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热点02 基因编辑与生物技术（CRISPRCas9 等）
目录
1.热点解读：热点命题方向解读、核心考点明晰
2.关联教材：链接教材掌知识、基础打牢应万变
3.命题趋势：明考情知方向、巧预测押热点
3.创新演练：知情境、练突破（30min 限时练)
热点解读
1.技术突破与创新：CRISPR/Cas9 技术自问世以来发展迅速，如2019 年开发出的“先导编辑”技术，比传
统Cas9 效率更高、副产物更少、脱靶率更低，可修正约89%的已知与疾病相关的人类遗传变异体。
2.医学应用进展：在治疗遗传病方面，如美国FDA 批准了Casgevy 上市，用于治疗12 岁及以上伴有复发性
血管闭塞危象的镰状细胞病患者。在肿瘤治疗中，可用于修改免疫细胞以攻击癌细胞，在抗病毒治疗中，
也在探索用于切断并清除病毒DNA。
3.农业领域应用：通过CRISPR/Cas9 技术可以开发抗霉菌、害虫和干旱的作物，提高作物产量、抗病虫害
能力以及营养价值，对保障全球粮食安全意义重大。
4.伦理法律热议：基因编辑尤其是人类胚胎基因编辑引发了广泛的伦理争议，涉及基因歧视、违反自然规
律以及对未来人类产生不可预测的影响等问题。许多国家都对基因编辑技术实施了严格的监管措施。
关联教材
1.高中生物教材：人教版选择性必修3《生物技术与工程》涉及基因编辑相关内容，包括基因工程的基本
工具、操作步骤等基础知识，CRISPR/Cas9 技术可作为基因工程中基因编辑工具的典型案例，帮助学生理
解基因编辑的原理和应用。
2.大学相关教材：在分子生物学、细胞生物学、基因工程等课程教材中，会深入讲解CRISPR/Cas9 技术的
发现历程、作用机制、应用领域及潜在风险等内容，如阐述CRISPR/Cas9 系统如何利用RNA 分子指导
Cas9 蛋白精确识别并切割目标DNA 序列，还会结合具体实验案例，让学生掌握该技术在基因功能研究、
疾病模型构建等方面的应用。
命题趋势明考情知方向
1
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1.考查深度和广度增加：在生物学科的考试命题中，对CRISPR/Cas9 技术的考查不再局限于简单的原理和
概念，会更深入地涉及技术细节、应用实例以及与其他生物学知识的综合。如结合基因表达、细胞分化、
遗传规律等知识，考查学生对基因编辑在生物个体发育、遗传变异等方面影响的理解。
2.注重科学思维与探究能力：可能会给出具体的实验情境或研究案例，要求学生分析实验设计、预测实验
结果、评价实验方案，以考查学生的科学思维和探究能力。例如，给出一个利用CRISPR/Cas9 技术进行基
因治疗的实验方案，让学生指出其中的优缺点并提出改进措施。
3.结合社会热点与伦理问题：由于基因编辑技术涉及伦理、法律等社会问题，命题会越来越多地将技术知
识与社会热点相结合，考查学生对科学技术与社会关系的理解和思考。如让学生分析基因编辑在人类胚胎
应用中的伦理争议，或探讨基因编辑技术在农业生产中可能带来的生态风险及应对措施。
创新演练（建议用时：45 分钟）
一、单选题
1．（24-25 高三上·湖北武汉·期末）白粉菌寄生引起小麦白粉病，科学家用基因组编辑技术改造小麦的感
病基因，获得了抗白粉病的基因突变体。在验证突变体对白粉病的抗性实验中，所需的白粉菌一般用离体
叶片接种法培养并保存。下列叙述错误的是（ ）
A．小麦与白粉菌协同进化
B．基因编辑使感病基因实现了定向突变
C．培养基应直接为叶片提供营养物质
D．离体叶片使用前需要灭菌
【答案】D
【分析】不同物种之间、生物与无机环境之间在相互影响中不断进化和发展，这就是协同进化。
【详解】A、协同进化是指不同物种之间、生物与无机环境之间在相互影响中不断进化和发展。小麦与白
粉菌之间是寄生关系，在长期的生存斗争中，二者相互影响，共同进化，所以小麦与白粉菌协同进化，A
正确；
B、基因组编辑技术可以对特定基因进行改造，使感病基因按照人们的意愿发生定向突变，从而获得抗白
粉病的基因突变体，基因编辑使感病基因实现了定向突变，B 正确；
C、白粉菌寄生在小麦体内，不能用培养基直接培养，为了验证突变体对白粉病的抗性实验中，所需的白
粉菌一般用离体叶片接种法培养并保存，所以培养基是直接为叶片提供营养物质的，C 正确；
D、为了验证突变体对白粉病的抗性实验，所需的白粉菌一般用离体叶片接种法培养并保存，所以离体叶
2
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片使用前不需要灭菌，D 错误。
故选D。
2．（2024·云南红河·一模）目前癌症复杂难治，但基因编辑技术为癌症的治疗带来了新思路。基因编辑技
术即在基因组水平上对DNA 分子的碱基序列进行定位与修改。我国科学家利用诱导逆转技术可使肝癌细胞
向正常细胞逆转。下列叙述错误的是（ ）
