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大题05 基因工程
一、历年考情
1. 核心知识聚焦操作流程与分子机制：
基因工程基础技术：高频考点包括DNA 提取（蛋白酶与酒精作用）、PCR 扩增（引物设计、酶选
择）、载体构建（启动子功能、标记基因筛选）。2024 年通过双质粒农杆菌系统提高转化效率，2023 年利
用PCR 改造β-淀粉酶基因耐热性，均体现对技术细节的深入考查。
蛋白质工程与功能优化：2024 年通过密码子偏好性调整增强抗虫蛋白表达，2023 年通过氨基酸替换提
升酶热稳定性，强调基因修饰与蛋白质功能的关联。
-实验分析与数据解读：如2021 年通过电泳结果判断重组质粒，2023 年通过酶切验证基因表达载体，
考查学生实验设计与结果分析能力。
2. 命题趋势与能力要求：
技术整合与前沿应用：题目常结合农业（抗虫棉）、工业（耐热酶）等实际场景，如2024 年融合农杆
菌转化系统与抗虫基因表达，体现“科学实践”素养。
图表分析与逻辑推导：质粒图谱、电泳结果、基因序列对比等图表频繁出现，需学生快速提取关键信
息并关联理论知识。
跨学科融合：2021 年结合细胞周期分析PHB2 蛋白抑癌机制，2023 年引入逆转录获取模板DNA，体现
分子生物学与细胞学交叉。
3. 难度与分值分布：
非选择题分值稳定在10-16 分，实验分析类占比50%以上，2024 年首次出现多基因互作模型（两对隐
性基因叠加效应）。
难度系数集中在0.6-0.65，2021 年因涉及复杂基因定位实验（互补测验）难度稍低，但逻辑推理要求较
高。
二、2025 年考向预测
1. 技术深化与创新应用：
可能考查CRISPR/Cas9 基因编辑技术的具体操作（如sgRNA 设计、脱靶效应分析）或其在疾病治疗
1
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中的应用（如基因修复案例）。
或围绕合成生物学设计基因回路（如诱导型启动子调控多基因表达），需学生理解模块化基因元件的
作用与组合逻辑。
2. 复杂实验设计与伦理议题：
预测涉及基因共转化实验（如抗虫与抗病基因协同导入），要求综合限制酶切策略、标记基因筛选及
表型验证。
可能引入转基因生物安全性评估（如环境释放风险、食品安全性），结合开放性设问考查批判性思
维。
3. 生物信息学工具应用：
或要求利用密码子优化软件设计基因序列，或通过同源重组预测蛋白结构变化，体现“技术-功能-应
用”链条的完整分析。
三、备考建议
强化核心操作：重点突破PCR 引物设计、载体构建（启动子/终止子选择）、转化筛选（抗生素标
记、蓝白斑筛选）等关键步骤；
提升图表解析能力：熟练分析质粒图谱、电泳条带及基因序列比对，关联实验设计与结果推导；
关注前沿技术：熟悉基因编辑、合成生物学及生物信息学工具的原理与应用场景，注重学科交叉与实
际问题解决能力。
典例一：引物的选择
（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀粉
酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
2
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(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的
基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5)筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
3
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【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA
片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ
酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA 为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
一、（基础）PCR 中引物的设计要求
引物的作用
使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA 链，同时限定了制
区域
设计两种引物的原因
基因的两条链都作为模板,其碱基序列不同,且 DNA 聚合酶只能从
3'端延伸子链,用两种引物才能确保 DNA 的两条链同时被扩增
引物长度
用于PCR 的引物长度通常为20~30 个核苷酸。若引物过短,则引物
与模板链结合的特异性较差
其他要求
(1)每种引物内部不能发生过多的局部碱基互补配对,否则会导致自
身折叠;
(2)两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,否则会导致引物二
聚体产生
引物中设计限制酶的
酶切位点
为了便于扩增的DNA 片段与表达载体连接,可在引物的5'端加上限
制酶的酶切位点,且常在两种引物上设计不同的酶切位点,主要目的
是保证目的基因与载体的正向连接
二、（易错）必纠 PCR 中引物选择4 大问题
1
引物只能与母链的3'端结合。引物只能引导子链从5'端→3'端延伸
2
为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的酶切
位点，且常在两种引物上设计不同的酶切位点，保证目的基因与载体的正向连接
3
引物应位于目的基因两侧,且能顺利扩增出目的基因
4
引物与扩增序列有如下的对应关系:
4
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①引物1 与待扩增基因中部分序列(α 链)相同。在此情况下,引物结合的是B 链向着和α 链
相同的方向扩增,即“同向相同,同向扩增”。
②引物2 与待扩增基因中部分序列(α 链)反向互补。这种情况下,引物与α 链结合,并向着
和α 链相反的方向扩增,即“反向互补,反向扩增”
（24-25 高三下·辽宁·开学考试）牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的传染病，是全球最
重要的牛传染病之一。BVDV 中结构蛋白E0和E2是主要抗原，据此研究者利用基因工程技术研制有关疫
苗防控该病。图1 表示由E2和E0基因经处理后拼接而成的融合基因，图2 表示人工改造的基因表达载体
pcDNA3.1 质粒的结构，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，请回答以下问题：
EcoRⅠ
XhoⅠ
MboⅠ
5'-G↓AATTC-3'
5'-C↓TCGAG-3'
5'-GA↓TC-3'
HindⅢ
NotⅠ
5'-A↓AGCTT-3'
5'-GC↓GGCCGC-3'
(1)BVDV 是一种单链RNA 病毒，在构建融合基因前，需先提取病毒RNA 再通过 和PCR 技术获取
并扩增E0和E2基因。PCR 技术扩增融合基因的每次循环一般可以分为 三个步骤。
(2)为保证疫苗防护效果，研究人员将E2基因和E0基因拼接以期表达出E2—E0 融合蛋白，此融合基因转录
的模板链是 （填“A 链”“B 链”或“A 链或B 链”）。已知E2 基因A 链的起始序列为5'-
CACTTGGA-3'，在保证融合基因准确扩增的同时使目的基因与pcDNA3.1 质粒正确拼接，F1引物的序列应
为 。
(3)在构建E2—E0融合基因之前，E2基因大小约1358bp，E0基因大小约516bp，但融合基因片段大小仅
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1777bp，这是为了保证两个基因表达为一条肽链，在拼接基因时必须除去______。
A．E2基因中编码起始密码子的序列
B．E2基因中编码终止密码子的序列
C．E0基因中编码起始密码子的序列
D．E0基因中编码终止密码子的序列
(4)为保证融合基因表达产物具有正确结构，可制备牛乳腺生物反应发生器，使牛在分泌乳汁的同时生产融
合蛋白，为此常将重组质粒通过 法导入牛的受精卵中。启动子存在物种特异性和组织特异性，易被
本物种特定组织转录系统识别并启动转录，为使融合基因只在牛乳腺细胞中表达且便于重组DNA 分子的
筛选，应将pcDNA3.1 质粒中的 更换为 。
【答案】(1) 逆转录或反转录 变性、复性、延伸
(2) B 链 5'-AAGCTTCACTTGGA-3'
(3)B
(4) 显微注射 启动子1 和启动子2 牛乳腺中特异表达的基因的启动子
【分析】构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，该过程中首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一
个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA 片段；再利用DNA 连接酶将
目的基因片段拼接到载体的切口处。
【详解】（1）由于BVDV 病毒的遗传物质为RNA，因此需要先逆转录为DNA 后再进行PCR 扩增。PCR
的每次循环一般可以分为变性、复性、延伸这三个步骤。
（2）由图1 可知，融合基因的转录方向为从左到右，在转录时RNA 聚合酶沿模板链的3'→5'方向移动，
磷酸端为5’端，由此判定B 链为融合基因的模板链。根据融合基因及质粒上的酶切位点可知，限制酶
