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大题05 基因工程
一、历年考情
1. 核心知识聚焦操作流程与分子机制：
基因工程基础技术：高频考点包括DNA 提取（蛋白酶与酒精作用）、PCR 扩增（引物设计、酶选
择）、载体构建（启动子功能、标记基因筛选）。2024 年通过双质粒农杆菌系统提高转化效率，2023 年利
用PCR 改造β-淀粉酶基因耐热性，均体现对技术细节的深入考查。
蛋白质工程与功能优化：2024 年通过密码子偏好性调整增强抗虫蛋白表达，2023 年通过氨基酸替换提
升酶热稳定性，强调基因修饰与蛋白质功能的关联。
-实验分析与数据解读：如2021 年通过电泳结果判断重组质粒，2023 年通过酶切验证基因表达载体，
考查学生实验设计与结果分析能力。
2. 命题趋势与能力要求：
技术整合与前沿应用：题目常结合农业（抗虫棉）、工业（耐热酶）等实际场景，如2024 年融合农杆
菌转化系统与抗虫基因表达，体现“科学实践”素养。
图表分析与逻辑推导：质粒图谱、电泳结果、基因序列对比等图表频繁出现，需学生快速提取关键信
息并关联理论知识。
跨学科融合：2021 年结合细胞周期分析PHB2 蛋白抑癌机制，2023 年引入逆转录获取模板DNA，体现
分子生物学与细胞学交叉。
3. 难度与分值分布：
非选择题分值稳定在10-16 分，实验分析类占比50%以上，2024 年首次出现多基因互作模型（两对隐
性基因叠加效应）。
难度系数集中在0.6-0.65，2021 年因涉及复杂基因定位实验（互补测验）难度稍低，但逻辑推理要求较
高。
二、2025 年考向预测
1. 技术深化与创新应用：
可能考查CRISPR/Cas9 基因编辑技术的具体操作（如sgRNA 设计、脱靶效应分析）或其在疾病治疗
1
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中的应用（如基因修复案例）。
或围绕合成生物学设计基因回路（如诱导型启动子调控多基因表达），需学生理解模块化基因元件的
作用与组合逻辑。
2. 复杂实验设计与伦理议题：
预测涉及基因共转化实验（如抗虫与抗病基因协同导入），要求综合限制酶切策略、标记基因筛选及
表型验证。
可能引入转基因生物安全性评估（如环境释放风险、食品安全性），结合开放性设问考查批判性思
维。
3. 生物信息学工具应用：
或要求利用密码子优化软件设计基因序列，或通过同源重组预测蛋白结构变化，体现“技术-功能-应
用”链条的完整分析。
三、备考建议
强化核心操作：重点突破PCR 引物设计、载体构建（启动子/终止子选择）、转化筛选（抗生素标
记、蓝白斑筛选）等关键步骤；
提升图表解析能力：熟练分析质粒图谱、电泳条带及基因序列比对，关联实验设计与结果推导；
关注前沿技术：熟悉基因编辑、合成生物学及生物信息学工具的原理与应用场景，注重学科交叉与实
际问题解决能力。
典例一：引物的选择
（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀粉
酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
2
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(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的
基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
一、（基础）PCR 中引物的设计要求
引物的作用
使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA 链，同时限定了制
区域
设计两种引物的原因
基因的两条链都作为模板,其碱基序列不同,且 DNA 聚合酶只能从
3'端延伸子链,用两种引物才能确保 DNA 的两条链同时被扩增
引物长度
用于PCR 的引物长度通常为20~30 个核苷酸。若引物过短,则引物
与模板链结合的特异性较差
其他要求
(1)每种引物内部不能发生过多的局部碱基互补配对,否则会导致自
身折叠;
(2)两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,否则会导致引物二
聚体产生
引物中设计限制酶的
酶切位点
为了便于扩增的DNA 片段与表达载体连接,可在引物的5'端加上限
制酶的酶切位点,且常在两种引物上设计不同的酶切位点,主要目的
是保证目的基因与载体的正向连接
二、（易错）必纠 PCR 中引物选择4 大问题
3
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1
引物只能与母链的3'端结合。引物只能引导子链从5'端→3'端延伸
2
为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的酶切
位点，且常在两种引物上设计不同的酶切位点，保证目的基因与载体的正向连接
3
引物应位于目的基因两侧,且能顺利扩增出目的基因
4
引物与扩增序列有如下的对应关系:
①引物1 与待扩增基因中部分序列(α 链)相同。在此情况下,引物结合的是B 链向着和α 链
相同的方向扩增,即“同向相同,同向扩增”。
②引物2 与待扩增基因中部分序列(α 链)反向互补。这种情况下,引物与α 链结合,并向着
和α 链相反的方向扩增,即“反向互补,反向扩增”
（24-25 高三下·辽宁·开学考试）牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的传染病，是全球最
重要的牛传染病之一。BVDV 中结构蛋白E0和E2是主要抗原，据此研究者利用基因工程技术研制有关疫
苗防控该病。图1 表示由E2和E0基因经处理后拼接而成的融合基因，图2 表示人工改造的基因表达载体
pcDNA3.1 质粒的结构，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，请回答以下问题：
EcoRⅠ
XhoⅠ
MboⅠ
5'-G↓AATTC-3'
5'-C↓TCGAG-3'
5'-GA↓TC-3'
HindⅢ
NotⅠ
5'-A↓AGCTT-3'
5'-GC↓GGCCGC-3'
(1)BVDV 是一种单链RNA 病毒，在构建融合基因前，需先提取病毒RNA 再通过 和PCR 技术获取
并扩增E0和E2基因。PCR 技术扩增融合基因的每次循环一般可以分为 三个步骤。
4
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(2)为保证疫苗防护效果，研究人员将E2基因和E0基因拼接以期表达出E2—E0 融合蛋白，此融合基因转录