A．与正常细胞相比，癌细胞的端粒可能不会随分裂而缩短
B．诱导逆转技术致力于研究逆转突变的原癌基因或抑癌基因
C．基因编辑技术可将DNA 序列串联起来，从而导致染色体变异
D．基因编辑技术有助于癌症的治疗，但也可能出现社会伦理问题
【答案】C
【分析】细胞癌变的根本原因是原癌基因和抑癌基因发生基因突变，其中原癌基因负责调节细胞周期，控
制细胞生长和分裂的过程，抑癌基因主要是阻止细胞不正常的增殖。
【详解】A、癌细胞能不断修复缩短的端粒DNA 序列，可以无限增殖，正常细胞的端粒随着细胞分裂次数
的增加会逐渐变短。与正常细胞相比，癌细胞的端粒可能不会随分裂而缩短，A 正确；
B、细胞癌变的根本原因是原癌基因或抑癌基因的突变，因此诱导逆转技术致力于研究逆转突变的原癌基
因或抑癌基因，B 正确；
C、基因编辑技术可将DNA 序列串联起来，从而导致基因突变，C 错误；
D、基因编辑技术有助于癌症的治疗，但也可能出现社会伦理问题，因此科学家在使用时需要严守规则，D
正确。
故选C。
3．（2025·新疆·二模）体色鲜艳的君主斑蝶幼虫以马利筋属的有毒植物为食，并从中获取毒素强心苷，以
保护幼虫和成虫。研究发现，强心苷的靶蛋白钠钾泵在斑蝶中发生了氨基酸替换，使其不被强心苷影响。
科学家通过对果蝇钠钾泵基因的编辑，获得了对强心苷不敏感的突变体。下列有关说法错误的是（ ）
A．君主斑蝶和马利筋属植物是互利共生关系，两物种之间没有相互选择
B．君主斑蝶幼虫体色鲜艳容易被其他动物发现是其适应环境的一种表现
C．对强心苷敏感的果蝇和不敏感的果蝇突变体不能体现物种多样性
D．对基因进行编辑从而获得对强心苷不敏感的果蝇体现了生物多样性的直接价值
【答案】A
【分析】不同物种之间、生物与无机环境之间在相互影响中不断进化和发展，这就是协同进化。通过漫长
的协同进化过程，地球上不仅出现了千姿百态的物种，丰富多彩的基因库，而且形成了多种多样的生态系
3
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统。
【详解】A、根据题意可知，君主斑蝶和马利筋属植物是互利共生关系，两物种之间存在相互选择，A 错误；
B、君主斑蝶幼虫体色鲜艳是一种保护色，其容易被其他动物发现进而起到警示的作用，这是其适应环境
的一种表现，B 正确；
C、对强心苷敏感的果蝇和不敏感的果蝇突变体不能体现物种多样性，因为它们是同一物种，可以体现基
因多样性，C 正确；
D、对基因进行编辑从而获得对强心苷不敏感的果蝇，该事实没有体现生物多样性的间接价值，体现了生
物多样性的直接价值，D 正确。
故选A。
4．（2024·山东泰安·二模）某研究团队利用基因编辑技术，对小鼠卵母细胞的7 个甲基化印记控制区域进
行DNA 甲基化重写，并将一个极体注入修饰后的次级卵母细胞中，成功创造了孤雌生殖的小鼠，操作过程
见下图。下列叙述错误的有（ ）
A．上述甲基化重写没有改变卵母细胞的遗传信息
B．移植后的囊胚进一步扩大，会导致滋养层破裂，胚胎从其中伸展出来
C．甲基化重写可能有利于次级卵母细胞完成减数分裂Ⅱ并与极体融合
D．子代小鼠一定为雌性，基因型不一定与提供卵母细胞的雌鼠相同
【答案】B
【分析】表观遗传是指DNA 序列不发生变化，但基因的表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化
而表现型却发生了改变，如DNA 的甲基化，甲基化的基因不能与RNA 聚合酶结合，故无法进行转录产生
mRNA，也就无法进行翻译，最终无法合成相应蛋白，从而抑制了基因的表达。
【详解】A、上述甲基化重写没有改变DNA 的序列，没有改变卵母细胞的遗传信息，A 正确；
B、移植后的囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫作孵化，B 错误；
C、由图可推测，甲基化重写可能有利于次级卵母细胞完成减数分裂Ⅱ并与极体融合进行胚胎发育，C 正确；
D、“孤雌小鼠”是由两个生殖细胞（修饰后的次级卵细胞和另一个卵子的极体）结合后发育形成，同时
由于配子在形成过程中会经历减数分裂的基因重组，或发生基因突变，将导致两个生殖细胞结合后的“孤
雌小鼠”其基因型不一定与提供卵母细胞的雌鼠相同，D 正确。
故选B。
4
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5．（24-25 高三上·山西大同·阶段练习）如图表示科研人员利用基因编辑技术治疗某种遗传性肝病的技术
流程。下列说法错误的是（ ）
A．原代肝细胞培养的培养液中需要通入95%的空气和5%的二氧化碳
B．在培养液中悬浮培养的肝细胞会出现接触抑制和细胞贴壁现象
C．基因编辑过程会发生磷酸二酯键的断裂和重新连接，引起基因突变
D．模型小鼠患有与患者相同的遗传性肝病，对植入的肝细胞会产生免疫排斥
【答案】B
