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微专题16 CRISPR/Cas9 基因编辑、融合基因与融合
蛋白、 单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR
检测
考情速览
热点
考情
CRISPR/Cas9 基因编辑
2024·新课标卷，35；2023·海南卷，20；2021·海南
卷，25
单酶切导致的正、反接
的电泳检测和PCR 检测
2024·黑吉辽卷，17、25；2024·全国甲卷，38；
2024·河北卷，24；2024·湖南卷，15；2024·江西
卷，12；2024·浙江6 月选考，19、20；2023·山东
卷，25；2022·福建卷，13
融合基因与融合蛋白
2023·浙江6 月选考，19；2023·辽宁卷，8；2023·江
苏卷，22；2023·天津卷，17
热点1 CRISPR/Cas9 基因编辑
【剖析真题】
(2021·海南卷，25)CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的
Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA 双
链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图
所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的
DNA 进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需
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要的酶是________。
(2) 过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是
_______________________________________________________________。
(3)过程③～⑤中，sgRNA 与Cas9 蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA 可识
别并与目标DNA 序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是________。随后，
Cas9 蛋白可切割____________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp 的基因，在DNA 水
平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________，基因敲除成功的判断依据
是_______________________________________________________________。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到
CRISPR/Cas9 质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编
辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程
菌。据图简述CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基
因组DNA 的编辑过程：________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________。
【梳理知识】
CRISPR/Cas9 是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA 或噬菌体的基因编辑
系统。CRISPR
是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA 序列。Cas9 蛋白是一种RNA 引导的
DNA 内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，它的某段DNA 序列被Cas 内切
核酸酶剪切后整合到CRISPR 的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细
菌时，转录的crRNA 可以引导Cas9 蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到
细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为
三个步骤：
(1)Cas 内切核酸酶(Cas 酶)切割噬菌体获取新的间隔序列。
(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA。
(3)crRNA 和Cas9 蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程
如图所示。
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命题要点提醒：
(1)质粒构建：在一个载体上包含目标DNA 片段的特定区域和Cas9 内切核酸酶
基因。
(2)基因编辑用途：定点基因编辑，构建一个质粒即可，基因(部分)切除，需要构
建两个质粒，两个质粒转录出的sgRNA 分别与基因的两侧碱基配对。
(3)脱靶问题：即对基因组非特异性切割。有效解决方法：适当增加sgRNA 的长
度，设计出特异性较强的sgRNA。
【巩固训练】
1.(经典高考)近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9 基因编辑技术可简单、
准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA 引导内切核酸酶Cas9
到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA 中20 个碱基的识别序列，
可人为选择DNA 上的目标位点进行切割(如图)。下列相关叙述错误的是( )
A.Cas9 蛋白由相应基因指导在核糖体中合成
B.向导RNA 中的双链区遵循碱基配对原则
C.向导RNA 可在逆转录酶催化下合成
D.若α 链剪切点附近序列为……TCCACAATC……则相应的识别序列为……
UCCACAAUC……
2.(2024·九省联考广西卷，21)PCR 可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或
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偏差等问题，而新研发的基于CRISPR/Cas12a 系统的检测方法，可在低浓度样
本中更灵敏、快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA 介导Cas12a 蛋白能准确切
割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标
DNA 含量，利用Cas12a 检测靶标DNA 的过程如图所示。回答：
(1)根据图中信息可推测Cas12a 作用于靶标DNA 时，具有类似________酶和
________酶的功能；gRNA 识别靶标DNA，遵循的是__________原则。
(2)在构建表达Cas12a 蛋白的载体时，通常是将Cas12a 基因插入到LacZ 基因内，
使LacZ 基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，AmpR为氨苄青霉素抗性
基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到
含有
Cas12a
基因表达载体的工程菌，判断的依据是
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________。
(3) 荧光检测时，60 分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是
_______________________________________________________________。
(4)
实
验
研
究
时
，
增
加
NTC
组
作
对
照
的
作
用
是
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________；
g －3 ＋g －7
组可更快检测出靶标
DNA ，原因是
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_____________________________
_______________________________________________________________。
热点2 融合基因与融合蛋白
【剖析真题】
(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶
技术构建质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有
________，扩增程序中最主要的不同是________。
(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R 应在下列选项中选用________。
