文档文本内容
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
专题05 基因工程
从近几年的新课标卷的考查知识点来看，第24 题主要考查基因工程知识。
基因工程的流程和应用是高考的必考点，且常考常新，预计2023 年高考也不例外，依然会对其进行考查，
有可能与新的科研实事结合，综合考查基因工程的流程和应用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细胞
工程、胚胎工程等综合起来考查。
1、（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，
如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
1
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
2、（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛
形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能
是 。
2
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进行了PCR 扩
增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，溶
液中添加NaC1 至2．0mol/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在 催化
下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，
可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M 重组质粒（在
EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融
合片段M 中有白色的箭头，代表方
向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR 目的产物约为 bp。
确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连
接处上游含有Hind III+EcoR V 的识别
序列，下游含有EcoR V+BamH I 的识
别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细
胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤
3
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
毛基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量
相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环
数）。从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
倍。
3、（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m 的功能，构建了融合表达蛋白M 和tag 标签的质粒，
请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m 片段。
②为了获得融合tag 标签的蛋白M，设计引物P2 时，不能包含基因m 终止密码子的编码序列，否则将导致
。
③热启动PCR 可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA 聚合酶（Taq 酶）以外的各成分混合后，加
热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR 扩增，下列叙述正确的有
A．Taq 酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR 相比，热启动PCR 可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
4
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
D．PCR 产物DNA 碱基序列的特异性体现了Taq 酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I 切开的载体A 与添加同源序列的m 混合，用特定DNA 酶处理形成黏性末端，然后降温以促进
，形成A-m 结合体。将A-m 结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA 聚合酶及 酶等，完成质
粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m 仍能被Sma I 切开，则Sma I 的酶切位点可能在 。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3 基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿
嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag 标签，说明 ，后续实验可借助tag 标签进行蛋
白M 的分离纯化。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问
题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等
方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求
能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
1．谷氨酸脱羧酶能以谷氨酸钠为前体产生γ-氨基丁酸，蛋白质复合物SNOI-SNZI 能提高谷氨酸脱羧酶的
活性。将谷氨酸脱羧酶基因gadB(1401bp)和基因SNOI(675bp) 、SNZI (894bp) 导入大肠杆菌， 以探究该
复合物对其生产能力的影响。请回答下列问题：
(1)构建基因表达载体前，需先通过PCR 分别扩增目的基因片段，扩增反应体系应添加引物、模板、 、
缓冲液等，添加引物量不宜过多，原因主要是 。
(2)表1 是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2 是多种限制酶的识别序列和切割位点。构建重组质粒时，
先将gadB 和 pTrc99a 质粒(4176bp)分别用限制酶 进行双酶切， 并连接得到重组质粒 pTrc99a-
gadB。将基因 SNOI 和基因SNZI 分别连接到重组质粒 pTrc99a-gadB 上时， 均需用 (填限制酶)和
DNA 连接酶处理，最终得到重组质粒 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI，如图1 所示。
5
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
表1
基因
引物1 部分序列(5'→3')
引物2 部分序列(5'→3')
gadB
TCGCCCATGGCCATGATAAG
CTTCGGTACCTTAGGTATGT
SNZ1
CTAAGGATCCGAAGGAGATA
CCTTCTCTAGATTACCACCC
SNO1
TCGCGGTACCAAGGAGATAT
CTTCGGATCCTTAATTAGAA
表2
限制酶
识别序列
和酶切位点