EcoRⅠ会破坏目的基因，限制酶MboⅠ在质粒中有两个酶切位点，会切去质粒的终止子，因而不可选用。为
保证目的基因与pcDNA3.1 质粒正确拼接，应选用限制酶HindⅢ和XhoⅠ同时切割质粒和目的基因。由于
目的基因上游没有HindⅢ识别序列，应在引物F1 的5'端增加序列5'-AAGCTT-3'。引物F1 序列与B 链3'端
互补，即与A 链5'端序列相同，因此引物F1 的完整序列是5'-AAGCTTCACTTGGA-3'。
（3）为保证两个基因表达为一条肽链，必须除去E2 基因中编码终止密码子的序列，否则会合成两条肽链，
即B 正确。
故选B。
（4）将目的基因导入动物受精卵最常用的方法是显微注射法，也是教材介绍的唯一一种将目的基因导入
动物细胞的方法，因此将重组质粒导入牛的受精卵也沿用此法。题意显示，启动子存在物种特异性和组织
特异性，为使融合基因只在牛乳腺细胞中表达且便于重组DNA 分子的筛选，启动子1 和启动子2 均应更换
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为牛乳腺中特异表达的基因的启动子。
典例二：限制酶选择问题
（2021·辽宁·高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫颈癌
细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为0．
9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR 反
应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
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号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】(1)逆转录
(2) EcoRI PvitⅡ T4DNA 连接酶
(3)感受态
(4)3
(5)G2/M
【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI 在质粒上有
两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4 中G1期和S 期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
【详解】（1）利用RNA 获得cDNA 的过程称为逆转录。
（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间
存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI 在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI 和PvitⅡ两种不
同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA
连接酶连接质粒和目的基因。
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（3）转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
（4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基
因和质粒，如果用EcoRI 和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于
phb2 基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
（5）比较图4 中G1期和S 期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S 期细胞可以进入G2
期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2 蛋白应该作用于G2/M 期。
一、（技能）两个角度速解限制酶选择问题
角度1：依据目的基因相关的限制酶切割位点确定限制酶的种类
角度 2：基于基因表达载体结构的完整性,在选择限制酶时做到“一宜”“五不宜”
水稻是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全具有重要意义。近年来，科学
家们通过基因工程技术将蓝藻中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和产量。回答下列问题：
(1)扩增目的基因。研究人员需要根据 序列设计引物；在PCR 反应前，在微量离心管中加入原料、
酶等成分后离心，其目的是 ；适当提高退火温度可以提高PCR 扩增的特异性，原因是 。
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(2)构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA 片段如图1 所示，据图分析，用一种限制酶与
DNA 连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是 。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶
（填“E”或“B”或“H”或“X”）进行完全酶切并电泳，电泳时需要添加的缓冲液有 （A．磷酸缓冲
液 B．Tri-硼酸缓冲液 C．上样缓冲液 D．扩增缓冲液），电泳结果如图2 所示：图2 中出现结果Ⅰ的原
因是 ，出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是 。最后，根据电泳结果，筛选出正确的重组质粒。
(3)导入目的基因。将高效光合基因导入水稻细胞后，培养时在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）的
目的是______。
A．促进受体细胞分裂 B．筛选符合要求的水稻细胞
C．抑制未导入质粒的细胞的生长 D．诱导高效光合相关基因表达
(4)检测目的基因的表达。研究团队将蓝藻的高效光合相关基因成功转入水稻细胞，但培养获得的转基因植
株中，约30%个体的光合速率未显著提升，可能的原因有 （写出2 点）。
【答案】(1) 目的基因(两端) 使反应液集中于微量离心管底部 退火温度越高，引物与模板链
的结合越精准，非特异性扩增减少
(2) B E BC 有质粒未接入目的基因 目的基因接入质粒时，有正接与反接两种情况
(3)C
(4)导入的基因未正常转录/导入的基因转录后未正常翻译/导入的基因发生了突变/导入的基因不能正常表达
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。启动子：启动转录，终止子：终止转录。
【详解】（1）研究人员需要根据目的基因(两端)的核苷酸序列设计引物，因为引物要与目的基因特定区域
互补配对，引导DNA 聚合酶延伸合成新的DNA 链。在PCR 反应前，在微量离心管中加入原料、酶等成分
后离心，其目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。如果反应液不集中，可能会导致反应不均
匀，影响PCR 扩增效果。适当提高退火温度可以提高PCR 扩增的特异性，原因是较高的退火温度使引物
与模板结合的特异性增强，减少引物与非目的基因序列的错配结合。
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（2）构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA 片段如图1 所示，据图分析，用一种限制酶与
DNA 连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是B，因为在目的基因的两端有限制酶B 的识别序列，质粒
也有酶B 的识别序列，完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶E 进行完全酶切并电泳，因为重组质
粒目的基因前，启动子后有酶E 的识别位点，并且标记基因上有酶E 的识别位点，电泳时需要添加的缓冲
液有，B、Tri - 硼酸缓冲液一般用于特定的电泳如等电聚焦电泳等；C 上样缓冲液主要起增加样品密度、
使样品沉入加样孔以及含有指示剂便于观察等作用，使电泳结果更准确；而A、磷酸缓冲液常用于维持电
泳体系的pH 稳定，该体系未涉及酸碱，不需要使用，D 扩增缓冲液是用于PCR 扩增反应的，与电泳无关，
故选BC。
图2 中出现结果Ⅰ的原因是有质粒未接入目的基因，电泳只出现未切割的质粒条带。因为没有导入质粒，
就只有原本存在于细胞中的未切割质粒，在电泳中呈现一条条带。 出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是目的基因接
入质粒时，有正接与反接两种情况，导致出现大小不同的条带。
（3）ABCD、将高效光合基因导入水稻细胞后，培养时在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）的目的
是筛选符合要求的水稻细胞。因为只有导入了含潮霉素抗性基因（一般在表达载体上）的重组质粒的水稻
细胞，抑制未导入质粒的细胞的生长，从而筛选出含有目的基因的细胞，C 正确，ABD 错误。
故选C。
（4）导入的基因未正常转录/导入的基因转录后未正常翻译/导入的基因发生了突变/导入的基因不能正常表
