其 （填“左
侧”或“右侧”）开始。利用PCR 扩增H 基因时，需依据图中已知碱基序列及以上信息，设计的两种引物
碱基序列为 和 （写出5'端的10 个碱基）。
(2)基因表达载体的构建：用XbaI 酶和EcoRV 酶处理目的基因和p 质粒，然后加入 酶催化重组质粒形
成。
(3)目的基因的导入与筛选：将构建好的重组质粒转入经 处理的枯草芽孢杆菌，在含 的培养基上筛
选，得到枯草芽孢杆菌A。
(4)菌种扩大培养与发酵：用发酵工程对转基因枯草芽孢杆菌进行大规模培养，该工程的中心环节是 。
扩大培养的枯草芽孢杆菌A 接种一定时间后添加 ，诱导合成HA。HA 对枯草芽孢杆菌来说属于
（填“初生”或“次生”）代谢产物。
【答案】(1) 右侧 5'—GATATCCTAG—3' 5'—TCTAGAATGG—3'
(2)DNA 连接
(3) Ca2+ 四环素
(4) 发酵罐内发酵 木糖 次生
【分析】DNA 连接酶和DNA 聚合酶是两种不同的酶，主要的区别就在于它们的底物是不一样的，DNA 连
接酶和DNA 聚合酶都是形成磷酸二酯键，但是DNA 连接酶连接的是DNA 片段，DNA 聚合酶主要就是将
单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA 链上。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因
枪法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术；将目的基因导人微生物细胞常用
Ca2+处理法。
【详解】（1）H 基因以a 链为转录模板链，基因转录时从模板链的3'开始，因此据此推测H 基因的转录从
其右侧开始。结合质粒中启动子的方向可知，a 链3′端连接启动子，5′端连接终止子，所以需要在PCR 扩
增仪中加入的引物序列为5'-GATATC（EcoRV 识别序列）CTAG-3'（图中H 基因右引物）和5'-TCTAGA
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（XbaI 识别序列）ATGG3'（图中H 基因左引物）。
（2）用XbaI 酶和EcoRV 酶处理目的基因和p 质粒含有相同的黏性末端，需要加入DNA 连接酶催化重组
质粒形成。
（3）Ca2+处理枯草芽孢杆菌，可以增大细胞膜的通透性，有利于构建好的重组质粒转入受体细胞枯草芽
孢杆菌。图中所示载体上含有四环素抗性基因，因此重组质粒上含四环素抗性基因，含重组质粒的枯草芽
孢杆菌具有抵抗四环素的能力，能在含四环素的培养基上生存，而没有四环素抗性基因的受体细胞则无法
再含四环素的培养基中生存，故在含四环素的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌A。
（4）菌种扩大培养与发酵：用发酵工程对转基因枯草芽孢杆菌进行大规模培养，该工程的中心环节是发
酵罐内发酵。由于研究者选择含木糖诱导型启动子的p 质粒作为H 基因的运载体，因此枯草芽孢杆菌A 接
种一定时间后添加木糖，诱导合成HA。次生代谢产物指植物代谢产生的一些不是植物基本生命活动所必
需分析题意，HA 是是一种具有高黏度氨基多糖，HA 对枯草芽孢杆菌来说属于次生代谢产物。
6．中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）是可以无限增殖的细胞。科研人员利用CHO 细胞系生产乙肝疫苗的过
程是：①将得到的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因与信号肽基因连接形成融合基因，信号肽可以引导
HBsAg 进入内质网内进行合成和加工，进而以分泌蛋白的形式分泌到胞外，融合基因的结构如图1 所示；
②将融合基因插入图2 所示的质粒，将重组质粒与带有小鼠二氢叶酸还原酶（dhfr）基因的质粒共转染缺
乏二氢叶酸还原酶的CHO 细胞；③从CHO 细胞系的培养液中分离提取HBsAg，用以生产乙肝疫苗。图1
中的F1~F4分别为扩增信号肽基因和HBsAg 基因时所需的引物。请回答下列问题：
(1)需要通过 技术扩增融合基因，该技术的原理是 。
(2)为了将信号肽基因和HBsAg 基因连接在一起，在分别扩增两种基因时，应在引物F2和引物F3的5′端引
入 。通过PCR 检测融合基因是否形成，可选用图1 中引物 对连接产物进行扩增。
(3)为了将融合基因正确地插入图2 所示的质粒，应选择限制酶 切割质粒。与单独将HBsAg 基因转
入CHO 细胞相比，导入融合基因的好处是 。
(4)缺乏dhfr 的CHO 细胞在培养基上不能正常生长，因此在筛选表达HBsAg 的细胞株时，dhfr 基因起
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的作用。
(5)在生物反应器中大规模连续培养目标细胞株时，通过 的措施，为培养的细胞株营造无毒的环境。
同时要通入 和5%CO2的混合气体，其中CO2的主要作用是 。
