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PCR 重难集训
题型一利用PCR 获取目的基因
【典例1】“X 基因”是DNA 分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR 技术
特异性地拷贝“X 基因”，需在PCR 反应中加入两种引物，两种引物及其与模
板链的结合位置如图1 所示。下列叙述错误的是( )
A．第一轮复制得到2 个DNA 分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4 个DNA 分子，即①②③④各一个
C．第四轮复制得到16 个DNA 分子，其中有4 个X 基因
D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA 分子
答案 C
解析 据图分析可知，第一轮复制形成2 个DNA 分子，即①②各一个，A 正确；
第二轮复制得到22＝4(个)DNA 分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即
得到①②③④各一个，B 正确；第四轮复制得到16 个DNA 分子，其中有8 个
⑤(X 基因)，C 错误；经五轮循环后共形成32 个DNA 分子，其中①②各一个，
③④各四个，22 个⑤，故产物中有五种不同的DNA 分子，D 正确。
题型二利用PCR 鉴定目的基因的连接方式
【典例1】为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟
设计引物进行PCR 鉴定。图示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应
位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对
引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是____________________。
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答案 乙、丙 目的基因反向连接
解析 分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。
如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50
＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反
向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR 鉴定。如果目的
基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲
和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。
题型三利用PCR 引导基因定点突变
【典例1】重叠延伸PCR 可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代
表突变位点)。下列说法正确的是( )
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要2 轮PCR 才能得到图中所示PCR 产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16 个突变基因则需要消耗15 个通用引物RP2
答案 D
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解析 两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A 错
误；过程①至少需要3 轮PCR 才能得到图中所示PCR 产物，B 错误；过程②获
得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C 错
误；若过程④得到16 个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16 个
突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2 的数量
为30÷2＝15(个)，D 正确。
【典例2】水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重
叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47 位
的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而
提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2 和3 的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________
来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达
到目的。引物2 的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链
DNA)。
(3)在第一阶段获得2 种具有重叠片段DNA 的过程中，引物1、引物2 组成的反
应系统和引物3、引物4 组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种
DNA 分子。该阶段必须将引物1、2 和引物3、4 置于不同反应系统中，这是因
为___________________________________
_____________________________________________________________________
_________。
(4)利用重叠延伸PCR 技术还可以将两个不同来源的DNA 片段拼接起来。有人
3
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想利用该技术把基因M 和N 拼接在一起，设计基因M 的引物M1、M2，基因N
的引物N1 、N2 。在设计这4 种引物时，特别要注意的问题是
_________________________________________________。
答案 (1)改造基因(或基因定点突变) (2)T－A 或C－G A 或G (3)3 引物2
和3 中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
(4)M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
解析 (2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A 或C－G，
对应的密码子由AAU 变成AAA 或由AAC 变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖
氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制， 则会产生3 种不同的DNA 分子，
因为引物1 和4 产生的DNA 分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸
PCR 技术成功的关键。拼接基因M 和N 时，设计引物时需要注意的是，需要找
到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须
具有互补配对的片段。
题型四利用PCR 扩增未知基因序列
【典例1】利用PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA 复制类似(如图
所示)。图中引物为单链DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误
的是( )
A．用PCR 方法扩增目的基因时不需知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR 反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A 和引物B 的DNA 片段所占的比例为
15/16
答案 D
解析 复性的目的是使引物与模板DNA 结合，故复性温度过高可能导致引物与
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模板DNA 不能结合，因而使得PCR 反应得不到任何扩增产物，C 正确；第四
轮循环共形成16 个DNA 分子，产物中同时含有引物A 和引物B 的DNA 片段
所占的比例为14/16＝7/8，D 错误。
【典例2】如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 的方法，简捷地分析出已
知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1) 步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种________________ 酶，它通过识别特定的
________________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA 连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形
成________________；PCR 循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；
Taq
DNA
聚
合
酶
的
作
用
是
催
化
___________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，步骤Ⅲ选用的PCR
引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA 序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR 引物
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
答案 (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列
(2)磷酸二酯键 DNA 单链 以DNA 为模板的DNA 链的延伸 (3)②④
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解析 (3)PCR 过程中，根据已知的DNA 序列合成两个引物，要注意模板链和
引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生
碱基互补配对，环状DNA 图中显示PCR 过程是从已知DNA 序列的两端分别向
相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA 序列的第一条链的左端互补结合，
向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA 序列的第二
条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是②。
题型五利用PCR 快速检测病原体
【典例1】荧光定量PCR 技术可定量检测样本中DNA 含量，用于病毒检测。其
原理是在PCR 反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。
当耐高温的DNA 聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接
收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测
荧光信号强度，可得Ct 值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列
相关叙述错误的是( )
A．PCR 每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3 个阶段
B．耐高温的DNA 聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键
C．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA 的含量呈正相关
D．Ct 值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
答案 D
解析 Ct 值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D
错误。
【典例2】猴痘是由猴痘病毒(一种RNA 病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患
病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法
是通过实时荧光PCR 鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以
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cDNA 为模板进行实时荧光PCR 扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR 扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链
DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在
PCR 过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA 聚合酶水解，R 与Q 分离后，
R 发出的荧光可被检测到(如图1)。
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过
________________原则而特异性结合。
②在PCR 循环的延伸阶段，Taq DNA 聚合酶催化子链的合成并水解探针。检
测到的荧光强度与反应体系中DNA 分子数呈__________(填“正相关”或“反
相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR 检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2 所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
_____________________________________________________________________
__________。
②Ct 值的含义：在PCR 扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光
阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct 值就
____________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37 判定为阳性，Ct>40 或无Ct 值判
定为阴性。图2 所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有
____________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR 检测阈值
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b．样本被污染，RNA 酶将病毒RNA 降解
c．病毒发生变异
答案 (1)逆转录 (2)①碱基互补配对 ②正相关 (3)①Taq DNA 聚合酶活性
下降、引物浓度下降、原料dNTP 浓度下降 ②越小 ③阳性 (4)abc
解析 (1)由病毒RNA 生成cDNA 的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。
(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过碱基互补配
对形成氢键而特异性结合。②在PCR 循环的延伸阶段，Taq DNA 聚合酶催化
子链的合成并水解探针。根据题干信息“荧光信号的累积与PCR 产物数量完全
同步”可知，检测到的荧光强度与反应体系中DNA 分子数呈正相关关系。
(3)①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底
物浓度降低导致的，也有可能是酶的活性缓慢下降导致的。②样本中初始模板
越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越少，Ct 值就越小。
③Ct≤37 判定为阳性，Ct>40 或无Ct 值判定为阴性。图2 中荧光阈值大概是
36，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感
染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光
PCR 检测阈值；样本被污染，RNA 酶将病毒RNA 降解，从而导致样本中病毒
量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性。
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