【分析】在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、
胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬
液放 入培养瓶或培养皿内，置于适宜环境中培养。
【详解】A、原代肝细胞培养的培养液中需要通入95%的空气和5%的二氧化碳，A 正确；
B、在培养液中悬浮培养的肝细胞不会出现接触抑制和细胞贴壁现象，B 错误；
C、基因编辑过程需要将引起遗传病的基因片段切除后编辑成为正常基因，该过程会发生磷酸二酯键的断
裂和重新连接，并且引起基因碱基序列的改变，即发生了基因突变，C 正确；
D、该技术是为了检测基因编辑治疗的效果，因此模型小鼠应该患有与患者相同的遗传性肝病，以检测基
因编辑技术是否有效。由于导入模型小鼠的细胞来自人类，因此小鼠会对植入的肝细胞产生免疫排斥，D
正确。
故选B。
6．（24-25 高三上·湖北宜昌·开学考试）我国科学家在国际上首次构建出具有一条染色体的活酵母细胞。
他们利用基因编辑工具CRISPR/Cas9 切割端粒附近的基因组序列，再利用修复 DNA 切口的酶让两条染色
体融合在一起。同时，他们还移除了两条染色体中的一个着丝粒。下列叙述正确的是（ ）
A．人造酵母菌只有1 条染色体，无法进行有丝分裂
B．仅保留一个着丝粒可减少染色体在细胞分裂时发生断裂的概率
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C．染色体切割和拼接过程中发生的可遗传变异是基因突变
D．CRISPR/Cas9 可以准确的识别目标序列进行切割和修复
【答案】B
【分析】分析题干信息：他们利用基因编辑工具CRISPR-Cas9 切割端粒附近的基因组序列，进而利用修复
DNA 切口的酶让两条染色体融合在一起，说明该过程发生了染色体变异。
【详解】A、人造酵母菌虽然只有1 条染色体，但可以进行有丝分裂，A 错误；
B、仅保留一个着丝粒可以避免染色体在细胞分裂时发生断裂，保证细胞分裂时染色体的稳定性，B 正确；
C、染色体切割和拼接过程中发生的可遗传变异是染色体变异，C 错误；
D、利用基因编辑工具CRISPR/Cas9 切割端粒附近的基因组序列，再利用修复 DNA 切口的酶让两条染色体
融合在一起，说明修复不是利用CRISPR/Cas9，D 错误。
故选B。
二、多选题
7．（24-25 高三上·河北沧州·期末）ThTC 是一种经基因编辑技术改造后的新型治疗性肿瘤活疫苗，它失去
了成瘤能力，但能自主分泌干扰素β(IFNβ)。当ThTC 被注射到患者体内后，它能够像“间谍”一样，以肿
瘤“友军”的伪装身份顺利找到肿瘤细胞聚集地，然后分泌IFNβ 向机体的免疫系统发出强烈信号，从而激
活免疫细胞识别和清除肿瘤（部分作用机制如下图所示）。下列关于ThTC 及其相关作用的叙述，正确的是
（ ）
A．为避免ThTC 被自身分泌的IFNβ 攻击，需用基因编辑技术去除其膜上IFNβ 受体
B．IFNβ 作为一种细胞因子，具有抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能
C．当记忆T 细胞再次遇到相同的抗原时，迅速分裂分化为细胞毒性T 细胞产生免疫反应
D．针对ThTC 的基因编辑改造可使其获得无限增殖能力，并可继续提高疫苗的安全性
【答案】ABC
【分析】已知ThTC 指的是经基因编辑技术改造后失去成瘤能力，但能自主分泌干扰素β（IFNβ）的一种新
型治疗性肿瘤活疫苗，它能发挥阻断肿瘤生长且引起机体免疫反应等效用，可用来预防癌症发生。
6
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【详解】A、因为IFNβ 是通过与细胞表面的特异性受体结合来发挥作用的，如果ThTC 细胞表面存在这些受
体，那么它们就有可能被自身分泌的IFNβ 攻击。所以为避免这种情况，需要用基因编辑技术去除 ThTC 细
胞膜上的 IFN β 受体，A 正确；
B、 IFNβ 是一种细胞因子，它具有多种生物学功能，包括抗肿瘤和免疫调节等，B 正确；
C、当记忆T 细胞再次遇到相同的抗原时，会立即分化为细胞毒性T 细胞产生免疫反应，C 正确；
D、ThTC 的基因编辑技术改造并不是为了使其获得无限增殖能力。相反，这样改造的目的是去除ThTC 的成
瘤能力，避免成为新的肿瘤组织，同时保留或导入能够自主分泌IFNβ 的基因，使其成为一种安全有效的肿
瘤治疗性疫苗，D 错误。
故选ABC。
8．（24-25 高三下·山东·开学考试）免疫缺陷猪模型在科研中有重要应用。科研人员利用基因编辑技术敲
除了猪的RGI 基因，并将受体细胞培养为适宜阶段的胚胎，然后通过胚胎移植技术获得了免疫缺陷猪。下
列说法正确的是（ ）
A．向RGl 基因中插入外源片段使其失活，是实现基因敲除的方法之一
B．利用DNA 重组技术培育免疫缺陷猪，常采用受精卵作为受体细胞