达，可能会导致培养获得的转基因植株中，约30%个体的光合速率未显著提升。
1．（2024·广西·高考真题）β-地中海贫血是人11 号染色体上β-珠蛋白基因HBB 突变所造成的遗传病。如
图为HBB 几种常见的基因突变位点及功能区域示意图。回答下列问题：
注：-28A→C 中，“-”表示转录起始位点前，数值表示碱基位点，A→C 表示碱基A 突变为C；仅标示了非
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模板链上的变化，模板链也发生对应变化，但没有标示出来。
(1)654C→T 突变， （选填“会”或“不会”）增加该基因嘌呤碱基总数量。-28A→C 突变，会导致
β-珠蛋白的表达异常，其原因是 。
(2)HBB 在转录形成mRNA 的过程中，细胞核内特定RNA 复合物能特异性识别初级转录产物（mRNA 前
体），并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，这表明上述RNA 复合物是一种 。
(3)含有17A→T 突变的HBB 转录出的mRNA，对应位点的碱基是 。
(4)某男性一条染色体上的HBB 存在突变位点W，其配偶无W 突变，他们生育的孩子 （选填“一
定”或“不一定”）存在该突变，从遗传概率角度分析，其原因是 。为有效降低人群中β-地中海贫
血的发病率，可以采取 和 等措施。
【答案】(1) 不会 启动子区域发生碱基替换，使RNA 聚合酶无法识别和结合，从而影响转录和
翻译水平，使B-珠蛋白合成异常。
(2)酶（特异性酶）
(3)U（尿嘧啶）
(4) 不一定 孩子有50%概率不含该突变 遗传咨询 产前检测
【分析】1、DNA 分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变。
基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代。若发生在体细胞中，一般不能遗传。但有些植物
的体细胞发生了基因突变，可以通过无性生殖遗传。
2、通过遗传咨询和产前诊断等手段，对遗传病进行检测和预防，在一定程度上能够有效地预防遗传病的
产生和发展。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合
酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）依题意，654C→T 突变是指非模板链上的第654 位碱基C 突变为T，模板链也发生对应的
654G→A 变化，故654C→T 突变不会增加该基因呤碱基总数量。据图可知，基因的第28 位碱基位于基因
的启动子上，-28A→C 突变，启动子区域发生碱基替换，使RNA 聚合酶无法识别和结合，从而影响转录
和翻译水平，使B-珠蛋白合成异常。
（2）依题意，RNA 复合物能特异性识别mRNA 前体，并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，
则该复合物使RNA 的化学键发生了断裂和形成，故上述RNA 复合物应是一种酶（特异性酶）。
（3）依题意，17A→T 表示基因非模板链上的变化，基因非模板链的碱基排序与对应的mRNA 碱基排序相
同，故含有17A→T 突变的HBB 转录出的mRNA，对应位点的碱基变化是由17A→U，即对应位点的碱基
是U。
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（4）β-地中海贫血是人11 号染色体上β-珠蛋白基因HBB 突变所造成的遗传病，即β-地中海贫血为常染色
体上基因控制的遗传病。该男性一条染色体上的HBB 存在突变位点W，另一条染色体上基因是正常的，
且其配偶无W 突变，故其子代有50%概率不含该突变，他们生育的孩子不一定存在该突变。通过遗传咨询
和产前诊断等手段，对遗传病进行检测和预防，在一定程度上能够有效地预防遗传病的产生和发展。故为
有效降低人群中β-地中海贫血的发病率，可以采取遗传咨询和产前检测等措施。
2．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多
重抗药性Sa。
(1)Sa 产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2 点）。
(2)推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测，以图1 中R 基因的上、下游片段和质粒1
构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2 中的上、下游片段分别与Sa 基因组中R 基因上、下游片段配对，
并发生交换）敲除Sa 的R 基因。
①根据图1 信息，简述质粒2 的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，
再与SacII 酶切质粒1 所得大片段连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培
养获得含质粒2 的Sa 单菌落。
③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛
选并获得不再含有质粒2 的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，
若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因疑似被敲除。
④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图2，表明R 基因已
被敲除的是 。
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【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等
(2) 采用引物1 和4 进行PCR 扩增（或采用引物1 和3 以及引物2 和4 分别进行PCR 扩增），用SacⅡ
和EcoRⅠ对PCR 产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素
D
【详解】（1）Sa 为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。
（2）①由图1 可知，质粒2 上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1 上只有SacⅡ酶切位
点，R 基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1 和
4 进行PCR 扩增可得到整个R 基因，以及上下游片段（或采用引物1 和3 以及引物2 和4 分别进行PCR 扩
增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR 产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII 酶切质粒1 所得大片段
连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2 上含有氯霉素抗性
基因，所以可以将重组后的含质粒2 的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下
来的菌落就是，含质粒2 的Sa 单菌落。
③推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测需要敲除R 基因，因为质粒2 上含有Y 可被
脱水四环素又到表达的Sa 致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的几率，
随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R 基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因疑
似被敲除。
④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图2，表明R 基因已
被敲除的是D 组，由图1 可知，R 基因两侧含有的引物为2 和3，所以扩增后含有引物2 或3，或者2 和3
的可能含有R 基因，所以表明R 基因已被敲除的是D 组。
3．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
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回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体
内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原
因是 。
【答案】(1)两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
(2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ
(3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床
(4)排除PCR 体系中外源DNA 的污染
(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR 以应对感染