EGFP 基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC－GACGAGCTGTACAAG3′
AnB1 基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG－CCAAAACCACAACCA3′
图2
A.ATGGTG——CAACCA
B.TGGTTG——CACCAT
C.GACGAG——CTGCAG
D.CTGCAG——CTCGTC
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，
直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要
有_______________________________________________________________。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有
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________。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300 个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)
为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物
F1－F 和F2－R 进行了PCR 扩增，质粒P1～P4 的扩增产物电泳结果如图3。根
据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，
原因是_______________________________________________________________
_______________________________________________________________。
【梳理知识】
1.融合基因与融合蛋白
(1)融合基因：是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和
终止子内部构成的嵌合基因。
启动子
基因1
基因2
基因3
终止子
(2)融合蛋白：是指融合基因的表达产物。
(3)启动子及其类型
启动子是一段具有特殊序列结构的DNA 片段，是RNA 聚合酶识别和结合的部
位，驱动基因转录出mRNA。主要包括以下三种类型：
①组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因
在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，
可连续不断地启动基因的表达。
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②组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，
且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器时所用的在乳腺中特异表达的
基因的启动子。
③诱导型启动子：即在某些特定的物理或化学信号刺激后，使目的基因的转录水
平有所提高。
2.获得融合基因的方法一——以重叠延伸PCR 技术为例
以融合基因M 和基因N 为例，步骤是：
(1)设计4 种引物：引物1 和引物4 为普通引物。引物2 的3′端含有基因M 的序列，
5′端含有基因N 的序列；引物3 的3′端含有基因N 的序列，5′端含有基因M 的序
列；引物2 和引物3 完全互补配对。
(2)PCR 扩增：利用引物1 和引物2 扩增基因M，2 轮循环可得到M′型DNA 分子；
利用引物3 和引物4 扩增基因N，2 轮循环可得到N′型DNA 分子。
(3)获得融合基因M＋N：将M′型DNA 分子和N′型DNA 分子放在同一个PCR 管
里，变性、复性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。
3.获得融合基因的方法二——无缝克隆技术
In－Fusion 技术，即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方
法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA 片段的插入。
具体原理是：在载体末端和目的基因两端应具有15～25 个同源碱基，而目的基
因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion 酶能够识别具有相同
末端序列的线性DNA 分子并使其形成黏性末端，DNA 连接酶再将两条DNA 单
链黏合起来。
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命题要点：
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR 扩增方法将载体线性化；②使用设计好
的引物进行目的DNA 片段的PCR 扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因
克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两
个或多个DNA 片段。
【巩固训练】
1.(2023·浙江6 月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因
(GFP)整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两
种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3－GFP 基因纯合子小鼠。
为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩
增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
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下列叙述正确的是( )
A.Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B.翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C.2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3－GFP 基因纯合子
D.若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
2.(2023·天津卷，17)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源
危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。
纤维素Ⅰ――→寡糖――→纤维二糖――→葡萄糖
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种
酶的基因，并使其表达产物在细胞________(填“内”或“外”)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA 区段通过配对、
链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的
特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB 短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB 之间，
在设计表达载体时，可采用PCR 技术在外源基因两端分别引入A 和B，获得乙
图所示长片段。PCR 时应选用的一对引物为________(从P1～P6 中选)。
(3)标记基因的选择 URA3 是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，
URA3 编码的蛋白可将外源5－氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1，需将酶Ⅰ基因同URA3 一起插入URA3 缺
陷型酿酒酵母基因组AB 之间，并利用________的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3 作为筛选标记，需切除菌株1 的
URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3 两端引入酿酒酵母基因组中不存在
的同源区段C 和C′，并以下图方式________排列才能通过同源重组达到上述目
的。
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此后，需要将菌株1 在________的培养基上培养，存活菌株即为URA3 被成功切
除的菌株1′。
(4)表达载体的构建 综上，将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建
表达载体时，A、B、C、C′、URA3 和酶基因应采用下图________的排布方式。