C．含重组受体细胞的培养液中应加入促性腺激素促使其分裂分化
D．应通过配型处理避免异体胚胎与受体子宫之间的免疫排斥反应
【答案】AB
【分析】胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、
生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。
【详解】A、通过向RGl 基因中插入外源片段来破坏其原有碱基序列从而使其失活，是实现基因敲除的方法
之一，A 正确；
B、利用DNA 重组技术培育免疫缺陷猪，将目的基因导入动物细胞时，通常以受精卵为受体细胞，使用显
微注射法导入，B 正确；
C、含重组受体细胞，用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+ 载体、 乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）激活，使
其完成细胞分裂和发育进程，C 错误；
D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，这为移植的胚胎在受体的存活提供了可能，因此胚
胎移植时不需要进行配型处理，D 错误。
故选AB。
9．（2024·吉林·二模）六倍体普通小麦的染色体组成为AABBDD(A、B、D 表示不同染色体组)，每个染色体
组均含一个Mlo 基因。为获得具有广谱抗白粉病的普通小麦，科研人员利用基因编辑技术，删除Mlo 基因
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中的部分碱基，并通过杂交育种获得一系列Mlo 基因功能缺失的纯合突变体，发现只有每个染色体组Mlo
基因功能均缺失的突变体才具有广谱抗白粉病的特性。下列叙述正确的是（ ）
A．该基因编辑技术依据的原理是基因突变
B．Mlo 基因功能缺失的纯合突变体有7 种
C．单倍体育种中常用秋水仙素处理单倍体种子使其染色体数目加倍
D．不同的纯合突变体杂交，子一代中均不具有广谱抗白粉病的特性
【答案】ABD
【分析】DNA 分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变。
【详解】A、基因编辑技术是删除Mlo 基因中的部分碱基，属于碱基对的缺失，故该基因编辑技术依据的
原理是基因突变，A 正确；
B、假设此小麦的基因型为AABBDD，删除每个染色体组的一个Mlo 基因中的部分碱基，得到的突变体的基
因型为A1A1B1B1D1D1，则Mlo 基因功能缺失的纯合突变体有A1A1BBDD、AAB1B1DD、AABBD1D1、A1A1B1B1DD、
A1A1BBD1D1、AAB1B1D1D1、A1A1B1B1D1D1共7 种，B 正确；
C、单倍体高度不育，不能产生种子，单倍体育种中常用秋水仙素处理单倍体幼苗使其染色体数目加倍，C
错误；
D、不同的纯合突变体杂交，后代均为杂合子，而具有广谱抗白粉病的特性的个体是每个染色体组Mlo 基
因功能均缺失的纯合子突变体，因此不同的纯合突变体杂交，子一代中均不具有广谱抗白粉病的特性，D
正确。
故选ABD。
10．（2024·黑龙江牡丹江·模拟预测）我国科学家利用小鼠单倍体胚胎干细胞和CRISPR 基因编辑工具，将
中等长度的4 号和5 号染色体进行首尾连接，染色体连接过程中会发生染色体的断裂和重新连接，最终培
育出ch14+5 单倍体小鼠，并利用技术手段获得ch14+5 二倍体纯合小鼠。下列叙述正确的是（ ）
A．单倍体小鼠中无同源染色体、表现为高度不育
B．染色体连接过程中存在磷酸二酯键的断裂和形成
C．染色体连接后可提高基因表达水平、属于有利变异
D．ch14+5 二倍体纯合小鼠可能增加了小鼠的遗传多样性
【答案】ABD
【分析】可遗传的变异包括基因突变、基因重组和染色体变异：
（1）基因突变是指基因中碱基对的增添、缺失或替换导致的基因结构的改变；
（2）基因重组是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的非等位基因重新组合；
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（3）染色体变异包括染色体结构变异（重复、缺失、易位、倒位）和染色体数目变异。
【详解】A、单倍体小鼠细胞中只有一个染色体组，无同源染色体、表现为高度不育，A 正确；
B、染色体由DNA 和蛋白质构成，染色体连接过程中会发生染色体的断裂和重新连接，过程中涉及DNA 的
断裂和连接，所以存在磷酸二酯键的断裂和形成，B 正确；
C、4 号和5 号染色体进行首尾连接属于染色体变异，根据题干信息无法判断此变异是有害还是有利，染色
体变异大多是有害的，C 错误；
