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PCR重难集训
题型一利用PCR获取目的基因
【典例1】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术
特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模
板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是( )
A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
答案 C
解析 据图分析可知，第一轮复制形成 2个DNA分子，即①②各一个，A正确；
第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即
得到①②③④各一个，B正确；第四轮复制得到 16个DNA分子，其中有8个
⑤(X基因)，C错误；经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，
③④各四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。
题型二利用PCR鉴定目的基因的连接方式
【典例1】为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟
设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应
位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对
引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。答案 乙、丙 目的基因反向连接
解析 分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。
如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50
＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反
向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行 PCR鉴定。如果目的
基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲
和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。
题型三利用PCR引导基因定点突变
【典例1】重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代
表突变位点)。下列说法正确的是( )
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2
答案 D解析 两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错
误；过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获
得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错
误；若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生 16个
突变基因共需要消耗 16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物 RP2的数量
为30÷2＝15(个)，D正确。
【典例2】水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重
叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第 47位
的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而
提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________
来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为 A－T，则需要让其突变为______________才能达
到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链
DNA)。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反
应系统和引物 3、引物 4 组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种
DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因
为___________________________________
_____________________________________________________________________
_________。
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的 DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M 、M ，基因N
1 2
的 引 物 N 、 N 。 在 设 计 这 4 种 引 物 时 ， 特 别 要 注 意 的 问 题 是
1 2
_________________________________________________。
答案 (1)改造基因(或基因定点突变) (2)T－A或C－G A或G (3)3 引物2
和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
(4)M 、M 中的一种引物与N 、N 中的一种引物必须具有互补配对的片段
1 2 1 2
解析 (2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，
对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖
氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制， 则会产生 3种不同的DNA分子，
因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸
PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要注意的是，需要找
到两种基因的重叠部分，即 M 、M 中的一种引物与N 、N 中的一种引物必须
1 2 1 2
具有互补配对的片段。
题型四利用PCR扩增未知基因序列
【典例1】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内 DNA复制类似(如图
所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误
的是( )
A．用PCR方法扩增目的基因时不需知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物 A 和引物 B 的 DNA 片段所占的比例为
15/16
答案 D
解析 复性的目的是使引物与模板DNA结合，故复性温度过高可能导致引物与模板DNA不能结合，因而使得PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；第四
轮循环共形成16个DNA分子，产物中同时含有引物 A和引物B的DNA片段
所占的比例为14/16＝7/8，D错误。
【典例2】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已
知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的 EcoR Ⅰ 是一种________________酶，它通过识别特定的
________________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的 3′－羟基与5′－磷酸间形
成________________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；
Taq DNA 聚 合 酶 的 作 用 是 催 化
___________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR
引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
PCR引物
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
答案 (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列
(2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④解析 (3)PCR过程中，根据已知的 DNA序列合成两个引物，要注意模板链和
引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生
碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向
相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，
向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二
条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是②。
题型五利用PCR快速检测病原体
【典例1】荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其
原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。
当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接
收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测
荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列
相关叙述错误的是( )
A．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
B．耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键
C．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关
D．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
答案 D
解析 Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D
错误。
【典例2】猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患
病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法
是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒 RNA，经________酶作用生成 cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光 PCR 扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链
DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在
PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，
R发出的荧光可被检测到(如图1)。
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过
________________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检
测到的荧光强度与反应体系中 DNA分子数呈__________(填“正相关”或“反
相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
_____________________________________________________________________
__________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光
阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct 值就
____________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判
定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有
____________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
答案 (1)逆转录 (2)①碱基互补配对 ②正相关 (3)①Taq DNA聚合酶活性
下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降 ②越小 ③阳性 (4)abc
解析 (1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。
(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过碱基互补配
对形成氢键而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化
子链的合成并水解探针。根据题干信息“荧光信号的累积与PCR产物数量完全
同步”可知，检测到的荧光强度与反应体系中 DNA 分子数呈正相关关系。
(3)①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底
物浓度降低导致的，也有可能是酶的活性缓慢下降导致的。②样本中初始模板
越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越少，Ct值就越小。
③Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图 2中荧光阈值大概是
36，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感
染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光
PCR检测阈值；样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒
量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性。