热点3 单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR 检测
【剖析真题】
(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨
酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。
研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S 的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产
菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株
E.coliB。下列叙述正确的是( )
A.图中表明，可以从酿酒酵母S 中分离得到目的基因gadB
B.E.coliB 发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coliA 和E.coliB 都能高效降解γ－氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
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【梳理知识】
1.利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体
2.单酶切法中正向连接与反向连接的检测
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(1)利用PCR 进行检测
方法：用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR 扩增，二者得
到的扩增产物长度不同。如图3 中，选用引物a、b 可扩增出1 100 bp 长度的产物
用引物a、c 无法扩增出产物，则为正向连接；如图4，选用引物a、b 无法扩增
出产物，用引物a、c 可扩增出1 000 bp 长度的产物，则为反向连接。
(2)利用电泳进行检测
方法：用特定的限制酶对正向连接和反向连接的重组质粒进行切割，对产物进行
电泳，二者得到的条带存在差异。如图中，用BglⅡ和Hind Ⅰ进行双酶切，电
泳后若出现1 100 bp 条带，则为正向连接；电泳后若出现1 000 bp 条带，则为反
向连接。
【巩固训练】
(2023·山东卷，25)科研人员构建了可表达J－V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检
测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，
质粒还需具备的结构有_________________________________(答出2 个结构即
可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行
PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J 基因转录的
模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的________(填“a 链”或“b
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链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相
应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内
表达了________，条带2 所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质
粒上的J 基因表达的。
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参考答案
热点1
【剖析真题】
(1)DNA 连接酶 (2)Ca2＋处理法 (3)碱基互补配对原则 目标DNA 特定的核苷
酸 (4)DNA 分子杂交技术 不出现杂交带 (5)CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细
胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9 蛋白，二者形
成复合体，该复合体中的sgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异性结合，在特定
位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中
解析 (1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA 连接酶，限制酶负责切割，
DNA 连接酶负责连接，因此，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定
sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质
粒上，插入时所需要的酶是DNA 连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，
将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2 ＋处理法。(3)根据题图可知，在
CRISPR/Cas9 基因编辑技术中，sgRNA 是根据靶基因设计的向导RNA，准确引
导Cas9 切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列。Cas9 能借助sgRNA 分子与目标
DNA 进行特异性结合的原因在于sgRNA 分子上的碱基序列与目标DNA 分子上
的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA 与目标DNA 特定序列的特定
识别，进而定位；由此可见，Cas9 在功能上属于限制酶，可切割目标DNA 特定
的核苷酸序列。(4)可利用DNA 分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若未出现
杂交带，则说明基因敲除成功。(5)根据图示可知，CRISPR/Cas9 重组质粒在受
体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9 蛋白，二
者形成复合体，该复合体中的sgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异性结合，在
特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中。
【巩固训练】
1.C [蛋白质由相应基因指导在核糖体中合成，A 正确；向导RNA 中双链间遵
循碱基互补配对原则，B 正确；向导RNA 可通过转录形成，以RNA 为模板合成
DNA 的过程中需要用到逆转录酶，C 错误；由于α 链与识别序列的互补序列互
补，故两链碱基相同，只是其中T 替换为U，D 正确。]
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2.(1)限制 解旋 碱基互补配对 (2)使用的培养基中不含无色底物，所以在含
氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落，无论Cas12a 基因是否
成功导入都不会出现显色反应 (3)Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物
质含量相同
(4)排除其他物质介导Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光 g－3 和g－7 在
介导Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用
解析 (1)根据图中信息可推测Cas12a 作用于靶标DNA 时，可以切割靶标
DNA，并能解开靶标DNA，使其与g－3 和g－7 结合，所以Cas12a 具有类似限
制酶和解旋酶的功能；gRNA 识别靶标DNA，遵循的是碱基互补配对原则。(2)
在构建表达Cas12a 蛋白的载体时，通常是将Cas12a 基因插入LacZ 基因内，使
LacZ 基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，而使用的培养基中不含无
色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落，无论
Cas12a 基因是否成功导入都不会出现显色反应。(3)荧光检测时，60 分钟后三组
荧光信号强度达到一致，原因是Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质
含量相同。(4)实验研究时，增加NTC 组作对照的作用是排除其他物质介导
Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光；g－3＋g－7 组可更快检测出靶标
DNA，原因是g－3 和g－7 在介导Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面
具有协同作用。
热点2
【剖析真题】
(1)模板、引物 复性温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA 连接
酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)电泳只能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准
的DNA 碱基数量，也不能呈现DNA 碱基序列
解析 (1)PCR 反应进行的条件：引物、酶、4 种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其
中需要Mg2＋)。分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中
不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。扩增程序中恰当地选择复性温度，尽
量避免引物与模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。(2)由图1 可
知，F2－F 与F1－R 互补，因此选项中A、B 一组，C、D 一组，再由图1 可知，
F2－F 与F1 片段(EGFP 基因序列3′端)部分相同，与F2 片段(AnB1 基因序列5′
端) 部分互补，即C 项“ GACGAG” 与EGFP 基因的“ 5′GACGAG3′” 同，
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“5′CTGCAG3′”与AnB1 基因序列的“5′CTGCAG3′”互补，F1－R 与F2 片段
(AnB1 基因序列5′端)部分相同，与F1 片段(EGFP 基因序列3′端)部分互补，即D
项符合。(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其
具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接
成重组质粒。题干将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下
可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA 连接酶。(4)用
稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，应选择有30～300 个菌落数的
平板，但筛选时不需控制数目，A 错误；培养基温度太高将接种的菌落杀死，会
导致抗性平板上未长出菌落，属于操作失误，不是一般原因，B 错误；转化后的
大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发
展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；稀释涂布平板法和平板划
线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无
需进一步划线纯化，D 正确。(5)EGFP 为720 bp，AnB1 为390 bp，二者的总大小
为720 bp＋390 bp＝1 110(bp)，用引物F1－F 和F2－R 进行了PCR 扩增，其大小
接近于P1、P2，根据图3 结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)电泳只能显
示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA 碱基数量，也不能呈现DNA 碱
基序列，因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因
测序确认。
【巩固训练】
1.B [由图甲可知，Gata3 基因与GFP 基因共用一个启动子，且由题干可知，两
基因能正常表达出相关蛋白质，A 错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录
基因时，先转录Gata3 基因，再转录GFP 基因，由于转录和翻译的方向均是沿
mRNA 的5′端→3′端，因此翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
由图乙可知，大片段包含GFP 基因编码区片段，小片段不包含GFP 基因编码区
片段，则2 号小鼠是Gata3－GFP 基因纯合子，4 号小鼠是野生型，C 错误；若
用引物1 和引物3 进行PCR，杂合子和Gata3－GFP 基因纯合子均能扩增出条带，
仅有Gata3 基因时无法扩增出条带，因此不利于区分杂合子和纯合子，D 错
误。]
2.(1)外 (2)P1 和P6 (3)①不含尿嘧啶 ②2 含有5－氟乳清酸和尿嘧啶 (4)4
解析 (1)据题意，酿酒酵母需利用纤维素作为生产乙醇的原料，但酿酒酵母菌
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株无法直接吸收利用纤维素等糖类，所以酶Ⅰ、酶Ⅱ和酶Ⅲ应为胞外酶，在细胞
外催化纤维素分解为葡萄糖后，再被酿酒酵母吸收利用，故应在细胞外发挥作用。
(2)同源重组需要在外源基因两端分别引入A 和B，可通过PCR 方法实现三个片
段的连接。引物对P3/P4 只能扩增外源基因，引物对中含P2 或P5 则不能有效扩
增。而引物P1(P6)同时包含A(B)和外源基因部分序列，可达到设计要求。故选
用的一对引物为P1 和P6。(3)①URA3 是尿嘧啶合成关键酶基因，可作为标记基
因，所以在筛选被转化的受体细胞时，需在培养基中去除尿嘧啶，无URA3(连
同目的基因)的酵母细胞将无法存活，因此可筛选出含有目的基因及URA3 的受
体细胞。②如题图所示，方式1 中URA3 两侧C、C′是反向同源序列，方式2 中
URA3 两侧C、C′是同向同源序列。在发生同源重组时，方式1 只是导致URA3
序列倒位，但不会切除URA3；而方式2 将导致URA3 以环状小分子形式被切除，
并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失。故选方式2。此后，菌株1′因不含
URA3，可在含有5－氟乳清酸和尿嘧啶的培养基上存活，而没有成功切除
URA3 的菌株，会将5－氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。(4)在明确了
表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同时满足两个条件：一是需要将
URA3 标记基因与目的基因(酶基因)一起插入酿酒酵母基因组AB 之间，所以
A、B 应置于标记基因与目的基因最外侧；二是需要利用C、C′片段切除URA3
标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、C′应紧邻URA3 两侧。同时满足上述
条件的只有图4。
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【剖析真题】
D [由题图可知，不能直接从酵母菌S 中分离得到目的基因gadB，只能分离得
到含有目的基因gadB 序列的染色体DNA，若要获得目的基因，需进行PCR，A
错误；由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B
错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA 构建高效生产γ－氨基丁酸的菌株
E.coliB，E.coliA 和E.coliB 均不能高效降解γ－氨基丁酸，C 错误；图中质粒显
示含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶识别序列，除此之外，也可用同尾
酶替代，D 正确。]
【巩固训练】
(1)RNA 聚合酶 复制原点、标记基因、限制酶切割位点 (2)F1 和R2 或者F2 和
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R1 a 链 (3)J－V5 融合蛋白 不是
解析 (1)与图甲中启动子结合的酶是RNA 聚合酶。图甲中有启动子和终止子等，
作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。
(2)据图甲可知，引物F2 与R1 或F1 与R2 结合部位包含J 基因的碱基序列，因此
推测为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用
一对引物，应选择图甲中的引物F2 和R1 或F1 和R2。b 是模板链，而根据图中
启动子和终止子的位置可知，转录方向是图中从左向右，对应的模板链方向应该
是3′→5′，非模板链(也就是a 链)是5′→3′；考虑到DNA 复制的方向是子链的
5′→3′，引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是
3′→5′；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b 链，故其序
列应该与a 链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，只有抗V5 抗体时，出现条
带1，抗V5 抗体能与V5 编码序列表达标签短肽V5 特异性结合，只有抗J 蛋白
抗体时，出现条带1 和条带2，且条带1 较宽，说明该物质能与抗J 蛋白抗体特
异性结合，因此出现条带1 证明细胞内表达了J－V5 融合蛋白，而条带2 可能是
杂质。
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