D、ch14+5 二倍体纯合小鼠与原先正常小鼠相比，遗传物质改变，可能增加了小鼠的遗传多样性，D 正确。
故选ABD。
三、非选择题
11．（24-25 高三下·广东东莞·阶段练习）异体器官移植是替代器官功能的有效途径，因器官严重短缺而受
到限制，科学家试图通过异种体内培育人源化器官来解决器官供体短缺难题，但此前从未成功。我国科学
家综合利用多种现代生物技术，首次在猪胚胎内培育出主要由人体细胞构成的“人一猪嵌合中期肾”，且
维持到胚胎第28 天。该研究成功实现了首例人源化中肾的异种体内再生壮举。图1 为实验过程示意图，
①～③为技术操作或生理过程，图2 为CRISPR-Cas9 基因编辑示意图。请回答下列问题：
(1)为了敲除掉与猪肾脏发育密切相关的关键基因SLX1，图1 过程①采用了CRISPR-Cas9 基因编辑技术。
Cas9 蛋白的作用是 ，科学家设计的向导RNA，应具有的特征有 。科学家敲除掉SLIX1 基因的目
的是 。
(2)过程②需要先激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程。在重构胚发育到 时，科学家将iPS 细胞
注入，形成嵌合胚胎。
(3)图中过程③所用诱导多能干细胞（iPS）来自 （填“人”或“猪”）。
(4)请根据以上研究过程并结合所学知识，对“利用动物来培育人类器官”这一热点议题进行评价
（从造福人类、生命安全、伦理问题等角度分析，至少写出2 点）。
【答案】(1) Cas9 蛋白可以对DNA 进行切割（或“使磷酸二酯键断裂”） 能够识别并结合目标
DNA，与Cas9 蛋白形成复合物（或“帮助Cas9 蛋白识别和结合到目标DNA 上”） 使猪胚胎在发育过
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程中避免猪细胞与外来的iPS 竞争肾脏发育位置，促进人类肾脏发育
(2)桑葚期（或囊胚期）
(3)人
(4)利用动物来培育器官，可以解决器官短缺而受限的问题，但难度较高、风险较大，人体可能会产生排异
反应，影响受体的生命安全；从伦理上看，也存在较大的问题，例如可能会出现带有人体细胞的嵌合体动
物，又或者人体遗传物质进入猪的生殖系统，而产生带有人类特征的未知动物等
【分析】细胞全能性是指已经分化的细胞，仍然具有发育成完整生物体的潜能。在多细胞生物中，每个体
细胞的细胞核都含有个体发育的全部基因，只要条件许可，都可发育成完整的个体。诱导多能干细胞技术
是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。分化的细胞在特定条件下被逆
转后，恢复到类似胚胎干细胞。分化是基因选择性表达的结果，并没有改变遗传物质，而重编程在某种意
义上就是分化的一个逆转。
【详解】（1）根据图示，Cas9 蛋白的作用是对DNA 进行切割（或“使磷酸二酯键断裂”），为了在特定
位点切割DNA 序列，科学家设计的向导RNA，应具有的特征有能够识别并结合目标DNA，与Cas9 蛋白形
成复合物（或“帮助Cas9 蛋白识别和结合到目标DNA 上”）；实验目的是猪胚胎内培育出主要由人体细
胞构成的“人一猪嵌合中期肾”，科学家敲除掉SLIX1 基因的目的是使猪胚胎在发育过程中避免猪细胞与
外来的iPS 竞争肾脏发育位置，促进人类肾脏发育。
（2）在重构胚发育到桑葚期（或囊胚期）时，细胞开始进行发育，科学家将iPS 细胞注入，形成嵌合胚胎。
（3）最终是获得主要由人体细胞构成的“人一猪嵌合中期肾”，因此图中过程③所用诱导多能干细胞
（iPS）来自人，选择iPS 作为肾脏供体细胞的原因是iPS 具有与胚胎干细胞类似的分裂和分化能力，在特定
条件诱导下能定向分化为特定的组织器官。
（4）利用动物来培育器官，可以解决器官短缺而受限的问题，但难度较高、风险较大，人体可能会产生
排异反应，影响受体的生命安全；从伦理上看，也存在较大的问题，例如可能会出现带有人体细胞的嵌合
体动物，又或者人体遗传物质进入猪的生殖系统，而产生带有人类特征的未知动物等。
12．（24-25 高三下·重庆沙坪坝·开学考试）研究发现，基因D 能通过脱落酸信号途径调控大豆的耐盐碱特
性。为培育耐盐碱大豆品系，科研人员利用基因编辑技术改变基因d 中一个碱基对成为基因D。培育多代
获得杂合的大豆耐盐碱品系，但并未获得耐盐碱性状，检测发现基因D 在大豆中处于沉默状态。现将基因
D 的向导序列和核酸酶基因M 相连一起构成融合片段导入大豆细胞染色体，向导DNA 序列转录产物引导核
酸酶打破基因D 沉默状态，获得耐盐碱大豆。将导入上述含M 基因融合片段的耐盐碱大豆品系甲、乙、丙
分别与野生型大豆杂交，结果如表。不考虑自然基因突变和互换。
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组别
亲本耐盐碱大豆
子代
第一组
甲
耐盐碱：不耐盐碱=1：1
第二组
乙
耐盐碱：不耐盐碱=1：3
第三组
丙
?
