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微专题15 RT－PCR、反向PCR 与PCR 定点诱变
技术
考情速览
热点
考情
RT－RCR、实时荧光定
量、PCR 与反向PCR
2022·全国乙卷，38；2022·江苏卷，24；2020·江
苏卷，33；2020·山东卷，25
PCR 定点诱变技术
2023·辽宁卷，25；2021·天津卷，16
热点1 RT－PCR 与反向PCR
【剖析真题】
(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒(辅助T－
DNA 转移)和不含有Vir 基因、含有T－DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可
提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病
虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1～F3，R1～R3 表示引物；T－DNA－LB 表示左边界；T－DNA－RB 表
示右边界；Ori 表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素
B 抗性基因。
(1) 从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________。
提取过程中加入体积分数为95% 的预冷酒精，其目的是
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是________和________。
(3)穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是________________________，驱动目的
基因转录；插入两个
p35s
启动子，其目的可能是
______________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因
对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行
PCR，应选用的引物是________和________。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C.将1～1 362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1～1 362 合成基因序列和1 363～1 848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【情境应用】
情境素材 反向PCR 是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，
其过程如下图所示。
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(1)要扩增未知序列，应选择哪两种引物？
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
(2) 上述PCR 产物是环状DNA 分子还是链状DNA 分子？
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
(3)上述PCR 过程中使用了哪些酶？______________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
【梳理知识】
1.RT－PCR：即逆转录PCR，是将RNA 的逆转录(RT)和cDNA 的聚合酶链式反
应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用从RNA 合成cDNA，再以cDNA
为模板，在DNA 聚合酶的作用下扩增合成目的片段。
命题要点提醒：由于RNA 不稳定，因此PCR 不能直接扩增RNA；需要先将
RNA 逆转录得到cDNA，再进行PCR 扩增。
2.反向PCR：反向PCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片
段，而常规PCR 扩增的是已知序列的两引物之间的DNA 片段。
(1)原理
①酶切：选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA 进行酶切；
②连接：用DNA 连接酶使靶序列环化连接；
③扩增：用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外的未知序列。
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(2)应用
通过反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，并可将仅知部分序列的全长
cDNA 进行分子克隆，建立全长的DNA 探针。
命题要点提醒：
①选择限制酶时，要保证其在已知序列内部没有限制酶切割位点；
②选择引物时，要选择反向引物对(相对于已知序列)；若选择的是相向引物对，
则扩增的是已知序列。
【巩固训练】
(2025·广东江门期中)常规PCR 只能扩增两引物间的DNA 区段，要扩增已知
DNA 序列两侧的未知DNA 序列，可用反向PCR 技术。反向PCR 技术扩增的原
理如图所示。下列叙述错误的是( )
A.酶切阶段，L 中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B.PCR 技术的操作步骤依次是高温变性、低温复性、中温延伸
C.图中引物应选择引物1 和引物4，且二者间不能互补配对
D.PCR 扩增时，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA 切割成线状
热点2 PCR 定点诱变技术
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【剖析真题】
(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组
中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N 基因的质粒中插入B1 基
因组的M1 与M2 片段；再经限制酶切割获得含N 基因的片段甲，片段甲两端分
别为M1 与M2；利用CRISPR/Cas9 基因组编辑技术将片段甲插入B1 的基因组，
得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下
图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是________。为保证N 基因能在菌株B2 中表达，在构建
片段甲时，应将M1 与M2 片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，
原因是_______________________________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1 基因组中与向导RNA 结合的DNA。向导
RNA 与B1 基因组DNA 互补配对可以形成的碱基对有G—C 和
____________________。
(3)用引物P1 和P2 进行PCR 可验证片段甲插入了细菌B1 基因组，所用的模板是