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。PCR 是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。通
过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR 扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4 种脱氧核苷
酸）、酶（耐高温的DNA 聚合酶）。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条
模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结
合
（2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI 的识别序列，且这两个序列位
于启动子和终止子之间，因此，将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效
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率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为
这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。
（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将
胚胎移植到小鼠c 的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚
胎的存活率。
（4）利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组作为空白对照，这
样可以排除PCR 体系中外源DNA 的污染，提高实验结果的可信度。
（5）若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进
而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR 无法表达，因而干
扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。
4．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究
人员发现，基因S 在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因
（两品种中基因S 序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S 启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN 克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S 的优质大豆品种YZ。根据题19
图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ 所得再生植株YZ-1 的种子变大。同时将从TL 克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2 的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN 较TL 种
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子大的原因是 。
【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）
(2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接
（反向链接）
(3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S 片段 PCR
(4)品种DN 的基因S 上游启动子效应比TL 强，使得基因S 表达量更高，种子更大
【详解】（1）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA 的转录，是一段DNA 片段，其基
本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
（2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA 序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶
EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，
形成的DNA 片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单
向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
（3）①DNA 电泳可以分离不同大小的DNA 片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动
子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，
还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR 等技术检测受体细胞的DNA 上是否插入目的基因
或目的基因是否转录出mRNA。
（4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1 导入的目的基因为取自品种DN 的“启动子D＋基因S”序
列，再生植株YZ-2 导入的目的基因为取自品种TL 的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中
基因S 序列无差异”可推测：品种DN 的基因S 上游的启动子D 的效应强于品种TL 的启动子T，启动子D
使基因S 表达量更高，因而种子更大。
5．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研
究。回答下列问题：
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(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体
融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完
整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动
子pL 和下游的终止子结构如图a。图b 是一种Ti 质粒的结构示意图，其中基因gus 编码GUS 酶，GUS 酶
活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L 的启动子pL 活性的影响。从图a 所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其
与相同限制酶酶切的Ti 质粒连接，再导入烟草。随机选取3 组转基因成功的烟草（P1、P2 和P3）进行病
原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL 的活性增强，其中 的诱导作
用最强。
②现发现栽培种百合B 中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L
的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。
【答案】(1) 纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素
(2) 花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
(3) HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 利用转基因技术将百合B 中L 基因的启动子替换为野生百合
中L 基因的启动子pL
【详解】（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和
果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素
诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。
（2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观
察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。
（3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL 并连接到质粒上，
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可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti 质粒中的启动子，从而达到根据GUS 酶活性反映启动