(1)导入基因D 的向导序列和核酸酶基因M 获得耐盐碱性状大豆的育种原理是 。
(2)大豆甲的基因型为 （染色体无M 基因记为M-）。第三组子代的表型是 。
(3)对大豆中基因D、d 通过PCR 扩增，再用SacI（5'-GAGCT↓C-3'）限制酶切割后电泳，获得三种类型大豆的
电泳结果如图。
①Ⅲ对应的大豆类型基因型是 。
②欲获得适合盐碱大田种植的可稳定遗传的大豆品系，请从品系甲、乙、丙中选择材料，运用已有的限制
酶、电泳和育种技术，选育出所需要品系。补充实验思路。
选用品系 ，将 作为实验材料分别提取DNA，并 后电泳，筛选电泳图中 个条带电泳结果的
个体，即获得适合盐碱大田种植的稳定遗传大豆品系。
【答案】(1)基因重组
(2) DdMM- 全为不耐盐碱
(3) DD 甲（DdMM-）进行自交 子代（F1代或子一代） SacI 限制酶切割 仅含有两
个
【分析】1、基因突变是DNA 分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，从而引起基因结构的改变。基因重
组主要是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组合。染色体变异可以分为染色
体结构变异和染色体数目变异。 2、位于一对同源染色体上的一对等位基因遵循基因的分离定律。
【详解】（1）导入向导DNA 序列和M 获得耐盐碱性状大豆属于利用的是基因工程技术，或者说是转基因
技术，该技术原理是基因重组。
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（2）题干提供信息是用导入一个M 基因的耐盐碱大豆与野生大豆杂交，野生大豆的基因型因该是dd，导
入一个M 基因的耐盐碱大豆的基因中肯定含有M 基因和D 基因，由于第一组子代个体耐盐碱：不耐盐碱
=1：1，由此推测第一组甲产生的配子中同时含M 与D 的配子占比为0.5，实验应该是测交方式进行的，即
Dd：dd=1:1，且D 基因应该与M 基因连锁在同一条染色体上，这样含耐碱性基因D 的全部个体才能表现出
耐碱性来，故大豆甲的基因型应表示为DdMM-。实验二的子代表现为耐盐碱：不耐盐碱=1：3，可推测乙
个体产生的配子中同时含D 与M 基因的配子占比为0.25，可推测M 基因所在的染色体与D 所在的染色体
为非同源染色体，且乙的基因型为MM-Dd，减数分裂产生的配子及类型比为MD：d：D：Md=1:1:1:1，所
以乙与野生型大豆dd 个体杂交产生的后代中耐盐碱：不耐盐碱=1：3。导入一个M 基因的耐盐碱大豆细胞
中还存在另外一种情况就是M 与d 连锁在同一条染色体上，即丙个体，其基因型为DdMM-，产生的配子种
类及类型比为D：Md=1:1,与野生型大豆个体dd 杂交后产生的后代基因型为Dd 和Mdd，两者中均没有D 基
因的表达，故第三组子代的表现型是全为不耐盐碱的。
（3）①根据题干提供的基因D 与d 的序列，在基因D 序列上有一个SacⅠ的酶切位点，酶切后电泳，可以
看到两个条带，而基因d 的序列中无SacⅠ的酶切位点，所以不会被酶切。故若电泳图中看到两个条带电
泳结果的表示纯合突变植株DD，一个条带电泳结果的表示野生型植株dd，三个条带电泳结果的表示杂合
植株Dd，所以Ⅲ对应的基因型是DD。②欲获得适合盐碱大田种植的可稳定遗传的大豆品系，请从品系甲、
乙、丙中选择材料，运用已有的限制酶、电泳和育种技术，选育出所需要品系。补充实验思路是欲获得适
合盐碱大田种植的稳定遗传大豆，根据（2）问中的分析，可知应选用D 基因与M 基因连锁在同一条染色
体上的个体甲（MDd）进行自交，将获得的子代个体（包括MMDD、MDd、dd 三种基因型）作为实验材料
分别提取DNA，并用SacⅠ（5'-GAGCT↓C-3'）限制酶切割后电泳，电泳图中看到两个条带电泳结果的表示
植株MMDD,该个体为纯合体，即适合盐碱大田种植的稳定遗传大豆。
13．（2025·四川绵阳·二模）CRISPR/Cas9 基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具
sgRNA/Cas9 来源于原核细胞，包括具有导向功能的sgRNA 和行使DNA 双链切割功能的Cas9 蛋白，技术原
理如图甲所示。回答下列问题：
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I.某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231 细胞、Lenti-CAS9-sgRNA 质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细
胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，以研究该基因在细胞中的作用，为乳腺癌的治疗提供理论支持。
(1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9 蛋白基因如图乙，故只需要根据 基因的
部分序列人工合成sgRNA 基因即可。
(2)构建表达载体。人工合成的sgRNA 基因如图丙，需要通过 扩增，为了确保酶切后能正确连
接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1 的5'端加上碱基序列 ，引物2 的5'端加上
碱基序列 。
(3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA 基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳
腺癌MDA-MB-231 细胞。感染后用 筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是
。
(4)检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d 后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检
测特定蛋白质的原理是 。
Ⅱ、其他应用
(5)敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工