Xba Ⅰ
T↓CTAGA
Kpn Ⅰ
GGTAC↓C
Nco Ⅰ
C↓CATGG
BamH Ⅰ
G↓GATCC
(3)采用电泳的方法对 pTrc99a 质粒、重组质粒 pTrc99a-gadB 和重组质粒 pTrc99a-gadB-SNO1-SNZI 进行
鉴定。若构建成功， 用限制酶KpnI 单酶切后电泳获得图2-A，则可推测泳道2 是 的电泳结果；用限
制酶 酶切后电泳可获得图2-B 泳道3 结果。
6
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(4)将质粒 pTrc99a、pTrc99a-gadB 和 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI 分别转化至处于 的大肠杆菌细胞中，
分别获得菌株R1、R2、R3，培养后分别接种于含一定量 的发酵培养基中，一段时间后测定γ-氨基丁
酸含量。结果如图3 所示。结果表明，与导入谷氨酸脱羧酶基因的菌株比，SNOI-SNZI 基因的导入
了其生产γ-氨基丁酸的能力，从能量代谢的角度分析，其原因有 。
2．Ⅰ、同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。下图是科研
人员利用该方法对大肠杆菌LacZ 基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB 基因
是蔗糖致死基因，LacZ 基因表达产物能将无色化合物X-gal 水解成蓝色化合物。请回答下列问题：
7
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
HindⅢ
XmaⅠ
识破序列和切割位
点
5'G↓AATTC3'
5'G↓GATCC3'
5'A↓AGCTT3'
5'C↓CCGGG3'
Ⅱ、咪唑喹啉衍生物（BEZ）和长春花碱（VLB）用于治疗卵巢癌、肝癌等癌症，为研究二者对肾癌的治
疗效果，研究人员进行了系列实验。
(1)过程①PCR 中影响退火温度的因素有引物的长度、 ，若温度过低会导致 。
(2)过程⑤中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加上 基因两端的同源序列。
8
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)过程⑦中，在含有 的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ 基因菌株。过程⑧通过
同源重组技术结合tetr-sacB 双重选择系统可对LacZ 基因进行回补，筛选LacZ 基因回补菌株时应在培养基
中添加 。
(4)探究BEZ 和VLB 单独及联合使用对肾癌细胞凋亡的影响，结果如图1 所示。该实验的自变量是 ，
实验结果表明 对癌细胞凋亡无明显影响。
(5)Caspase—3 是细胞内促凋亡蛋白，Mcl—1 是Caspase—3 基因表达的调控因子。为研究BEZ 和VLB 治疗
肾癌的机制，研究人员对各组细胞进行实验处理24 小时后，检测Mcl—1 的mRNA 和蛋白质含量，结果如
图2.选用GAPDH 作为内参的原因是 。
(6)综合图1、图2 结果，在下列箭头上标明“+”或“-”（分别表示“促进”和“抑制”），图示药物发挥
作用的机理 、 。
3．虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而
来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量
合成β-胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”（如图1）构建含BKT 基因和CRTR-B 基因的表达载体
（如图2，3），导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，回答下列问题。
(1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总DNA 为 ，设计特异性
引物扩增BKT 基因和CRTR-B 基因，此过程需要 酶的催化。
(2)构建转化载体：
①PCR 获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序
9
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
列。若将来需要将抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增
抗除草剂基因时，设计的引物序列（
→
）为 。
A．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列
B．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列
C．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列
②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将BKT 基因和CRTR-B 基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如
图2 所示，推测此过程扩增BKT 基因所用的引物为 ；扩增CRTR-B 基因所用的引物为 。
③最终形成的重组质粒如图3 所示，其中atpA 启动子和psbA 启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内
源性启动子的目的是 。
(3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养，一段时间后，挑取生长状态良
好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。两次培养的目的分别为 、 。
(4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含
的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用相关技术检测是否成功表达 。
(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，
功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿
体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。
4．具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌，侵入肠粘膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加，导致
结直肠肿瘤的形成。细菌培养与鉴定等传统检测技术费时费力，不能满足快速检测的需求。科研人员采用
基于滚环扩增技术（RCA）的荧光标记滚环扩增检测方法，实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度和
高特异性的检测。下图1 为RCA 的原理示意图，图2 为荧光标记滚环扩增检测过程示意图，其中，nusG
基因为具核梭杆菌的特异性基因，锁式探针为依据nusG 基因序列设计出来的单链DNA 分子，检测探针中
的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）在一定的范围内时，荧光会被淬灭。请回答下列问题。
10
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(1)RCA 反应体系中需添加多种物质，除图1 所示物质外，还应添加的物质是 RCA 产生长重复单链DNA