________；若用该模板与引物P3 和P4 进行PCR，实验结果是________________
_______________________________________________________________。
(4) 与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是
_______________________________________________________________
___________________________________________________(答出2 点即可)。
【情境应用】
情境素材一 在基因工程实践中，常用重叠延伸PCR 技术。
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(1)操作中哪些引物应含有拟突变位点？
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
(2) 进行
PCR1
和
PCR2
时，应分别选择哪些引物？
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
(3) 为获得大量目的基因序列，进行PCR3 时应选择哪两种引物？
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
情境素材二 瑞典科学家斯万特·帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的
发现荣获2022 年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR 构
建定点突变。基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来
改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR 定点突变常用来研究蛋白质结构
改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR 反应即可获得，
第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR 扩增的大引物，过
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程如图所示。
(1)第一轮PCR 所用的引物有哪些？______________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
(2)第二轮PCR 所用的引物除了侧翼引物外，还有大引物。该大引物是第一次
PCR
扩
增
产
物
中
的
①
链
还
是
②
链
？
___________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
(3)与常规引物相比，大引物有何特点？
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
【梳理知识】
1.利用引物中引入突变位点——在目的基因一端引入突变位点
(1)两个引物均从内部扩增，在某一引物引入突变位点
提醒 若两个引物均从内部扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第3 次扩
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增后才可获得双链等长的DNA 片段，第n 轮扩增后可获得2n－2n 个突变
DNA。
(2)一个引物从内部扩增，另一个引物从侧翼扩增，在某一引物引入突变位点
提醒 若一个引物从内部扩增，另一个引物从侧翼扩增，其中一个引物引入突变
位点，则至少第2 次扩增可获得双链等长的DNA 片段，第n 轮扩增后可获得2n
－(n＋1)个突变DNA。
2.利用重叠延伸PCR 技术引入突变位点——在目的基因内部引入突变位点
重叠延伸PCR 是发展最早的PCR 定点突变技术。如下图所示，该技术要使用四
条引物。其中引物2 和引物3 的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这
两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1 和引
物2，引物3 和引物4 进行PCR 后，得到的DNA 片段可以通过引物2 和引物3
互补的碱基杂交在一起，再在DNA 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的
DNA 片段。最后，用引物1 和引物4 进行扩增得到含有突变位点的DNA 片段。
通过测序可检验定点突变是否成功。
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3.利用大引物PCR 技术引入突变位点——在目的基因内部引入突变位点
大引物PCR 需要用引物进行两次PCR，其操作步骤如下：①根据目的基因序列
设计引物，得到两个常规引物，分别为常规上游引物和常规下游引物；②根据突
变碱基所处序列设计突变上游引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；③
由突变上游引物与常规下游引物进行第一次PCR 反应得到下游大引物；④用得
到的下游大引物和另一个常规上游引物进行第二次PCR 扩增，得到突变目的基
因序列。
【巩固训练】
1.(2025·广东佛山质检)PCR 定点突变技术是一种基因工程技术，它可以通过人工
合成的引物，使目标DNA 序列发生特定的突变，从而实现对基因的精确编辑。
PCR 定点突变技术的过程如图所示(图中对应的字母为引物，黑点为定点诱变的
位点)。下列叙述错误的是( )
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A.获得片段1 所需要的引物为F 和R_m，且2 次循环即得片段1
B.获得片段2 所需要的引物为R 和F_m，且1 次循环即得片段2
C.图中两种引物F_m 和R_m 之间，能够进行碱基互补配对
D.图中PCR 扩增所需要的引物F 和R 最好不配对
2.(2024·长郡中学模拟)研究人员欲比较大肠杆菌YT1 和芽孢杆菌YP1 两类细菌
降解塑料中聚乙烯(PE)的能力，并通过基因工程拼接黄粉虫肠道内菌株WZ 降解
塑料中聚氯乙烯(PVC)的胞外酶基因A，培育降解塑料的“超级菌”。请回答下
列问题：
(1)菌株的筛选。配置固体培养基，接种菌株后表层覆盖0.1 mm 厚度的PE 塑料，
分组实验，结果如表所示：
培养基及接种菌株
培养基1
培养基2
培养基3
单独培养并接
种YT1
单独培养并接
种YP1
混合培养YT1 和YP1
后，选取YP1 接种
降解圈直径R1/cm
1.22
1.55
1.43
菌落R2/cm
0.35
0.55
0.43
R1/R2
3.5
2.8
3.3
从功能上讲，该培养基属于________培养基。培养基3 中接种混合培养后的
YP1，与单独培养并接种YP1 比较，降解PE 的能力________，其原因可能是
_______________________________________________________________。
(2)培育“超级菌”。对菌株WZ 的A 基因测序可知，如果在其调节功能区增加
一个碱基对A/T，则可以大大增强其基因表达能力。通过经典的大引物PCR 定
点诱变技术在体外改造A 基因，操作过程如图1。改造A 基因与图2 所示的质粒
构建表达载体，培育“超级菌”。
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①通过PCR1 构建大引物：需要两步，先后使用的引物分别是________。PCR 中
