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随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的 PCR技术逐步走进了高中实验室。PCR技术应
用广泛，如实时荧光定量RT-PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，
高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。各种PCR技术不是孤立的，
它们均已常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自的局限性，因此
在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR等。
在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解题步骤；一是
寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可能
得意图；二是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框架
进行完善。
命题点：PCR技术与病毒检测、基因定点突变与基因改造、基因编辑技术、同尾酶等。
一、PCR技术及其应用
1、PCR技术与病毒检测——实时荧光定量PCR(RT－PCR)
新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。先从样本中提取RNA，RNA
中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的
RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含
一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了
报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若
反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将
探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产
生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，
病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。（1）RT(reverse transcription)-PCR即反转录聚合酶链反应，是将RNA的反转录和cDNA的
聚合酶链式扩增 （PCR） 相结合的技术。
（2）优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。
2、重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对
片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，
获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基
因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水
蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替
换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。（1）PCR扩增过程
高温变性：温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链
低温复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
中温延伸：温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，
根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3、大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游
引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮 PCR利用突变上游引物和常规下游引
物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的 DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的
一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的 DNA片
段。（1）引物设计需要遵循以下原则：
①引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，过长会导致其延伸温度
大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
②引物序列在模板内应当没有相似性较高的序列，尤其是 3’端相似性较高的序列，否则容
易导致错配。
③引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为 A的错配效率明
显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
④引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
⑤引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。⑥ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
⑦引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且
降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
⑧ 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点。
4、反向PCR测定未知DNA区域
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两
端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用
限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶
将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两
侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列
为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对
已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得
以扩增出未知序列。
（1）PCR技术由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经PCR扩
增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火 (复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引
物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶
序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半保留
复制链二、同尾酶
同尾酶中，识别序列不同的限制酶，虽然识别的碱基序列不同，但是切开的黏性末端
的碱基却能够正好相互配对，在DNA连接酶的作用下能形成重组DNA分子，如：限制酶
BamHⅠ识别的碱基序列为—G↓GATCC—，限制酶BglⅡ识别的碱基序列为—A ↓GATCT
—，限制酶MboⅠ识别的碱基序列为—↓GATC—，限制酶BamHⅠ切开的DNA两条链的黏
性末端中没有被配对的碱基是GATC—，限制酶BglⅡ和限制酶MboⅠ切开的黏性末端未配
对的碱基也都是GATC—，因此也可以通过碱基互补配对的形式重组。
（1）定义：来源不同，识别的碱基序列也不相同，但能切割产生相同末端的限制酶叫同
尾酶。
（2）同尾酶识别的靶序列不相同，但能切割产生相同的黏性末端，因此也可以通过碱基
互补配对的形式重组。
三、启动子的类型
1、组成型启动子：在生物体的所有组织中都有活性的启动子。其调控不受外界条件的影响，
所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性。例如，在双子叶植物中最常用的组成
型启动子是花椰菜花病毒启动子、T7噬菌体启动子。
2、诱导型启动子：能被诱导表达的启动子。表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在
的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，
又可减少菌体蛋白酶对产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。常见的诱导型启动子有
Lac乳糖操纵子以及在此基础上衍生出的多种诱导型启动子。
3、组织热异性启动子：只有在特定的器官或组织中才能启动基因的表达，如神经细胞等组织
特异性启动子。
（1）启动子的作用：
①RNA聚合酶识别结合的位点，从而影响基因的表达
②通过改变启动子的序列，可以控制基因的表达模式，从而改变基因的功能
③启动子可用来改变基因组中某一特定基因的表达量
④启动子可以用来控制基因组中某一特定基因的表达量1、临床上常采用RT-PCR技术，对受测者咽拭子取样后进行新型冠状病毒核酸检测。RT-PCR
是指以病毒的RNA为模板合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。为定量测定样品中病毒
的核酸，常采用实时荧光PCR扩增技术，该技术原理如下图所示。在PCR反应体系中每加入
一对引物的同时，加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸
至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光信
号生成。CT值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。下列说法错
误的是（）
A．引物、荧光探针均具有特异性，通过氢键与cDNA中的目的基因特异性结合
B．荧光探针的水解发生在PCR过程中的延伸阶段
C．样本中初始病毒核酸量越多，CT值就越大
D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸
2、人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A
蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可
对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片
段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相
关信息如图所示。（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别
序列。据图可知，在 F ～F 末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列
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所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F ～F 与 R 扩增产
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物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7
7
与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F ～F 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含
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F ～F 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位
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置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，
理由是 。
3、反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列
两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5’-AACTATGCGCTCATGA-……-
GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列叙述错误的是（ ）
A．I酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端
B．II连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键
C．设计的两种引物分别是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’”
D．对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可能为“5'-
AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”
4、某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因
一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获