的模板链是 （填“A 链”“B 链”或“A 链或B 链”）。已知E2 基因A 链的起始序列为5'-
CACTTGGA-3'，在保证融合基因准确扩增的同时使目的基因与pcDNA3.1 质粒正确拼接，F1引物的序列应
为 。
(3)在构建E2—E0融合基因之前，E2基因大小约1358bp，E0基因大小约516bp，但融合基因片段大小仅
1777bp，这是为了保证两个基因表达为一条肽链，在拼接基因时必须除去______。
A．E2基因中编码起始密码子的序列
B．E2基因中编码终止密码子的序列
C．E0基因中编码起始密码子的序列
D．E0基因中编码终止密码子的序列
(4)为保证融合基因表达产物具有正确结构，可制备牛乳腺生物反应发生器，使牛在分泌乳汁的同时生产融
合蛋白，为此常将重组质粒通过 法导入牛的受精卵中。启动子存在物种特异性和组织特异性，易被
本物种特定组织转录系统识别并启动转录，为使融合基因只在牛乳腺细胞中表达且便于重组DNA 分子的
筛选，应将pcDNA3.1 质粒中的 更换为 。
典例二：限制酶选择问题
（2021·辽宁·高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫颈癌
细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为0．
9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR 反
应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
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相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
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一、（技能）两个角度速解限制酶选择问题
角度1：依据目的基因相关的限制酶切割位点确定限制酶的种类
角度 2：基于基因表达载体结构的完整性,在选择限制酶时做到“一宜”“五不宜”
水稻是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全具有重要意义。近年来，科学
家们通过基因工程技术将蓝藻中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和产量。回答下列问题：
(1)扩增目的基因。研究人员需要根据 序列设计引物；在PCR 反应前，在微量离心管中加入原料、
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酶等成分后离心，其目的是 ；适当提高退火温度可以提高PCR 扩增的特异性，原因是 。
(2)构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA 片段如图1 所示，据图分析，用一种限制酶与
DNA 连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是 。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶
（填“E”或“B”或“H”或“X”）进行完全酶切并电泳，电泳时需要添加的缓冲液有 （A．磷酸缓冲
液 B．Tri-硼酸缓冲液 C．上样缓冲液 D．扩增缓冲液），电泳结果如图2 所示：图2 中出现结果Ⅰ的原
因是 ，出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是 。最后，根据电泳结果，筛选出正确的重组质粒。
(3)导入目的基因。将高效光合基因导入水稻细胞后，培养时在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）的
目的是______。
A．促进受体细胞分裂 B．筛选符合要求的水稻细胞
C．抑制未导入质粒的细胞的生长 D．诱导高效光合相关基因表达
(4)检测目的基因的表达。研究团队将蓝藻的高效光合相关基因成功转入水稻细胞，但培养获得的转基因植
株中，约30%个体的光合速率未显著提升，可能的原因有 （写出2 点）。
1．（2024·广西·高考真题）β-地中海贫血是人11 号染色体上β-珠蛋白基因HBB 突变所造成的遗传病。如
图为HBB 几种常见的基因突变位点及功能区域示意图。回答下列问题：
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注：-28A→C 中，“-”表示转录起始位点前，数值表示碱基位点，A→C 表示碱基A 突变为C；仅标示了非
模板链上的变化，模板链也发生对应变化，但没有标示出来。
(1)654C→T 突变， （选填“会”或“不会”）增加该基因嘌呤碱基总数量。-28A→C 突变，会导致
β-珠蛋白的表达异常，其原因是 。
(2)HBB 在转录形成mRNA 的过程中，细胞核内特定RNA 复合物能特异性识别初级转录产物（mRNA 前
体），并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，这表明上述RNA 复合物是一种 。
(3)含有17A→T 突变的HBB 转录出的mRNA，对应位点的碱基是 。
(4)某男性一条染色体上的HBB 存在突变位点W，其配偶无W 突变，他们生育的孩子 （选填“一
定”或“不一定”）存在该突变，从遗传概率角度分析，其原因是 。为有效降低人群中β-地中海贫
血的发病率，可以采取 和 等措施。
2．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多
重抗药性Sa。
(1)Sa 产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2 点）。
(2)推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测，以图1 中R 基因的上、下游片段和质粒1
构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2 中的上、下游片段分别与Sa 基因组中R 基因上、下游片段配对，
并发生交换）敲除Sa 的R 基因。
①根据图1 信息，简述质粒2 的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，
再与SacII 酶切质粒1 所得大片段连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培
养获得含质粒2 的Sa 单菌落。