过程中，Phi29DNA 聚合酶既需催化 键的形成，也需催化 键的断裂。
(2)过程②为锁式探针进行连接以实现环化，该过程中需要的酶是 过程③中，需添加核酸外切酶进行
“消化”，据图分析“消化”的目的是 ，推测核酸外切酶的作用是 ，消化完成后，需将反应体系置
于95℃条件下持续20min 后再进行RCA 扩增，目的是 。
(3)过程④通过RCA 扩增得到长重复单链DNA，与常规PCR 相比，RCA 缺乏 环节，说明RCA 扩增过
程中所使用的Phi29DNA 聚合酶不具有 特性。
(4)若检测样品存在具核酸杆菌，经图2 中②-④过程得到的长重复单链DNA 与 特异性结合，导致FAM
与BHQ-1 距离增大，发出荧光。因为 ，提高了该检测方法的灵敏度；肠道中含有多种微生物，为保证
检测的特异性，在设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG 基因的特异性序列，同时还需注意无关序列中
。
5．黑水虻是重要的资源昆虫，体内H 基因编码的抗菌肽HI-3 具有抗菌、抗癌和免疫调节作用。科研人员
利用酵母菌生产抗菌肽HI-3，并避免基因污染。请回答下列问题：
(1)利用PCR 技术扩增H 基因，需根据H 基因设计两种引物，引物的作用有____。
A．为Taq 酶提供结合位点
B．决定扩增产物大小
C．决定反应的特异性
D．决定变性时间
(2)已知H 基因编码链的编码区序列是：5'-CTCGAGATGCTGCAG………GGATCCTC-TAGA-3'，扩增H 基
因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是 （方向为5'→3'，写出5'端8 个碱基序列）。
11
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
获得H 基因产物后需要进行凝胶电泳，将符合要求的条带 以便提取纯化并进行测序。
(3)由于抗菌肽HI-3 会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H 基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了
最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3 对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA 中
插入P 和S 基因，使质粒上H 基因的表达受红光控制。红光调控H 基因表达的原理如图1 所示。
P 和S 基因表达应为 （从“组成型表达”“红光诱导型表达”选填）。红光调控H 基因表
达的原理是S 基因指导合成的S 蛋白直接与启动子Jub 结合，P 基因表达的P 蛋白在 ，启动
H 基因的表达过程。
(4)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F 蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而
沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统如图2，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E 蛋白的
基因（E1、E2），使F 基因的表达受到蓝光控制如图3。
图3 中E2 基因持续性表达少量的E 蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力，E1 基因的作用是
。
(5)制药过程中需避免工程菌泄露到环境中引发基因污染。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T 和L）和调
控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N 的表达，进而诱导工程菌死亡，如图4。
12
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
若图中①选用的启动子为Jub ，②处选用的启动子为CYC ，则③④处结合的阻遏蛋白分别为
。
(6)请结合上述分析，利用该工程菌发酵生产抗菌肽HI-3 各阶段需控制的光照条件是：I 菌种培养阶段
；Ⅱ菌种发酵阶段 ；II 产物分离阶段 ；IV 安全处理阶段红光、蓝光同时照射。
6．结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细
胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化
为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
(1)小鼠SP110 基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110 基因的功能，
同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR 可以启动SP110 基因在吞噬细胞内的表达，将MRS 启动
子与小鼠SP110 基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。
组别
主要操作
培养细胞后，使之破裂
对照组
1
空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量
结核杆菌
细胞培养72 小时后，加入③ ，使吞噬细胞破
裂，释放结核杆菌
对照组
2
含有能广泛表达SP110 基因的山羊肺泡吞
噬细胞，①
实验组
② ，接种等量的结核杆菌
取三组实验等量的细胞裂解液，用 法培养，结果如下图1 所示。由图可知小鼠SP110 基因可用于双抗
羊的研制，依据的实验现象是 。
13
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(2)非致病性朊蛋白是由山羊13 号染色体上的PRNP 基因的第三外显子控制合成的，PRNP 基因的结构如图
2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP 基因的外显子3 序列实施定点敲除。
请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据 设计引物
进行PCR，并用 作用于PCR 产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
(3)用TALEN 敲除载体与供体DNA 表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因
定点敲入PRNP 基因的外显子3 部位，原理如图3．请指出图4 中数字1 和2 的分别代表的结构：1．
、2． 。经用 法检测，山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110 基因的表达情况是
（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。
(4)欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有 （至少写出两项）。
7．蒂蛀虫是荔枝的重要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如下图1 所示。图2 是SalI、HindⅢ和
BamHI 三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题：
14
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(1)与RNA 相比，质粒特有的化学成分是 ；抗氨苄青霉素基因的作用是 。