引物的作用是___________________________________________________
_______________________________________________________________。
②通过PCR2 获得完整的改良的A 基因。
③构建改良基因表达载体：为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶
是________。
④将表达载体导入受体菌株。
⑤检测和鉴定：在含氨苄青霉素和β－半乳糖苷的平板上培养一段时间后，其中
含有重组质粒，判断的依据是____________________________________________
_______________________________________________________________。
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参考答案
热点1
【剖析真题】
(1)水解蛋白质，使得DNA 与蛋白质分离 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精
的DNA (2)PCR 技术扩增 人工合成
(3)RNA 聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因的转录效率
(4)HygBR (5)F3 R2 (6)D
解析 (1)从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使
得DNA 与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是
溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法
是人工合成和PCR 技术扩增。(3)穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是RNA 聚
合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可
能是提高目的基因的转录效率。(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭
质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步
筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植
株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是F3 和R2。(6)D 项所述内容
制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。
情境探疑·拓展应用
情境素材 (1)提示 引物1 和引物4。
(2)提示 链状DNA 分子。
(3)提示 限制酶、DNA 连接酶和耐高温的DNA 聚合酶。
【巩固训练】
D [在酶切阶段，已知序列L 中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然
会将已知序列L 切断，造成序列识别混乱，A 正确；PCR 技术的操作步骤依次
是高温使DNA 变性、低温复性(使DNA 单链与引物结合)、中温延伸，B 正确；
PCR 过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结
合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1 和引物4，且二
者间不能互补配对，C 正确；PCR 的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，
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并不需要每轮都加入，D 错误。]
热点2
【剖析真题】
(1)磷酸二酯键 保证N 基因启动子、N 基因、N 基因终止子的完整性，确保N
基因能够顺利表达 (2)C—G、U—A、A—T (3)菌株B2 的基因组DNA 无
PCR 产物 (4)无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸
秆资源等
解析 (1)限制酶作用于DNA 的磷酸二酯键。由题述可知，该过程是将重组质粒
特定位点，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1＋启动子＋
N 基因＋终止子＋M2)，再接入B1 基因组中，得到B2，因此在M1 和M2 之间，
需要保证N 基因完整性，同时需要保证N 基因能够正常表达，因此需要把M1
接入启动子之前，M2 接入终止子之后。(2)根据所给信息，向导RNA 需要与对
应DNA 进行结合，结合期间，RNA 的碱基会和DNA 的碱基进行互补配对，根
据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要验证是
否插入重组后的片段甲，因此所用模板为菌株B2 的基因组DNA，如果有PCR
产物说明菌株B2 中含有N 基因，如果没有PCR 产物说明菌株B2 中不含N 基因。
因为片段甲被替换，因此在重组片段甲(M1＋启动子＋N 基因＋终止子＋M2)中，
没有引物P4 的结合位置，因此使用引物P3、P4 进行PCR 时，无法获得PCR 产
物。(4)秸秆焚烧严重污染环境，且有很大的火灾隐患，与此同时，焚烧对于有
机物中的能量是极大的浪费，可以从上述角度进行论述。例如：无空气污染；更
安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等。
情境探疑·拓展应用
情境素材一 (1)提示 引物2 和引物3。
(2)提示 进行PCR1 时需选择引物1 和引物2，进行PCR2 时需选择引物3 和引
物4。
(3)提示 引物1 和引物4。
情境素材二 (1)提示 诱变引物和侧翼引物。
(2)提示 ②链。
(3)提示 大引物特异性高。
【巩固训练】
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1.B [根据图示过程可知，获得片段1 所需要的引物为F 和R_m，且2 次循环即
得片段1，A 正确；获得片段2 所需要的引物为R 和F_m，且2 次循环即得片段
2，B 错误；结合题图分析，引物F_m 和R_m 之间，能够进行碱基互补配对，C
正确；图中PCR 扩增所需要的引物F 和R 最好不配对，以防引物发生碱基互补
配对，从而不能与模板结合，D 正确。]
2.(1)选择 增大/增强 YP1 和YT1 混合培养过程中，YP1 菌株整合了YT1 的对
PE 塑料高分解力的基因，发生了转化 (2)①诱变引物和引物1 使DNA 聚合酶
能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 ③XmaⅠ和BglⅡ ⑤含有改良基因A 的
重组质粒不含有完整的LacZ 基因，受体菌不能合成分解β－半乳糖苷而使培养
基变蓝的酶
解析 (2)①先使用诱变引物，延伸得到DNA 链；以该链为模板，引物1 与之结
合延伸得到的DNA 子链即为大引物。③为实现质粒和改良基因的准确连接，目
的基因和质粒都需使用两种限制酶切割，改良的A 基因两端的黏性末端分别为
－GGCC、－CTAG，因此需使用XmaⅠ和BglⅡ切割质粒。
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