子活性的目的。根据图c 的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS 酶活性都最高，可确定
其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B 中L 基因的
启动子替换为野生百合中L 基因的启动子pL。
6．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L 能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程
技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI 切点处插入大豆基因L 的向导DNA 序
列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体
信息、目标基因L 部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目标基因L 时，所用的引物越短，引物特异性越 （填
“高”或“低”）。限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI 酶切大豆基
因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI 酶切后，载体上保
留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴
定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，部分序列信息及可选
用的酶切位点如图乙所示，PCR 产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是
，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
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(3)实验中获得1 株基因L 成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1 条染
色体有T-DNA 插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占
比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3'
(2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④
(3)1/4
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度
通常为20~30 个核苷酸。由此可知，在利用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目的基因时，所用的引物
越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性
末端，若用BsaI 酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根
据理论来推测，BsaI 切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256 种排列顺序，故答案应为
256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI 酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-
GTTT-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此
可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L 的目标序列跟突变序
列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及
题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，并对
PCR 产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，
限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会
出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l 成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经
过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA 插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA 片段
上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-
DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为
1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用
于后续的品种选育。
1．（2025 届辽宁省抚顺市高三下学期3 月模拟考试）重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是一种新型恒温核
酸扩增技术，它利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶，在39℃条件下实现对核酸的快速扩增。其具
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体过程如下图所示，请回答下列相关问题：
(1)新型核酸扩增技术——RPA 是在PCR 技术的基础上发展而来的，它极大的简化了实验流程。据上图可
知，RPA 的原理是 。除快速之外，RPA 还具有的其它优势是 （答出1 点即可）。
(2)在RPA 反应中，首先 与重组酶结合，在重组酶作用下识别并与模板DNA 结合。在子链延伸的过
程中，被置换出的 （模板链/非模板链）与单链结合蛋白暂时结合。
(3)某实验兴趣小组在进行RPA 实验前设计了两对引物，如下表所示。应选择 （引物对1/引物对2）
更适合，原因一是 ；原因二是引物越短，其特异性越 （高/低）。
引物对1
5’-GACCACTCTGAA-3’
5’-TTCAGAGTGGTC-3’
引物对2
5’-CGTTAGATCTTTTACAACTGCATAATG-3’
5’-GATATTGAGAATTCGCCAAAGGCTACC-3’
(4)冬季患流感的人数增多， （能/不能）直接利用RPA 扩增流感病毒的核酸，其理由是 。
【答案】(1) DNA 半保留复制 RPA 恒温扩增，PCR 三个阶段温度不同
(2) 引物 非模板链
(3) 引物对2 引物对1 的两个引物序列互补，可能存在自身结合的风险 低
(4) 不能 流感病毒遗传物质为RNA，不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA 再进行扩增
【分析】PCR 技术：（1）概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合
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成技术。（2）原理：DNA 半保留复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一
对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）（5）过程：
高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低
温复性：引物结合到互补链DNA 上；中温延伸：合成子链。
【详解】（1）据题干信息和题图分析可知，RPA 是在PCR 技术基础上发展而来的新型恒温核酸扩增技术。
故RPA 的原理是DNA 半保留复制。除了快速扩增这一显著优势外，RPA 还具有操作简便（因为RPA 恒温
扩增，PCR 三个阶段温度不同）、对设备的要求低（不需要高精度的热循环仪等复杂设备）以及对样本的
适应性强（可以扩增各种来源的DNA，包括复杂样本中的微量DNA）等优势。
（2）据题干信息和题图分析可知，在RPA 反应中，首先引物会与重组酶结合，形成引物-重组酶复合物。
这个复合物在重组酶的作用下能够识别并结合到模板DNA 的一条链上（这条链被称为模板链，而另一条
被置换出的链则被称为非模板链）。在子链延伸的过程中，被置换出的非模板链会与单链结合蛋白暂时结
合，以防止其干扰新链的合成。这样，RPA 反应就能够持续进行，实现核酸的快速扩增。
（3）RPA 是一种恒温核酸扩增技术，它要求引物能够特异性地识别并结合到模板DNA 上，从而启动扩增
反应。因此，在选择引物时，需要考虑引物的长度、特异性以及与其他序列的互补性等因素。故应该选择
引物对2 更适合，由表格中引物序列分析可知，引物对1 的两个引物序列互补，所以不选引物对1 的原因，
其一是引物对1 可能存在自身结合的风险，同时引物越短，其特异性越低。