【答案】(1) PCR DNA 半保留复制
(2) 一段互补序列 F1 和F4
(3) MunⅠ和SalⅠ 信号肽可以引导HBsAg 以分泌蛋白的形式分泌到细胞外，便于从CHO 细胞培养
液中提取HBsAg
(4)标记基因（或筛选）
(5) 定期更换培养液 95%空气 维持培养液的PH
【分析】PCR 技术全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。原理：
DNA 半保留复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。条件：模板DNA、
四种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA 聚合酶。过程：变性：DNA 解旋，高温条件下氢键解开；复性：
引物结合到互补链DNA 上；延伸：在耐高温的DNA 聚合酶催化作用下合成子链。
【详解】（1）扩增目的基因可采用PCR 技术，该技术原理是DNA 半保留复制。
（2）①为了将信号肽基因和HBsAg 基因连接在一起，在分别扩增两种基因时，应在引物F2 和引物F3 的
5′端引入一段互补序列，第一次扩增后，可得到带有互补序列的子链，在进行第二次扩增时，互补序列可
与另一个基因上的互补序列配对结合，形成新的杂交基因，再进行扩增即可获得连接在一起的融合基因；
②据图1 可知，形成融合基因后可选用引物F1 和F4 对融合基因进行PCR 扩增。
（3）①据图2 可知，限制酶XhoⅠ会破环终止子，限制酶NheⅠ会将质粒上的终止子切掉，因此应选择限制
酶MunⅠ和SalⅠ切割质粒；
②根据题干信息可知，信号肽可以引导HBsAg 进入内质网内进行合成和加工，进而以分泌蛋白的形式分泌
到胞外，因此与单独将HBsAg 基因转入CHO 细胞相比，融合基因信号肽基因表达信号肽可以引导HBsAg
以分泌蛋白的形式分泌到细胞外，便于从CHO 细胞培养液中提取HBsAg。
（4）根据题干信息可知，融合基因需要插入带有dhfr 基因的质粒共转染缺乏二氢叶酸还原酶的CHO 细胞，
只有带有重组质粒的CHO 细胞可以在培养基上生长，因此在筛选表达HBsAg 的细胞株时dhfr 基因起标记
基因的作用，便于快速筛选获得转基因成功的CHO 细胞。
（5）①在生物反应器中大规模连续培养目标细胞株时，为了防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，
需要通过定期更换培养液的方法，为培养的细胞株营造无毒的环境；
②③在生物反应器中要通入95%空气和5%CO2 的混合气体，其中CO2 的主要作用是维持培养液的PH。
7．细胞中NF-κB 蛋白的活性水平与肿瘤的发展呈正相关。为了高效地筛选出以NF-κB 为靶点的抗肿瘤药
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物，研究人员利用基因工程构建了NF-κB-GFP 的报告基因载体。具体原理为把已确定的NF-κB 基因与报
告基因GFP（其表达产物荧光蛋白可被实时检测）正确连接，使报告基因能与NF-κB 基因同步表达，其工
作模式见下图1。回答下列问题：
(1)构建NF-κB-GFP 报告基因载体时，首先利用PCR 技术扩增GFP 基因序列，能否准确扩增出GFP 基因的
关键是 。降温至50℃时，PCR 反应体系中完成的反应主要是 。
(2)GFP 基因所在DNA 分子上有3 种限制酶（BamHI、EcoRI、HindⅢ）的识别序列；如下图2 所示。限制
酶BamHI 在碱基G 和G 之间进行切割，画出其切割后产生的黏性末端（体现出限制酶的切割位点）
。应使用限制酶 对GFP 基因所在的DNA 进行切割，再连接到质粒上，该方法的优点是
。最后得到NF-κB-GFP 报告基因载体，该载体中GFP 基因和NF-κB 基因表达时使用的启动子
（填“相同”或“不同”）。
(3)将NF-κB-GFP 报告基因载体导入肿瘤细胞常用的方法是 。体外培养肿瘤细胞需要提供
（答出2 点即可）条件；再放入气体具体组成成分为 的培养箱中进行培养。
(4)将导入成功的肿瘤细胞置于含待检测抗肿瘤药物的培养基中培养一段时间，并检测细胞中GFP 蛋白表达
量的变化。若药物抗肿瘤效果显著，可观测到的现象为 。
【答案】(1) 正确设计引物 引物与两条DNA 单链（模板链）结合
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(2)
（或
） BamHI 和EcoRI 避免GFP 基因自身环化，避免GFP 基因
反向）连接 相同
(3) 显微注射法 所需要的各种营养物质，无菌、无毒的环境，适宜的温度、pH 和渗透压
95%空气+5%CO2
(4)添加该药物的培养基中，肿瘤细胞中的荧光强度显著下降
【分析】利用PCR 技术扩增目的基因（适用于目的基因的核首酸序列已知的情况）：①概念：PCR 全称为
聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。②原理:DNA 复制。③条件:模板
DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶(Taq 酶)。
【详解】（1）利用PCR 技术能准确扩增出目的基因的关键是正确设计引物。降温至50℃时，反应体系中
完成的变化主要是引物与两条DNA 单链结合。
（2）限制酶BamHI 在碱基G 和G 之间进行切割，切割后产生的黏性末端为
或
，用
BamHI 和EcoRI 两种限制酶切割GFP 基因序列所在DNA，切割后形成的黏性末端可以避免GFP 基因自身
环化，也可以避免GFP 基因反向连接。GFP 基因和NF-κB 基因要同步表达，因此需要使用相同的启动子。
（3）将外源基因导入动物细胞常用显微注射法。体外培养肿瘤细胞需要提供所需要的各种营养物质、无
菌、无毒的环境，适宜的温度、pH 和渗透压。将含肿瘤细胞的培养基置于37℃恒温培养箱中培养，培养
箱中的气体具体组成成分为95%空气+5%CO2，其中O2 是细胞代谢所必需的，CO2 的主要作用是维持培
养液的pH。
（4）本研究的目的是高效地筛选出以NF-κB 为靶点的抗肿瘤药物，由于GFP 基因是NF-κB 基因的报告基
因，因此抗肿瘤效果显著的药物使用后会使NF-κB 表达量显著下降，与NF-κB 基因具有相同启动子的GFP
基因表达量也显著下降，因此会观测到肿瘤细胞中的荧光强度显著下降的现象。
8．磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6 的活性形式，是多种酶的重要成分。科研人员从大肠杆菌(E. colik12)中找
到了合成PLP 的关键酶A，通过基因工程构建了高产PLP 的工程菌，流程如图甲所示。图甲中③过程后将
工程菌置于含氨苄青霉素的培养基中培养，对筛选出的4 个工程菌菌落进一步检测，结果如图乙所示。请
回答下列问题：
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(1)DNA 复制时，DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖即 (填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向合成互补链。
②过程是基因工程的核心工作，需要用到的两种工具酶为 。
(2)由图乙分析，只有 号菌落才是高产PLP 的工程菌菌落，原因是 。
(3)蔬菜是提供维生素的重要食物来源。科学家利用苏云金芽孢杆菌和具有防病等优良性状的枯草芽孢杆菌
进行原生质体融合，构建了多功能工程菌，其对小菜蛾的杀虫率在59%以上，对防治蔬菜病虫害具有重要
意义。
①苏云金芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的细胞壁的主要成分是 ，可选择 (填“纤维素酶
和果胶酶”“蛋白酶”或“溶菌酶”)对这两种细菌进行去壁处理，从而获得两者的原生质体。
②从培养基类型(物理性质)来讲，如何对工程菌进行筛选与扩大培养？ 。
【答案】(1) 5′→3′ 限制酶和DNA 连接酶
(2) 4 1 号无杂交带产生，说明目的基因未导入；2 号含有目的基因且能正常转录，但不能翻译；
3 号含有目的基因，但不能正常转录；4 号含有目的基因且能正常转录、翻译
(3) 肽聚糖 溶菌酶 应选用固体培养基对构建的工程菌进行筛选，然后用液体培养基对工程
菌进行扩大化培养
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→
目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖5′→3′的方向合成互补链。②过程表示基因表达载体的构建，
是基因工程的核心工作，需要用到的两种工具酶为限制酶和DNA 连接酶。
（2）图乙中1 号无杂交带产生，说明目的基因未导入，1 号只含有pETDuet-1 质粒；2 号经DNA-DNA 分
子杂交、RNA-DNA 分子杂交均产生杂交带，但经抗原—抗体杂交未出现杂交带，说明2 号含有目的基因
且能正常转录，但不能正常翻译；3 号经DNA-DNA 分子杂交产生杂交带，但经RNA-DNA 分子杂交、抗
原—抗体杂交均未出现杂交带，说明3 号含有目的基因，但不能正常转录；4 号经DNA-DNA 分子杂交、
RNA-DNA 分子杂交、抗原—抗体杂交均产生杂交带，说明4 号含有目的基因且能正常转录、翻译，故只
有4 号菌落才是高产PLP 的工程菌菌落。
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（3）①苏云金芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌等细菌的细胞壁的主要成分是肽聚糖，根据酶的专一性，可选用
溶菌酶对细菌进行去壁处理；