具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与 相同的序列。
(6)对基因或染色体定位跟踪。将Cas9 基因改造成Cas9i 基因（表达的Cas9i 蛋白丧失切割功能），并与绿
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色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i 基因—GFP 基因—终止子—，
最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP 荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9 基因
的技术属于 （填“基因工程”“蛋白质工程”“酶工程”）。
(7)调控基因表达。转录因子M 如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转
录。要通过sgRNA/Cas9i 工具促进乳腺癌细胞中的X 基因表达，表达载体构建关键部分为： 。
【答案】(1)人源粘着斑蛋白（VCL）
(2) PCR 5'AGATCT3' 5'GCTAGC3'
(3) 卡拉霉素和潮霉素 在检测敲除效果时作对照
(4)抗原抗体特异结合
(5)Cas9 切点两侧碱基序列
(6)蛋白工程
(7)—启动子—Cas9i 基因—M 基因—终止子—
【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基
因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
2、基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、运载体。
3、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
【详解】（1）具有导向功能的sgRNA 和行使DNA 双链切割功能的Cas9 蛋白，以人乳腺癌MDA-MB-231 细
胞、Lenti-CAS9-sgRNA 质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，获
取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9 蛋白基因如图乙，故只需要根据人源粘着斑蛋白（VCL）基
因的部分序列人工合成sgRNA 基因即可。
（2）构建表达载体。人工合成的sgRNA 基因如图丙，需要通过PCR 扩增，为了确保酶切后能正确连接到
质粒上（相应酶切序列如图丙），选用BglⅡ和NheⅠ酶，需在引物1 的5 端加上碱基序列5'AGATCT3'，引
物2 的5'端加上碱基序列5'GCTAGC3'。
（3）导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA 基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同
的乳腺癌MDA-MB-231 细胞。根据标记基因，感染后用卡拉霉素和潮霉素筛选稳转细胞系。设计转入空质
粒的乳腺癌细胞的目的是在检测敲除效果时作对照。
（4）检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d 后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。
检测特定蛋白质的原理是抗原抗体特异结合。
（5）敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编
辑工具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与Cas9 切点两侧碱基序列相同的序列。
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（6）对基因或染色体定位跟踪。将Cas9 基因改造成Cas9i 基因（表达的Cas9i 蛋白丧失切割功能），并与
绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i 基因—GFP 基因—终止子—，
最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP 荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9 基因
的技术属于蛋白质工程。
（7）调控基因表达。转录因子M 如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基
因转录。要通过sgRNA/Cas9i 工具促进乳腺癌细胞中的X 基因表达，表达载体构建关键部分为—启动子—
Cas9i 基因—M 基因—终止子—。
14．（24-25 高三上·山东青岛·期末）CRISPR/Cas9 是一种基因编辑技术，由gRNA 和Cas9 蛋白两大部分组成，
gRNA 由crRNA 和tracrRNA 组成，其中crRNA 约20 个碱基，含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9 切
开靶基因所在双链DNA，随后细胞将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑（图1）。载脂
蛋白E（Apoe）是低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的组成部分，在脂质运输中发挥重要作用。为探究Apoe 在
小鼠血脂代谢的作用，研究人员采用CRISPR/Cas9 构建了Apoe 敲除小鼠，具体过程是：根据小鼠Apoe 基
因序列分别设计2 号和3 号外显子的gRNA 靶位点，敲除2 号和3 号外显子序列（约200 个碱基），构建
Apoe 敲除模型小鼠，过程见图2。
(1)敲除2 号和3 号外显子需要设计 个gRNA 靶位点，靶位点的设计时需要注意 。（写出1
点）
(2)质粒px330 是常用的哺乳动物基因编辑质粒，现已知Apoe 基因序列，为获得模型鼠，图2 中“某序列”
是指 ，获得重组质粒后，用 法导入受体细胞。