得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1
和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
5、不对称PCR技术是利用不等量的一对引物来
产生大量单链DNA（ssDNA）的方法，如图所示。
不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称
为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，
两者的比例通常为1/50〜1/100．PCR反应的最
初若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA
（dsDNA），在限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA．下列相关说法正确的是（
）
A．两种引物与模板链结合时，需将温度控制在72℃左右
B．PCR扩增时，在DNA解旋酶的作用下双链DNA解聚为单链
C．通过不对称PCR技术最后大量获得的ssDNA的碱基序列与图中甲链的相同
D．PCR扩增时，子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸
6、重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩
增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水
蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理见图。下列说法正确的是
（ ）
A．过程②的扩增缓冲溶液中一般要添加Mg2+
B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子
的复制后，一共会产生4种DNA分子
C．经过过程④获得的杂交DNA有2种,都可以经过过程⑤获得目的基因
D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸,需要引物
7、通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变如图
为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个
碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体
配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内
切酶a和限制性内切酶b的识别位点。有关叙述不正确的是（ ）
A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插
入B．一个DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子各不相同
C．第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4
8、新冠病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。
制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT-PCR（反转录酶聚合酶链式
反应）技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因（图1）→构建
基因表达载体（图2）→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。图3为利用
电泳技术对PCR的产物进行纯度鉴定，1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照组，
3号泳道为实验组。下列相关叙述错误的是（ ）
A．利用RT-PCR技术获取RBD蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶
B．利用PCR扩增含有限制酶切点的RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5
C．2号泳道是以（提纯的）RBD蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组
D．为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcoRI切割
9、（不定项）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）
编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常
剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚
乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究
人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物，对PCR扩增产物经AccI酶切后电泳。如图所示，已知引物1为5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′，AccⅠ酶的识别位点为
5′-GTATAC-3′，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列叙述不正确的是（
）
A．该实验中需设计的引物2为5′一TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3′
B．若电泳结果只能观察到530bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型
C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带
D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同
10、In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线
性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15-20bp），然后用In-Fusion酶处理即
可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端
含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用
下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题。
(1)过程①需要用到的酶是 。过程③中，同源序列1与同源序列2中的碱基序列不同，这样设计的好处是 。
(2)为保证扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依据 序列
进行设计。
(3)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的
抗性效果，在含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的培养基上分别接种等量的已转化大肠杆菌
并培养相同时间，然后采用 法进行计数，若结果较真实值偏小，原因是 。
(4)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion技术的优势有 。（至少答出两点）
11、金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，具有吸附重金属
的作用。科研人员将MT基因导入大肠杆菌构建工程菌，利用这一工程菌吸附工业废水中的重
金属。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，从 中提取mRNA，通过 法获得MTcDNA。MTcDNA的碱基
序列与细胞中MT基因的碱基序列 （填“相同”或“不同”）。
(2)为了提高工程菌MT蛋白的产量，将MT基因与外源表达增强元件连接（图甲表示引物对应
的位置）。
利用PCR检测连接是否成功，可选择的引物组合是 （填字母），该PCR反应体系中
需加入 酶。
A．①+③B．①+④C．③+②D．③+④
(3)将改造后的目的基因进行PCR扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E只有能产生黏性
末端的酶切位点。为了能够将MT基因与载体E相连，可以在上述引物的 （填
“5′”或“3′”）端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P将MT
基因接入载体E。（图乙表示载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列）后者具体操作步骤如下：
①选用 酶将载体P切开，再用DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体
P′。
②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载
体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接。为了提高获得重组质粒的
效率，除了考虑适宜的外界条件、目的基因的浓度外，还需考虑 （写出两点）。
(4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培养基筛
选出MT工程菌。
(5)通过检测发现MT基因已经成功导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属，可
能的原因是： 。
12、人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a链和
β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ也可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与
肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热
点，下图1为其制备的基本方案。(1)构建基因表达载体。图中获取hCGβ基因的方法属于. ，hCGβ基因需要与甲序列
一起构建形成融合基因，其目的是 。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某
序列相同时，在重组酶作用下发生同源切割，将目的基因直接插入。本方案中研究人员运用
同源切割的方式在hCGβ基因两端加上一组同源序列A、B，然后将hCGβ基因与线性质粒载
体混合后，在重组酶和DNA连接酶的作用下可形成环化质粒。这一过程与传统重组质粒构建
过程相比，无需使用的酶是 。
(2)扩增基因表达载体。阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有
的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
(3)鉴定基因表达载体。为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设
计相应的引物对融合基因进行PCR，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓
冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。电泳后得到
图2所示结果，据图可判断 号样品最符合要求。
(4)导入受体细胞。阶段IV时，需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要
添加以下哪些成分 （A．氨苄青霉素B．组氨酸C．无机盐D．琼脂），可在此培养基
上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。
(5)目的基因检测与鉴定。转化成功后的酵母菌菌株接种到液体培养基中，30℃恒温摇床上培养后获得培养物。将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经 处理后，再次离
心取上清液，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ
蛋白，则说明 。
(6)发酵罐生产。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优势在于
。
13、影响小鼠内耳形态的基因A突变会导致遗传性耳聋，研究人员尝试进行基因治疗。
(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统由sgRNA及Cas9蛋白组成。图1所示，sgRNA与目标DNA结合，
引导Cas9蛋白切割靶序列的双链DNA，导致 键断裂。
(2)同源重组是指在DNA断裂的情况下，含有同源区段的DNA之间发生的重组。科研人员尝试
利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗。
①利用 技术扩增野生型小鼠的基因A，再用图2中的限制酶 切割基因A与腺
病毒载体形成黏性末端，最后利用 酶进行拼接，构建腺病毒表达载体。科研人员尝
试利用该载体与耳聋小鼠的DNA进行同源重组，效果不佳。
②在上述基础上，科研人员又将sgRNA基因、Cas9基因接入了腺病毒表达载体（见图3），
同时引入sgRNA的识别序列，目的是 。图3所示的腺病毒表达载体还需要哪些必要
的结构或基因 （多选）。
A．启动子和终止子
B．RNA聚合酶基因
C．标记基因
D．起始密码子和终止密码子
E．反密码子
F．复制原点(3)将腺病毒表达载体注入耳聋小鼠的单侧耳组织细胞。为评估该治疗方案的效果，研究人员
使用同一只小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处
是可以排除 对实验结果的影响。
(4)进一步研究结果表明该方案可以有效纠正小鼠的突变基因，从而治疗小鼠的遗传性耳聋。
人体内基因A突变也会导致遗传性耳聋，欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注
。
