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PCR重难集训
题型一利用PCR获取目的基因
【典例1】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术
特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模
板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是( )
A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
题型二利用PCR鉴定目的基因的连接方式
【典例1】为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟
设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应
位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对
引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。
题型三利用PCR引导基因定点突变【典例1】重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代
表突变位点)。下列说法正确的是( )
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2
【典例2】水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重
叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第 47位
的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而
提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为 A－T，则需要让其突变为______________才能达
到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链
DNA)。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反
应系统和引物 3、引物 4 组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种
DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因
为
_____________________________________________________________________
____________________________________________。
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的 DNA片段拼接起来。有人
想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M 、M ，基因N
1 2
的 引 物 N 、 N 。 在 设 计 这 4 种 引 物 时 ， 特 别 要 注 意 的 问 题 是
1 2
_________________________________________________。
题型四利用PCR扩增未知基因序列
【典例1】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内 DNA复制类似(如图
所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误
的是( )
A．用PCR方法扩增目的基因时不需知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物 A 和引物 B 的 DNA 片段所占的比例为
15/16
【典例2】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的 EcoR Ⅰ 是一种________________酶，它通过识别特定的
________________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的 3′－羟基与5′－磷酸间形
成________________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；
Taq DNA聚合酶的作用是催化______________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR
引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
PCR引物
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
题型五利用PCR快速检测病原体
【典例1】荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其
原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。
当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接
收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测
荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列
相关叙述错误的是( )A．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
B．耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键
C．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关
D．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
【典例2】猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患
病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法
是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒 RNA，经________酶作用生成 cDNA；然后以
cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光 PCR 扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链
DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在
PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，
R发出的荧光可被检测到(如图1)。
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过
________________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检
测到的荧光强度与反应体系中 DNA分子数呈__________(填“正相关”或“反
相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
_____________________________________________________________________
__________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光
阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct 值就
____________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判
定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有
____________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