（4）冬季患流感的人数增多时不能直接利用RPA 扩增流感病毒的核酸。因为RPA 技术是基于DNA 的扩
增技术，它需要双链DNA 模板来进行扩增。而流感病毒的遗传物质是RNA。因此，在利用RPA 扩增流感
病毒的核酸之前需要先将流感病毒的RNA 逆转录成cDNA，然后再以cDNA 为模板进行RPA 扩增。所以
不能直接利用RPA 扩增流感病毒的原始RNA 核酸。
2．（辽宁省名校联盟2025 届高三下学期一模考试）科研团队通过转基因获得的大肠杆菌工程菌，成为监
测残留在生物组织或环境中四环素水平的“报警器”，其监测原理如图1 所示。天然大肠杆菌不具备图1
中所示基因和四环素抗性基因。有关限制酶的识别序列及切割位点如图2 所示。
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(1)根据图1、图2 的信息，至少需要使用 种酶才能将DNA 片段1、片段2 正确拼接成一段完整的
DNA 分子，其中在拼接处的碱基序列为 （填写编号）。
(2)图3 是构建基因表达载体时所选用的质粒，请在图4 中绘制出构建成功的重组质粒示意图，并标明基因
。
图4 的重组质粒分别表达TetR 蛋白、GFP 蛋白时，所使用的模板链位于 （同一条\不同）DNA 单
链，判断依据是 。
(3)筛选充当“报警器”的大肠杆菌工程菌时，应将大肠杆菌培养在含有适宜浓度的四环素培养基上，当菌
落出现 现象时，表明重组质粒成功导入大肠杆菌。能在该培养基上形成菌落的大肠杆菌
（一定\不一定）含有重组质粒。
(4)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP 的第65 位丝氨酸突变成苏氨酸后，增加了
绿色荧光稳定性和强度。该项技术属于 （基因工程\蛋白质工程）。
【答案】(1) 3 ②或③
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(2)
不同 重组质粒中TetR 基因和GFP 基因转录方向不同
(3) 绿色荧光 不一定
(4)蛋白质
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）为保证重组质粒能正确连接，选择的两种限制酶切割片段后应能形成相同的黏性末端，据
图可知，可选择XbaⅠ和SpeⅠ，此后还要用DNA 连接酶进行连接，故至少需要3 种酶才能将DNA 片段1、
片段2 正确拼接成一段完整的DNA。
（2）重组质粒含有目的基因、标记基因、限制酶切割位点、启动子、终止子、复制原点，结合图示可知，
启动子有启动子1 和启动子2，还应包括GFP 基因，将目的基因导入质粒两种酶切位点之间，故可绘制图
形如下：
。分析题图，重组质粒中TetR 基因和GFP 基因转录方向不同，
故图4 的重组质粒分别表达TetR 蛋白、GFP 蛋白时，所使用的模板链位于不同DNA 单链。
（3）分析题图，图中含有GFP 蛋白（绿色荧光蛋白）和四环素抗性基因，筛选充当“报警器”的大肠杆
菌工程菌时，应将大肠杆菌培养在含有适宜浓度的四环素培养基上，当菌落出现绿色荧光现象时，表明重
组质粒成功导入大肠杆菌；由于含四环素抗性基因的未重组质粒也可导入大肠杆菌，使其在培养基上形成
菌落，故能在该培养基上形成菌落的大肠杆菌不一定含有重组质粒。
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（4）该项技术最终改变的是GFP（蛋白质）的结构，属于蛋白质工程。
3．（2025 届吉林市高三第三次模拟考试）大刍草是玉米的原始祖先，具有较强的抗病抗逆特性，为玉米
育种提供了原始的遗传材料。研究发现大刍草基因组中有一个D 基因仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，
在卵细胞中不转录。为研究D 基因表达对卵细胞的影响，科研工作者设计了如图实验。据图回答：
(1)D 基因在大刍草卵细胞中不转录，可能卵细胞中D 基因的 （结构）出现问题，从而无法启动转录
过程。
(2)按如图所示，将重组的基因表达载体导入农杆菌前，先用 处理农杆菌细胞，使其处于一种
的生理状态。
(3)让农杆菌侵染大刍草愈伤组织，在愈伤组织培养基中需添加 和 ，以便筛选导入融合基因
的植物细胞。
(4)为确定大刍草基因组中B 基因与育性相关，研究者用转基因技术进行一系列实验，将一段T—DNA 插入
到B 基因中，致使该基因失活，记为b，再进行杂交。为方便确定实验中的子代植株的基因型，研究者据
B 基因、T—DNA 的序列设计了3 种引物，如图所示：
具体操作时，提取待测植株的总DNA，分别用“引物Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否能扩
增（完整的T—DNA 过大，不能完成PCR 扩增）。推测结果：如果引物“Ⅰ+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行
PCR 均可完成扩增，则植株的基因型为 ；如果 ，则植株的基因型为BB；如果
，则植株的基因型为bb。
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【答案】(1)启动子
(2) Ca2+（或CaCl2） 可以吸收外源DNA（或周围环境中的DNA 或感受态）
(3) 荧光素 潮霉素
(4) Bb 仅“Ⅱ＋Ⅲ”组能完成扩增 仅“Ⅰ＋Ⅲ”组能完成扩增
【分析】分析题图：①表示将基因表达载体导入农杆菌细胞；②表示利用农杆菌转化法将目的基因导入植
物细胞。
【详解】（1）转录的启动需要RNA 聚合酶与基因的启动子结合，D 基因在大刍草卵细胞中不转录，很可
能是卵细胞中D 基因的启动子出现问题，导致RNA 聚合酶无法与之结合，从而无法启动转录过程。
（2）将重组的基因表达载体导入农杆菌细胞时，常用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环
境中DNA 分子的生理状态，即感受态。
（3）因为重组基因表达载体中只有T-DNA 中的潮霉素抗性基因和Luc 基因（Luc 基因表达的荧光素酶能
催化荧光素产生荧光），能整合到植物细胞染色体的DNA 上，所以在愈伤组织培养基中需添加潮霉素和
荧光素，含有重组基因表达载体的植物细胞具有潮霉素抗性，同时若Luc 基因正常表达能催化荧光素产生
荧光，以此来筛选导入融合基因的植物细胞。
（4）根据题干子链延伸的方向总是5′→3'，当使用“引物I+Ⅲ”组合进行PCR 时，二者可扩增出从B 基因
的左端到T 一DNA 之间的部分序列（省略号代表大量碱基），表明该植株含有b 基因。当使用引物
“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR 时， 可直接扩增出从B 基因左端的CCGTGT 到右端的ATGCCT 之间的序列（意
味着B 基因未被插入T-DNA）。又由题干可知，完整的T-DNA 过大，不能完成PCR，所以当B 基因之间
若插入了T-DNA，即基因型为b 时，通过PCR 不能扩增。总之，当使用引物“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR 时，
能扩增的就是B 基因，不能扩增的就是b 基因，所以当植株的基因型为Bb，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及
“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，都能检测出扩增的情况。同理，若仅引物“Ⅰ+Ⅲ”能扩增，则基因型为bb；若仅
引物“Ⅱ+Ⅲ”能扩增，则基因型为BB。
4．（2025 届吉林省延边朝鲜族自治州高三一模）药物A 是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对
治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。回答下
列问题。
(1)科学家根据药物A 的氨基酸序列人工合成DNA 片段，由于 ，该方法得到的DNA 片段有多种可能，
也可以用PCR 技术从植物细胞中扩增出药物A 基因，该技术的原理为 。
(2)下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点（限制酶的识别序列和
切割位点如表所示），其中lacZ 基因表达的产物可将无色物质X-gal 催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝
色。回答下列问题。
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注：kb 代表碱基对，Kanr基因为卡那霉素抗性基因
限制酶
BamHⅠ
EcoRⅠ
Sau3AⅠ
SmaⅠ
XmaⅠ
识别序列和切割
位点
-G↓GATCC-
-G↓AATTC-
-↓GATC-
-CCC↓GGG-
-C↓CCGGG-
①利用PCR 技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如下，扩增时选用的两种引物
碱基序列为（注明序列的5′和3′端） 、 。
②分析上图，为将目的基因准确插入质粒中，最好选用 酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和
质粒需使用 （填“T4”、“E.coli”或“T4或E.coli”）DNA 连接酶处理，才能得到重组质粒。
③将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要将其培养在添加了 的培养
基上。