③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛
选并获得不再含有质粒2 的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，
若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因疑似被敲除。
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④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图2，表明R 基因已
被敲除的是 。
3．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体
内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原
因是 。
4．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究
人员发现，基因S 在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因
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（两品种中基因S 序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S 启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN 克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S 的优质大豆品种YZ。根据题19
图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ 所得再生植株YZ-1 的种子变大。同时将从TL 克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2 的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN 较TL 种
子大的原因是 。
5．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研
究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体
融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完
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整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动
子pL 和下游的终止子结构如图a。图b 是一种Ti 质粒的结构示意图，其中基因gus 编码GUS 酶，GUS 酶
活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L 的启动子pL 活性的影响。从图a 所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其
与相同限制酶酶切的Ti 质粒连接，再导入烟草。随机选取3 组转基因成功的烟草（P1、P2 和P3）进行病
原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL 的活性增强，其中 的诱导作
用最强。
②现发现栽培种百合B 中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L
的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。
6．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L 能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程
技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI 切点处插入大豆基因L 的向导DNA 序
列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体
信息、目标基因L 部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目标基因L 时，所用的引物越短，引物特异性越 （填
“高”或“低”）。限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI 酶切大豆基
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因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI 酶切后，载体上保
留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴
定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，部分序列信息及可选
用的酶切位点如图乙所示，PCR 产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是
，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1 株基因L 成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1 条染
色体有T-DNA 插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占
比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1．（2025 届辽宁省抚顺市高三下学期3 月模拟考试）重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是一种新型恒温核
酸扩增技术，它利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶，在39℃条件下实现对核酸的快速扩增。其具
体过程如下图所示，请回答下列相关问题：
(1)新型核酸扩增技术——RPA 是在PCR 技术的基础上发展而来的，它极大的简化了实验流程。据上图可