(3)为确定实验鼠是否为模型小鼠，需要用PCR 技术扩增并检测实验鼠的 ，最终获得Apoe 敲除纯合
小鼠。
(4)胆固醇需要与Apoe 结合才能在血浆中正常运输。检测3-4 月龄模型小鼠血清的胆固醇指标，结果见图
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3。实验表明Apoe 基因通过提高血浆中LDL-C 的含量来提高血浆中总胆固醇水平，该结论的依据是 。
【答案】(1) 4/四 确保每一个gRNA 在小鼠的基因组中仅有一个目的靶点（每一个gRNA 序列只能
与目的序列结合)
(2) 2 号、3 号外显子上下游（部分)序列 显微注射
(3)Apoe 基因
(4)Apoe 敲除纯合小鼠的总胆固醇水平高于对照组小鼠，HDL-C 没有显著差异，Apoe KO 纯合小鼠的LDL-C
显著高于对照组小鼠
【分析】基因工程的基本操作步骤是获取目的基因、将目的基因导入受体细胞、筛选还有目的基因的受体
细胞、目的基因的表达与检测。
【详解】（1）由题意，结合图示可知，如果要将一个外显子从特定序列中删除，由于基因是DNA 有两条
链，而1 条gRNA 只能与一条链结合，所以需要设计2 个gRNA 靶位点，敲出2 号和3 号两个外显子需要设
计4 个gRNA 靶位点。靶位点的设计时需要注意确保每一个gRNA 在小鼠的基因组中仅有一个目的靶点，即
每一个gRNA 序列只能与目的序列结合，避免将其他DNA 片段错误敲出。
（2）由题意可知，需要敲出2 号和3 号外显子序列，所以图中“某序列”是指2 号、3 号外显子上下游
（部分）序列，以便gRNA 序列识别2 号和3 号外显子，进行后续敲出上述外显子。常用显微注射法将目
的基因导入动物细胞。
（3）由题意可知，模型鼠为敲出Apoe 基因的小鼠，所以为确定实验鼠是否为模型小鼠，需要用PCR 技术
扩增并检测实验鼠的Apoe 基因，若不能扩增出Apoe 基因，则为模型小鼠。
（4）由图可知，Apoe 敲除纯合小鼠的总胆固醇水平高于对照组小鼠，HDL-C 没有显著差异，Apoe 敲出纯
合小鼠的LDL-C 显著高于对照组小鼠，说明Apoe 基因通过提高血浆中LDL-C 的含量来提高血浆中总胆固醇
水平。
15．（2024·江西上饶·三模）当外源 DNA 侵染细菌时，细菌体内CRISPR 转录为前体crRNA，在tracrRNA 和
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Cas9 蛋白的参与下加工成短的包括重复序列和间隔序列的成熟crRNA。成熟crRNA 通过碱基配对与
tracrRNA 结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链
DNA。Jinek 等构建了一种新型的CRISPR/Cas9 系统，用一个四碱基的连接环将crRNA 和 tracrRNA 连接在一
起，构成一个sgRNA。通过人工设计并合成这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA，从而引导
Cas9 对DNA 的定点切割。由CRISPR/Cas9 系统将双链断裂后通过非同源末端连接或同源重组进行修复，从
而达到基因编辑的目的，其机理如图所示。回答下列问题。
(1)根据题干信息及图示，总结sgRNA 的作用 。
(2)细菌细胞中的限制酶也能起到类似Cas9 内切酶的作用，使脱氧核苷酸之间的 断开。Cas 内切酶不
会切割细菌自身DNA，原因是 。
(3)图示A、B、C 三种核酸序列，被编辑的对象是 。
(4)CRISRP/Cas9 基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，实验发现RNA 的序列长短影响成功率，
越短脱靶率越高。试分析脱靶最可能的原因 。
【答案】(1)作为向导，部分碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA 序列结合
(2) 磷酸二酯键 细菌不含该酶的识别序列或被修饰
(3)B
(4)其他DNA 序列也含有与向导RNA 互补配对的序列，造成向导RNA 错误结合而脱靶
【分析】切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出
来的。限制酶能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式一黏性末端和平末端。
【详解】（1）根题干信息及图示分析可知，sgRNA 是用一个四碱基的连接环将crRNA 和 tracrRNA 连接在
一起，通过人工改造形成具有引导作用的sgRNA，能与靶基因的待编辑序列互补配对，从而引导Cas9 蛋白
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在特定的序列进行切割，故sgRNA 的作用有可以作为向导，含有能与靶基因碱基互补配对的部分序列，可
以与目的基因中希望被编辑的DNA 序列结合。
（2）限制酶(限制性酸内切核酸酶)能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定
部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，由题意可知，细菌细胞中的限制酶(限制性酸内
切核酸酶)也能起到类似Cas9 内切酶的作用，使脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。Cas9 内切酶不会切割
细菌自身DNA，原因在于细菌自身不含该酶的识别序列或识别序列已被修饰，所以Cas9 内切酶不会切割细
菌自身DNA。
（3）据题干信息和题图分析可知，A 是编辑工具，B 是被编辑的对象，C 的片段中含有要插入的DNA 片段，
D 和E 是编辑后的DNA 片段。故图示A、B、C 三种核酸序列，被编辑的对象是B。
（4）CRISRP/Cas9 基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶的现象，其原因可能是其他DNA 序列也
含有与向导RNA 互补配对的序列，造成向导RNA 错误结合而脱靶现象。
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