(2)研究人员采用了如下图巢式PCR 技术获取抗虫基因，巢式PCR 是一种变异的聚合酶链反应（PCR），
使用两对PCR 引物扩增完整的片段。第一对PCR 引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR 相似。第二对
引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR 扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR 产物内部，
使得第二次PCR 扩增片段短于第一次扩增。
①PCR 扩增时加入引物的原因是 ，在最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min 的目的是
，PCR 产物常采用 来鉴定。
②相比于常规PCR，巢式PCR 获得错误目标产物概率 ，这是因为 。
③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR 扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是 ，不
15
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
添加在引物3'端的原因是 。
(3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的 ，能携带目的基因进入受
体细胞，并将目的基因整合到受体细胞 上。
(4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可采用鉴定方法是 。
8．为筛选出宿主细胞中能与某病毒S 蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S 蛋白末端添加TAP 标签，
再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S 蛋白及其相互作用的蛋白质，过程如下图。请回答下列问题：
(1)S 基因及TAP 基因的体外扩增
①通过PCR 体外扩增S 基因时，应该在S 基因的5'端引入 和 序列，并删除S 基因3'端的 编码
序列。
②为了防止PCR 反应中发生突变，常选择高保真Pyrobest DNA 聚合酶，与一般的Taq DNA 聚合酶相比，
它具有3'到5'核酸外切酶活性，Pyrobest DNA 聚合酶能防止发生突变的原因是 。
③PCR 一般要经历三十多次循环，在第一次循环之前，常进行预变性（95℃5min），目的是 。
(2)重组质粒的构建
下表为四种限制酶的识别序列及切割位点：
限制酶
Xho l
Sma l
EcoR I
BamH l
识别序列
↓
5'-CTCGAG-3'
↓
5'-CCCGGG-3'
↓
5-GAATTC-3'
↓
5'-GGATCC-3'
16
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
3'-GAGCTC-5'
↑
3'-GGGCCC-5'
↑
3'-CTTAAG-5'
↑
3'-CCTAGG-5'
↑
由图可知TAP 标签应该插入 酶切位点之间，经限制酶切割后，为得到目标 DNA 片段，还需要通过
进行鉴定和纯化，再加入DNA 连接酶完成质粒的环化。
(3)细胞转染
使用特定转染试剂，将纯化后的重组质粒进行细胞转染，为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体
做法为 。
(4)融合蛋白的表达
①TAP 标签含有特定的氨基酸序列，可用异硫氰酸荧光素标记的 来检测融合蛋白的表达。
②研究发现，转染质粒之后融合蛋白的表达量较低，推测原因可能有
a. 重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 在病毒敏感细胞中大量复制
b. S-TAP 融合基因在病毒敏感细胞中转录出的mRNA 量较少
c. 病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA 的tRNA 数量不足
③若病毒敏感细胞在转染前感染过重组痘苗病毒，则共转染后发出荧光的细胞数量会明显增多，且荧光强
度显著增强，原因可能是 。
9．利用新冠病毒（SARS-CoV-2）包膜表面的S 蛋白研发的疫苗已在我国广泛接种。下图表示制备疫苗的
相关过程，其中m、n 分别是启动子和终止子，箭头处是限制酶的切点，SUC2 是酵母菌的蔗糖转化酶基因，
其终产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用。下表是可供选择使用的限制酶及其识别序
列和切割位点。
限制酶
BamHI
NheI
NcoI
SphI
Sau3AI
识别序列和切割位点
5'-G↓CTAGC-3'
5'-G↓GATCC-3'
5'-C↓CATGG-3'
5'-GCATG↓C-3'
5'-↓GATC-3'
(1)基因工程的核心是 。
(2)上图②过程所使用的两种酶是 ，选择两种酶切割的优点是 。
17
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)由上图推测，目的基因S 表达的模板链是 链；该目的基因的表达离不开m，原因是
。
(4)RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。利用S 蛋白的RNA 作为模
板进行过程①，首先需要加入缓冲液、原料、 酶（酶I）、引物I 等物质后进行RT，获得单链
DNA 后，还需要添加与单链DNA 互补的引物II 及酶II，在PCR 过程中酶I 所处的状态是 。在
PCR 过程中，Mg2+的作用是 。以一个单链DNA 为起点，进行n 次循环的扩增，理
论上需要 个引物Ⅱ；PCR 每次循环一般可以分为变性、 、延伸三步。
(5)SUC2 作为B 上的标记基因，可以对导入B 的酵母菌进行筛选。筛选时，需要使用以蔗糖为唯一碳源的
培养基，对受体突变型酵母菌的要求是 。
(6)与普通灭活或减活疫苗相比，上述方法制备的疫苗对人体更安全，主要原因是 。
10．α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β 和γ 环糊精的混合物，
分离纯化十分不便。cgt 在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt 的372 位天冬氨酸和89 位酪氨酸是
酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt 催化
特异性提高了27 倍。请回答下列问题。
(1)蛋白质工程的第一步通常是确定预期的 。重叠PCR 是常用的DNA 定点突变技术，其原理如图所
示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR 不需要用到 酶。要完成两处位点的突变，至少要设计 种
引物。
(2)下图是该酶编码链的部分序列，请你设计替换372 位天冬氨酸（密码子：GAU、GAC）到赖氨酸（密码
18
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
子：AAA、AAG）的引物FP2 和RP1 中三个连续碱基，分别为 、 。
(3)用大肠杆菌大量生产重组cgt 需要解决酶的分泌问题。重组cgt 位于双突变载体（简称Ｔ载体）上，研究
人员将重组cgt 基因与pET-20b（+）载体（简称p 载体）上的pelB 信号肽序列连接，构成重组载体cgt-p，
该过程如图所示。应选用 、 对T 载体酶切处理，用 、 对p 载体进行酶切处理，并用
酶构建重组载体cgt-p，导入目的工程菌。培养基中除基本营养外，还需加入 完成筛选。
19