知，RPA 的原理是 。除快速之外，RPA 还具有的其它优势是 （答出1 点即可）。
(2)在RPA 反应中，首先 与重组酶结合，在重组酶作用下识别并与模板DNA 结合。在子链延伸的过
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程中，被置换出的 （模板链/非模板链）与单链结合蛋白暂时结合。
(3)某实验兴趣小组在进行RPA 实验前设计了两对引物，如下表所示。应选择 （引物对1/引物对2）
更适合，原因一是 ；原因二是引物越短，其特异性越 （高/低）。
引物对1
5’-GACCACTCTGAA-3’
5’-TTCAGAGTGGTC-3’
引物对2
5’-CGTTAGATCTTTTACAACTGCATAATG-3’
5’-GATATTGAGAATTCGCCAAAGGCTACC-3’
(4)冬季患流感的人数增多， （能/不能）直接利用RPA 扩增流感病毒的核酸，其理由是 。
2．（辽宁省名校联盟2025 届高三下学期一模考试）科研团队通过转基因获得的大肠杆菌工程菌，成为监
测残留在生物组织或环境中四环素水平的“报警器”，其监测原理如图1 所示。天然大肠杆菌不具备图1
中所示基因和四环素抗性基因。有关限制酶的识别序列及切割位点如图2 所示。
(1)根据图1、图2 的信息，至少需要使用 种酶才能将DNA 片段1、片段2 正确拼接成一段完整的
DNA 分子，其中在拼接处的碱基序列为 （填写编号）。
(2)图3 是构建基因表达载体时所选用的质粒，请在图4 中绘制出构建成功的重组质粒示意图，并标明基因
。
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图4 的重组质粒分别表达TetR 蛋白、GFP 蛋白时，所使用的模板链位于 （同一条\不同）DNA 单
链，判断依据是 。
(3)筛选充当“报警器”的大肠杆菌工程菌时，应将大肠杆菌培养在含有适宜浓度的四环素培养基上，当菌
落出现 现象时，表明重组质粒成功导入大肠杆菌。能在该培养基上形成菌落的大肠杆菌
（一定\不一定）含有重组质粒。
(4)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP 的第65 位丝氨酸突变成苏氨酸后，增加了
绿色荧光稳定性和强度。该项技术属于 （基因工程\蛋白质工程）。
3．（2025 届吉林市高三第三次模拟考试）大刍草是玉米的原始祖先，具有较强的抗病抗逆特性，为玉米
育种提供了原始的遗传材料。研究发现大刍草基因组中有一个D 基因仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，
在卵细胞中不转录。为研究D 基因表达对卵细胞的影响，科研工作者设计了如图实验。据图回答：
(1)D 基因在大刍草卵细胞中不转录，可能卵细胞中D 基因的 （结构）出现问题，从而无法启动转录
过程。
(2)按如图所示，将重组的基因表达载体导入农杆菌前，先用 处理农杆菌细胞，使其处于一种
的生理状态。
(3)让农杆菌侵染大刍草愈伤组织，在愈伤组织培养基中需添加 和 ，以便筛选导入融合基因
的植物细胞。
(4)为确定大刍草基因组中B 基因与育性相关，研究者用转基因技术进行一系列实验，将一段T—DNA 插入
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到B 基因中，致使该基因失活，记为b，再进行杂交。为方便确定实验中的子代植株的基因型，研究者据
B 基因、T—DNA 的序列设计了3 种引物，如图所示：
具体操作时，提取待测植株的总DNA，分别用“引物Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否能扩
增（完整的T—DNA 过大，不能完成PCR 扩增）。推测结果：如果引物“Ⅰ+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行
PCR 均可完成扩增，则植株的基因型为 ；如果 ，则植株的基因型为BB；如果
，则植株的基因型为bb。
4．（2025 届吉林省延边朝鲜族自治州高三一模）药物A 是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对
治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。回答下
列问题。
(1)科学家根据药物A 的氨基酸序列人工合成DNA 片段，由于 ，该方法得到的DNA 片段有多种可能，
也可以用PCR 技术从植物细胞中扩增出药物A 基因，该技术的原理为 。
(2)下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点（限制酶的识别序列和
切割位点如表所示），其中lacZ 基因表达的产物可将无色物质X-gal 催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝
色。回答下列问题。
注：kb 代表碱基对，Kanr基因为卡那霉素抗性基因
限制酶
BamHⅠ
EcoRⅠ
Sau3AⅠ
SmaⅠ
XmaⅠ
识别序列和切割位点
-G↓GATCC-
-G↓AATTC-
-↓GATC-
-CCC↓GGG-
-C↓CCGGG-
①利用PCR 技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如下，扩增时选用的两种引物
碱基序列为（注明序列的5′和3′端） 、 。
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②分析上图，为将目的基因准确插入质粒中，最好选用 酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和
质粒需使用 （填“T4”、“E.coli”或“T4或E.coli”）DNA 连接酶处理，才能得到重组质粒。
③将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要将其培养在添加了 的培养
基上。
④若将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为 bp 的条带。对于琼
脂糖凝胶电泳结果符合预期的PCR 产物条带，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
5．（2025 届黑龙江省齐齐哈尔市高三下学期二模）番茄不耐寒，低温易冻伤，难以储藏。我国科研人员
从某种耐寒植物中提取了抗冻基因AtCOR15a，经过转基因技术获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程