②筛选工程菌时需在固体培养基上进行，扩大培养时需在液体培养基上进行。
9．玉米原产亚热带，幼苗抗寒能力弱，为提高玉米植株的抗寒性，科学家利用基因工程将耐寒蛋白基因
（LEA 基因）导入玉米细胞中获得转基因玉米。如图为Ti 质粒和LEA 基因的酶切位点，其中酶A、B、C
均为限制酶。回答下列问题：
(1)将Ti 质粒和LEA 基因构建成基因表达载体需要利用酶 切割DNA，原因是 。
(2)构建好的基因表达载体导入土壤农杆菌前，需要用含（Ca2+的溶液处理土壤农杆菌，目的是 。Ti 质
粒中的氨苄青霉素抗性基因的作用是 。
(3)为确保获得的玉米植株是抗寒性较强的转基因玉米，可进行 检测，之后再进行玉米植株的耐寒性实
验。
(4)为制备强耐寒蛋白基因突变系，科研人员将单个突变碱基引入LEA 基因组cDNA 质粒克隆，流程如图。
已知在农杆菌体内合成的DNA 分子有甲基化修饰，通过PCR 扩增的DNA 链无甲基化修饰。
①已知DpnI 可识别甲基化的GATC 四个碱基序列，因此其能将 水解消化掉。
②若已知重组质粒为a 个，经过程①扩增15 个循环，需要突变引物 个，后经过程②形成的产物全部转
入农杆菌后复制n 轮，得到双链突变的DNA 个。
【答案】(1) 酶B 和酶C 保证LEA 基因插入T-DNA 中并整合到番茄细胞染色体的DNA 上；防止
Ti 质粒和LEA 基因自身环化；防止目的基因反向连接
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(2) 使土壤农杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 筛选出导入了含有目的基
因（LEA 基因）的重组质粒的受体细胞
(3)抗原一抗体杂交
(4) a、b 链 15a 15a×2n-1
【分析】限制酶识别DNA 分子中特定核苷酸序列，在特定的部位将两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
【详解】（1）农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。
由图可知，酶B 和酶C 的切割位点在T-DNA 上，因此将Ti 质粒和LEA 基因构建成基因表达载体需要利用
酶B 和酶C 切割DNA，这样可保证LEA 基因插入T-DNA 中并整合到玉米细胞染色体的DNA 上，同时可
防止Ti 质粒和LEA 基因自身环化，还能防止目的基因反向连接。
（2）Ca2+可使土壤农杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，故基因表达载体导入土壤
农杆菌前要用含Ca2+的溶液处理土壤农杆菌。Ti 质粒中的氨苄青霉素抗性基因是标记基因，其作用是筛选
出导入了含有目的基因（LEA 基因）的重组质粒的受体细胞。
（3）为确保获得的玉米植株是抗寒性较强的转基因玉米，则需要检测耐寒蛋白基因（LEA 基因）表达形
成了耐寒蛋白，因此可利用抗原-抗体杂交技术在分子水平上进行检测。
（4）①据图示可知，重组质粒经单引物PCR，替换出重组质粒中的一条单链，另一条单链和扩增出的子
链互补，通过DpnI 将重组质粒本身的a、b 链水解消化掉，保留PCR 扩增出的子链。
②扩增一次需要一个突变引物，每扩增一次产生一个一条链带有缺刻和突变的杂交质粒，已知重组质粒为
a 个，所以经过程①扩增15 个循环，需要突变引物15a 个，经过过程②得到的是一条单链环状质粒，因此
需要复制一次才能形成双链突变的DNA。因此复制n 轮，1 个单链突变的DNA 可以形成2n-1 个双链突变
的DNA，而原来含有15a 个DNA，因此经过程②形成的产物全部转入农杆菌后复制n 轮，得到双链突变
的DNA 有15a×2n-1 个。
10．1965 年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科
学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB 法是根据胰岛素A、B 两条肽链的
氨基酸序列人工合成两种DNA 片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA 法
是利用胰岛B 细胞中的mRNA 得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为
载体。
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(1)AB 法中人工合成的两种DNA 片段均有多种可能的序列的原因是 。用 （填
“AB”、“BCA”或“AB 和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2)图中是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确