④若将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为 bp 的条带。对于琼
脂糖凝胶电泳结果符合预期的PCR 产物条带，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 一种氨基酸可能有多种密码子编码（密码子具有简并性） DNA 半保留复制
(2) 5′-TCTGTT-3′ 5′-CTTGGA-3′ BamH Ⅰ和Xma Ⅰ T4或E.coli 卡那霉素和X-gal
1700bp 和260bp 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待测DNA 分子大小，无法确定待测DNA 分子碱
基序列。
【分析】基因工程是指按照人们的原望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们
需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施
工的，因此又叫作重组DNA 技术。基因工程的基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、
将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由于密码子具有简并性，即同一种氨基酸可以对应多种密码子，因此，根据药物A 的氨基
酸序列人工合成DNA 片段的方法得到的DNA 片段有多种可能。PCR 技术是体外扩增DNA 的技术，该技
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术的原理是DNA 的半保留复制。
（2）①由于DNA 复制时子链的延伸是从5′端向3′端延伸，含磷酸基团的一端为5′端，含羟基的一端为3′
端，因此两个引物的设计需要分别根据模板DNA 两条链的3′端进行设计，因此，依据图中目的基因两侧
相关序列，扩增时选用的引物碱基序列为5′-TCTGTT-3′和5′-CTTGGA-3′。
②目的基因与质粒形成重组分子要有相同的末端，且目的基因应插入启动子和终止子之间才能在受体细胞
中表达。终止子与启动子之间有三种限制酶识别序列：EcoR I、Xma I 和BamH I。据图可知，EcoR I 会破
坏目的基因，故为将目的基因准确插入质粒中，最好选用Xma I 和BamH I 切割目的基因。Xma I 和BamH
I 切割得到的是黏性末端，用T4或E.coli DNA 连接酶处理均可，都可以得到重组质粒。
③由图可知，质粒中含有LacZ 基因和卡那霉素抗性基因，在构建基因表达载体时LacZ 基因被破坏，无法
使无色的X-ga1 变为蓝色。因此，在培养基中应加入的物质有卡那霉素和X-gal，只有成功导入目的基因的
重组质粒的细菌才能不被卡那霉素杀死，同时表现为无色菌落。
④根据质粒和目的基因中EcoR Ⅰ的酶切位点可知，正向连接后用EcoR Ⅰ切割，可以得到两个片段分别为
400+700+600=1700bp，10+50+200=260bp，故通过琼脂糖凝胶电泳分离后，可得到长度为1700bp 和260bp
的条带。对于电泳结果符合预期的PCR 产物条带，通常需进一步通过基因测序确认，这是因为琼脂糖凝胶
电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列，因此需要对目标
DNA 进行碱基序列的确认。
5．（2025 届黑龙江省齐齐哈尔市高三下学期二模）番茄不耐寒，低温易冻伤，难以储藏。我国科研人员
从某种耐寒植物中提取了抗冻基因AtCOR15a，经过转基因技术获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程
如图。回答下列问题：
(1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有 （填序号）。
①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短
④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁
(2)获得图中①的过程称为 ，该过程使用的限制酶是 原因是：
。
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(3)将①与用 处理的农杆菌混合，从而将目的基因导入农杆菌，最终整合到宿主胞的
上，该方法称为 。
(4)如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，过程称为反向
PCR，具体流程如下图（以EcoRI 酶切为例）
若下表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，选用的PCR 引物序列必须是 引物①②③④
中选择，填编号）。
DNA 序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
5'-AACTATGCGCTCATGA-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
3'-TTGATACGCGAGTACT-CGITACGCAICGGAGA-5'
PCR 引物
5' -AACTATGCGCTCATGA-3'
①
5' -GCAATGCGTAGCCTCT-3'
②
5' -AGAGGCTACGCATTGC-3'
③
5' -TCATGAGCGCATAGTT-3'
④
(5)为了提高AtCOR15a 基因在受体细胞的表达水平，可将AtCOR15a 基因与外源强启动子连如下图所示。
利用PCR 检测上述连接是否成功，可选择的引物组合是 （填序号组合）。（注：图中①、②、
③、④表示引物）
【答案】(1)②③④
(2) 基因表达载体的构建 BamHI 和Hind III 目的基因两侧和T-DNA 内部含有BamHI 和
HindIII 的酶切位点，确保目的基因插入到Ti 质粒的T-DNA 中
(3) Ca2+ 染色体DNA 农杆菌转化法
(4)②④
(5)①和③或①和④
【分析】采用PCR 技术扩增DNA 的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR 技术扩增目的基因的原理：
DNA 双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA 两条链的3′端的碱基进行碱基互补
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配对，可作为DNA 复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。
【详解】（1）与杂交育种相比，基因工程育种的操作方法较复杂，容易造成基因污染进而对生态产生威
胁，但基因工程育种的目的性强，能定向改变生物性状，且育种周期短，不受生殖隔离限制，能克服远缘
杂交不亲和障碍，②③④正确，①⑤错误。
故选②③④。
（2）获得图中①的过程为基因表达载体的构建。该过程使用的限制酶是BamHI 和Hind III，原因是为了能
筛选重组DNA 分子，必须保留标记基因（即质粒上的抗生素抗性基因），故不能选择SmaI。若选择
EcoRI，则目的基因两端具有相同的黏性末端，目的基因会自身环化，且不保证插入到T-DNA 中。目的基
因两侧和T-DNA 内部含有BamHI 和Hind III 的酶切位点。综上，采用双酶切法，据图选用的两种限制酶组
合是BamHI 和Hind III。
（3）用Ca2+处理的，可使农杆菌处于容易吸收周围环境DNA 分子的状态，从而将目的基因导入农杆菌，
最终整合到宿主细胞的染色体DNA 上，该方法称为农杆菌转化法。
（4）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA 两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作
为DNA 复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图可知，结合已知序列可知，能与片段F 左边配对
的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤III 选用的PCR 引物应当为②④。
（5）利用PCR 检测AtCOR15a 基因与外源强启动子连接是否成功，应当将强启动子和AtCOR15a 基因都
扩增出来，所以可选择的引物组合是①＋③或①＋④。
6．（黑龙江省哈尔滨市第九中学2024—2025 学年高三下学期第二次模拟）苹果生长过程中易受真菌感染，
科研人员将在其他植物中的BG2 基因（2071bp）转入苹果中，该基因控制合成的β-1，3 葡聚糖酶可降解
许多病原真菌的细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。请回答下列问题：
(1)图1 为构建含BG2 基因重组质粒的过程。研究人员用XbaⅠ和NotⅠ切割质粒和目的基因后，二者可连接
在一起构成重组质粒，原因是 ，图中增强子是一段能使基因转录频率明显增加的DNA 序列，
其参与构成的复合启动子的作用是：①RNA 聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA；②
。
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(2)也可利用无缝克隆（In-Fusion）技术构建含BG2 基因的重组质粒流程图，其中In-Fusion 酶可以将任何