如图。回答下列问题：
(1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有 （填序号）。
①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短
④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁
(2)获得图中①的过程称为 ，该过程使用的限制酶是 原因是：
。
(3)将①与用 处理的农杆菌混合，从而将目的基因导入农杆菌，最终整合到宿主胞的
上，该方法称为 。
(4)如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，过程称为反向
PCR，具体流程如下图（以EcoRI 酶切为例）
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若下表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，选用的PCR 引物序列必须是 引物①②③④
中选择，填编号）。
DNA 序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
5'-AACTATGCGCTCATGA-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
3'-TTGATACGCGAGTACT-CGITACGCAICGGAGA-5'
PCR 引物
5' -AACTATGCGCTCATGA-3'
①
5' -GCAATGCGTAGCCTCT-3'
②
5' -AGAGGCTACGCATTGC-3'
③
5' -TCATGAGCGCATAGTT-3'
④
(5)为了提高AtCOR15a 基因在受体细胞的表达水平，可将AtCOR15a 基因与外源强启动子连如下图所示。
利用PCR 检测上述连接是否成功，可选择的引物组合是 （填序号组合）。（注：图中①、②、
③、④表示引物）
6．（黑龙江省哈尔滨市第九中学2024—2025 学年高三下学期第二次模拟）苹果生长过程中易受真菌感染，
科研人员将在其他植物中的BG2 基因（2071bp）转入苹果中，该基因控制合成的β-1，3 葡聚糖酶可降解
许多病原真菌的细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。请回答下列问题：
(1)图1 为构建含BG2 基因重组质粒的过程。研究人员用XbaⅠ和NotⅠ切割质粒和目的基因后，二者可连接
在一起构成重组质粒，原因是 ，图中增强子是一段能使基因转录频率明显增加的DNA 序列，
其参与构成的复合启动子的作用是：①RNA 聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA；②
。
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(2)也可利用无缝克隆（In-Fusion）技术构建含BG2 基因的重组质粒流程图，其中In-Fusion 酶可以将任何
具有相同15~20bp 末端序列的线性DNA 分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。
①图中过程①是利用PCR 技术将质粒线性化。引物F 和R 序列要依据 的末端序列设计。引物的作
用是 。
②利用该无缝克隆技术筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠
杆菌，菌液涂布到含 的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入引物、四种脱氧核苷酸、
缓冲液、 酶等进行菌落PCR，图3 是对质粒转化菌落进行PCR 验证时的产物电泳结果，泳道
4、5、7 对应的菌株可能转化成功，判断的理由是 。
③与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 技术无需 酶。
(3)GUS 基因为常用的报告基因，只能在导入真核细胞后正确表达，而在农杆菌中不能正确表达。转GUS
基因的植物组织浸泡在含有某底物的营养液中，GUS 能与底物发生反应使营养液呈现蓝色。将构建好的
BG2 重组质粒（含有GUS 基因）与农杆菌共培养，然后将菌液接种至含抗生素的培养基上可筛选出含有
BG2 重组质粒的农杆菌：再将其与苹果外植体共培养进行转化，通过 （写出筛选
过程），从而获得成功转化的受体细胞。
7．（2025 届内蒙古阿拉善盟（呼和浩特市、鄂尔多斯市）高三下学期一模）双乙酰是啤酒中的主要风味
物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2 基因编码双乙
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酰合成中的关键酶，GSH1 基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人
员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUPI 基因的表达产物可使细胞对一定浓度的
硫酸铜产生抗性。请分析回答：
SalⅠ
5'-G↓TCGAC-3'
Kpn Ⅰ
5'-G↓GTACC-3'
Sph Ⅰ
5' -GCATG↓C -3
Xba Ⅰ
5'-T↓CTAGA-3''
Bgl Ⅱ
5'-A↓GATCT-3'
Pst Ⅰ
5'-CTCC↓AG-3'
(1)分析图1 可知，需用 （填限制酶名称）切割质粒1 以获取CUPI 基因。
(2)转化后的啤酒酵母应置于含 的培养基中进行初步筛选。
(3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的 为模板，用图示两种引物进行PCR 扩增。若扩增
产物的大小约为1300bp，则说明 基因已整合到啤酒酵母的染色体上。
(4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图2。
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据图2 分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力 。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显
未转化的受体菌，原因是 。
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