连接，在设计PCR 引物时可添加限制酶 的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要
通过PCR 技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-TTTAAAGGG-，则对应引物设计的序列
是5'- -3'。
(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal 产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。据此，经钙离子
处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal 的培养
基上筛选出 色的菌落即为工程菌。
(4)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。
写出获取赖脯胰岛素基因的流程：从 →设计预期的蛋白质结构→ →找到相对于的
脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质。
【答案】(1) 一种氨基酸可能对应多种密码子 AB 和BCA
(2) XhoⅠ和MunⅠ CTCGAGTTTAAAGGG
(3)白
(4) 从预期的蛋白质功能出发 推测应有的氨基酸序列
【分析】蛋白质工程的流程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期
的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）；最终还是回到基因工程上来
解决蛋白质的合成。
【详解】（1）由于密码子的简并性，一种氨基酸可能对应多种密码子，所以AB 法中人工合成的两种
DNA 片段均有多种可能的序列。结合题干BCA 法是通过从人体胰岛B 细胞中的mRNA 得到胰岛素基因，
以及题干“AB 法是根据胰岛素A、B 两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA 片段”，而在基因的结构
中，启动子在非编码区，是不会被转录和翻译的，故AB 和BCA 法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启
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动子。
（2）根据题图，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因中间，会破坏目的基因，则在引物设
计时不能选择这两种限制酶，那么只能在XhoⅠ和MunⅠ和EcoRⅠ中选择，同时质粒上EcoRⅠ的其中一个作
用位点在标记基因上，所以只能选择XhoⅠ和MunⅠ两种限制酶，则需要在设计PCR 引物时可添加限制酶
XhoⅠ和MunⅠ的识别序列。已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-TTTAAAGGG-，其互补链的碱基序列
为-AAATTTCCC-，在设计引物时需要添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列，根据两种酶在质粒上的位置
上可知，XhoⅠ识别序列需要添加在目的基因的左侧，MunⅠ的识别序列需要添加在目的基因的右侧，由于
DNA 合成时，新链的延伸方向为5′→3′，即对应引物与模板链3′（①处互补的位置）碱基互补配对，所以
对应引物设计的序列为5′－CTCGAGTTTAAAGGG－3′。
（3）已知：β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal 产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合
题干题图，目的基因的插入破坏了lacZ 基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β-半乳糖苷酶，底物
X-gal 不会被分解，故简述筛选工程菌的过程为：经钙离子处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间
后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal 的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌。
（4）蛋白质工程的流程为：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列
→找到相对应的脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质。
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