具有相同15~20bp 末端序列的线性DNA 分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。
①图中过程①是利用PCR 技术将质粒线性化。引物F 和R 序列要依据 的末端序列设计。引物的作
用是 。
②利用该无缝克隆技术筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠
杆菌，菌液涂布到含 的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入引物、四种脱氧核苷酸、
缓冲液、 酶等进行菌落PCR，图3 是对质粒转化菌落进行PCR 验证时的产物电泳结果，泳道
4、5、7 对应的菌株可能转化成功，判断的理由是 。
③与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 技术无需 酶。
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(3)GUS 基因为常用的报告基因，只能在导入真核细胞后正确表达，而在农杆菌中不能正确表达。转GUS
基因的植物组织浸泡在含有某底物的营养液中，GUS 能与底物发生反应使营养液呈现蓝色。将构建好的
BG2 重组质粒（含有GUS 基因）与农杆菌共培养，然后将菌液接种至含抗生素的培养基上可筛选出含有
BG2 重组质粒的农杆菌：再将其与苹果外植体共培养进行转化，通过 （写出筛选
过程），从而获得成功转化的受体细胞。
【答案】(1) 酶切后产生的黏性末端相同 增强转录活性
(2) BG2 基因（目的基因）和线性化质粒 使DNA 聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
氨苄青霉素 耐高温的DNA 聚合酶 4.5.7 的电泳结果接近(或大于)2071bp 限制酶和DNA 连
接酶
(3)将苹果外植体浸泡在合有某底物的营养液中，筛选出使营养液呈蓝的外植体（或对苹果外植体喷洒一定
浓度的真菌溶液，筛选出能抑制真菌生长的外植体）
【分析】Xba 工酶切后的末端与SpeI 酶切后的末端能连接，即黏性末端能发生碱基互补，是因为XbaI 与
SpeI 酶切后产生的黏性末端相同。图中增强子是一段能使基因转录频率明显增加的DNA 序列，其参与构
成的复合启动子的作用是:驱动基因的转录(或RNA 聚合酶识别和结合位点);②增强转录活性
【详解】（1）Xba 工酶切后的末端与SpeI 酶切后的末端能连接，即黏性末端能发生碱基互补，是因为
XbaI 与SpeI 酶切后产生的黏性末端相同。图中增强子是一段能使基因转录频率明显增加的DNA 序列，其
参与构成的复合启动子的作用是:驱动基因的转录(或RNA 聚合酶识别和结合位点);②增强转录活性。
（2）①图中过程①是利用PCR 技术将质粒线性化。引物F 和R 序列要依据BG2 基因（目的基因）和线性
化质粒的末端序列设计，才能让二者联系在一起，引物的作用是使DNA 聚合酶能够从引物的3′端开始连
接脱氧核苷酸。
②由图可知，引物1 和引物4 扩增后的产物为环状，为获得线性化质粒需选用引物2 和引物3。为保证扩增
出两端含线性化质粒同源序列的目的基因，扩BG2 基因时，引物F 和R 序列要依据BG2 基因(目的基因)和
线性化质粒的末端序列设计。由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将重组质粒导入大肠杆菌，菌液
涂布到含氨苄青霉素的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入引物、四种脱氧核苷酸、缓冲液、耐
高温的DNA 聚合酶进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR 产物。对于电泳结果符合预期的质粒，还需进行
基因测序以确认其是否为目标质粒。
BG2 基因是目的基因，BG2 基因中含有2071bp，4、 5、7 的电泳结果接近(或大于)2071bp，说明4、5、7
对应的菌株中含有目 的基因，说明泳道4、5、7 对应的菌株可能转化成功
与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 技术的优势主要有不受限制酶切位点的限制;可以把目的基因插
入任何位 点;避免限制酶切割对质粒功能区的破坏，所以无需限制酶和DNA 连接酶。
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（3）Ca2+叶处理可使细菌处于易从环境中吸收DNA 分子的生理状态。图2 显示质粒上有四环素抗性基因，
可将菌液接种至含四环素的培养基上以筛选出含有BG2 抗病质粒的农杆菌，再将其与苹果外植体共培养进
行转化后，将苹果外植体浸泡在含有某底物的营养液中，筛选出使营养液呈蓝色的外植体，获得成功转化
的受体细胞。
7．（2025 届内蒙古阿拉善盟（呼和浩特市、鄂尔多斯市）高三下学期一模）双乙酰是啤酒中的主要风味
物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2 基因编码双乙
酰合成中的关键酶，GSH1 基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人
员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUPI 基因的表达产物可使细胞对一定浓度的
硫酸铜产生抗性。请分析回答：
SalⅠ
5'-G↓TCGAC-3'
Kpn Ⅰ
5'-G↓GTACC-3'
Sph Ⅰ
5' -GCATG↓C -3
Xba Ⅰ
5'-T↓CTAGA-3''
Bgl Ⅱ
5'-A↓GATCT-3'
Pst Ⅰ
5'-CTCC↓AG-3'
(1)分析图1 可知，需用 （填限制酶名称）切割质粒1 以获取CUPI 基因。
(2)转化后的啤酒酵母应置于含 的培养基中进行初步筛选。
(3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的 为模板，用图示两种引物进行PCR 扩增。若扩增
产物的大小约为1300bp，则说明 基因已整合到啤酒酵母的染色体上。
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(4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图2。
据图2 分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力 。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显
未转化的受体菌，原因是 。
【答案】(1)Bgl Ⅱ 和 Sal Ⅰ
(2)一定浓度的硫酸铜
(3) 总DNA CUP1 基因和GSH1 基因
(4) 增强 低于 啤酒酵母工程菌的ILV2 基因被破坏
【分析】基因工程的基本操作程序包括四个步骤：目的基因的获得、基因表达载体的构建、将目的基因导
入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。其中需要用的基本工具有限制性内切核酸酶（简称限制酶）、DNA
连接酶和运载体。限制酶能够识别DNA 上特定的碱基序列，将DNA 从特定的位置切开，用同种的限制酶
处理目的DNA 和运载体，得到相同的末端，再用DNA 连接酶将目的基因和运载体连接起来，形成重组运
载体。
【详解】（1）观察图1 中质粒1 的结构，CUPI 基因两端的限制酶切割位点分别为Sal Ⅰ和Bg1Ⅱ，所以要
用Sal Ⅰ和Bg1Ⅱ切割质粒1，才能将CUPI 基因完整地从质粒1 上切割下来；
（2）由题意“CUPI 基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性”可知，转化后的啤酒酵母应
置于含一定浓度的硫酸铜的培养基中进行初步筛选，这样就可以筛选出转化后含有CUPI 基因的啤酒酵母，
只有成功导入并表达CUPI 基因的啤酒酵母才能在含铜离子的培养基中生存；
（3）进一步鉴定需要检测目的基因是否整合到啤酒酵母的染色体上，所以应以转化后啤酒酵母的总DNA
为模板，因为啤酒酵母的总DNA 包含了可能整合进去的CUPI 基因等所有遗传物质；由图1 可知，用Kpn
Ⅰ和Pst Ⅰ处理重组质粒后导入啤酒酵母的片段含有CUPI 基因和GSH1 基因。已知CUPI 基因大小为
1028bp，引物1 到引物2 之间还包含ILV2 -左部分片段（270bp），1028+270=1298，约为1300bp，因此扩
增产物的大小约为1300bp 则说明CUPI 基因导入啤酒酵母的染色体上，也说明CUPI 基因和GSH1 基因已
整合到啤酒酵母的染色体上；
（4）由题意可知，谷胱甘肽含量越高，抗老化能力越强。从图2 可以看出，工程菌的谷胱甘肽含量高于未
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转化的受体菌，所以啤酒酵母工程菌抗老化能力增强；由图2 可知，啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显
低于未转化的受体菌，由题意可知，ILV2 基因是编码双乙酰合成中的关键酶，如果转化的啤酒酵母工程菌
的ILV2 基因被破坏，就不能编码双乙酰合成中的关键酶，从而使工程菌的双乙酰合成量降低。
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