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尖子生突破10 PCR 技术的应用
应用一：反向PCR 测定未知DNA 区域
当DNA 的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR 技术。原
理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA 连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得
了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA 分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异
性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。
应用二：PCR 定点突变技术
该技术要使用四条引物。其中引物2 和3 的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这
两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1 和2，引物3 和4 进行
PCR 后，得到的DNA 片段可以通过引物2 和3 互补的碱基杂交在一起，再在DNA 聚合酶的作用下延
伸，就能成为一条完整的DNA 片段。最后，用引物1 和4 进行扩增得到含有突变位点的DNA 片段。
通过测序可以检验定点突变是否成功。
应用三：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR)
先从样本中提取RNA，RNA 中可能有新冠病毒的RNA，
同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生
物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA 逆转录为cDNA，并
进行PCR 扩增，在PCR 反应体系中，包含一对特异性引物
以及一个Taqman 探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序
列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针
完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反
应体系存在靶序列，PCR 反应时探针与模板结合，DNA 聚
合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与
淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR 仪能够监
测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct 值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct 值越小
(如图)。
应用四：原位PCR
原位PCR 是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR 的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR 技术以
DNA 为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原
1
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位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定量定位分析。
一、单选题
1．反向PCR 流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA 序列设计合理的引物，扩增已知序列两端
的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5’-AACTATGCGCTCATGA-……-
GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列叙述错误的是（ ）
A．I 酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端
B．II 连接：使用DNA 连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键
C．设计的两种引物分别是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’”
D．对PCR 产物测序，经分析得到了片段F 的完整序列。该DNA 单链序列可能为“5'-
AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”
2．某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3 基因
一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得
Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2
用于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
2
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下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
3．不对称PCR 技术是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法，如图所示。
不对称PCR 中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，
两者的比例通常为1/50〜1/100．PCR 反应的最初若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA
（dsDNA），在限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA．下列相关说法正确的是（
）
A．两种引物与模板链结合时，需将温度控制在72℃左右
B．PCR 扩增时，在DNA 解旋酶的作用下双链DNA 解聚为单链
C．通过不对称PCR 技术最后大量获得的ssDNA 的碱基序列与图中甲链的相同
D．PCR 扩增时，子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸
3
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4．重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成重叠链，从而在随后的扩
增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素
基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理见图。下列说法正确的是（
）
A．过程②的扩增缓冲溶液中一般要添加Mg2+
B．若引物1、引物2 组成的反应系统和引物3、引物4 组成的反应系统中均进行一次DNA 分子的
复制后，一共会产生4 种DNA 分子
C．经过过程④获得的杂交DNA 有2 种,都可以经过过程⑤获得目的基因
D．过程⑤使用耐高温的DNA 聚合酶延伸,需要引物
5．通过引物设计运用PCR 技术可以实现目的基因的定点突变如图为基因工程中获取突变基因
的过程，其中引物1 序列中含有一个碱基T 不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的
整体配对，反应体系中引物1 和引物2 的5'端分别设计增加限制
性内切酶a 和限制性内切酶b 的识别位点。有关叙述不正确的是
（ ）
A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的
定向插入
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B．一个DNA 分子在第2 轮PCR 后，得到的四个DNA 分子各不相同
C．第2 轮PCR，引物1 与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D．在第3 轮PCR 结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA 占1/4
6．大引物PCR 定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅
需进行两轮PCR 即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR 扩增的大引
物，如图表示利用大引物PCR 对基因M 进行定点诱变。下列说法错误的是（ ）
A．第一轮PCR 中，至少需要2 个循环才能获得相应的大引物模板
B．第二轮PCR 所用的引物是第一轮PCR 的产物DNA 的两条链
C．扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
D．为了使两轮PCR 在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的退火温度
7．定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA 片段中引入所需变化（通常
有有利的），包括碱基对的增添、缺失和替换等．定点突变能迅速，高准备地提高DNA 所表达的
目的蛋白，从而影响生物性状，是基因研究工作中一种非常有用的手段．下列有关点突变的叙述
中不正确的是（ ）
A．点突变可以利用DNA 探针进行检测 B．点突变引起的变异类型属于基因突变
C．应用点突变技术可培育具有新性状的生物，形成新物种
D．应用点突变技术可以研究蛋白质结构与功能的关系
8．临床上常采用RT-PCR 技术，对受测者咽拭子取样后进行新型冠状病毒核酸检测。RT-PCR
是指以病毒的RNA 为模板合成cDNA，并对cDNA 进行PCR 扩增的过程。为定量测定样品中病毒的核
酸，常采用实时荧光PCR 扩增技术，该技术原理如下图所示。在PCR 反应体系中每加入一对引物
的同时，加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq DNA 聚合酶催化子链延伸至探针处，会
水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光信号生成。CT 值是指
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。下列说法错误的是（ ）
A．引物、荧光探针均具有特异性，通过氢键与cDNA 中的目的基因特异性结合
B．荧光探针的水解发生在PCR 过程中的延伸阶段 C．样本中初始病毒核酸量越多，CT 值就越
大
5
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D．Taq DNA 聚合酶催化DNA 的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸
9．新冠病毒包膜表面的S 蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2 受体并导致病毒入侵人体细胞。
制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT-PCR（反转录酶聚合酶链式反
应）技术扩增筛选RBD 蛋白（S 蛋白中真正与ACE2 结合的关键部分）基因（图1）→构建基因表
达载体（图2）→导入CHO 细胞并培养→提取并纯化RBD 蛋白→制成疫苗。图3 为利用电泳技术对
PCR 的产物进行纯度鉴定，1 号泳道为标准（Marker），2 号泳道为阳性对照组，3 号泳道为实验
组。下列相关叙述错误的是（ ）
A．利用RT-PCR 技术获取RBD 蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA 聚合酶
B．利用PCR 扩增含有限制酶切点的RBD 蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5
C．2 号泳道是以（提纯的）RBD 蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组
D．为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcoRI 切割
10．原位PCR 技术是利用原位PCR 仪，在组织或细胞中靶DNA 所在的位置上进行的PCR 循环扩
增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。进行扩增时，反应体系中的反
应成分需渗透到组织或细胞的靶DNA 处才能进行扩增。PCR 反应体系中需要添加一定浓度的
Mg2+，而组织细胞间的物质会吸附Mg2+，使进入细胞的Mg2+减少。下列说法正确的是（ ）
A．原位PCR 技术可用于人类β-地中海贫血致病基因的检测
B．原位PCR 反应体系中使用的Mg2+浓度要比常规PCR 低
C．反应体系中引物的G、C 碱基含量越高，其结合的特异性越强
D．反应体系中NTP 作为扩增的原料，会依次连接到子链的5'端
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二、多选题
11．稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链
淀粉合成酶。若Wx 基因中第226 位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中
直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合
成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx 基因该位点碱基是G 或T，研究人员以待测水稻叶片总
DNA 为材料，以Wx 基因片段设计引物，对PCR 扩增产物经AccI 酶切后电泳。如图所示，已知引物
1 为5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′，Acc Ⅰ酶的识别位点为5′-GTATAC-3′，两引物之间无另
外的AccI 酶的识别位点。下列叙述不正确的是（ ）
A．该实验中需设计的引物2 为5′一TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3′
B．若电泳结果只能观察到530bp 的DNA 条带，则表明该水稻品种为TT 型
C．GT 杂合型水稻品种酶切电泳结果为3 条条带
D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同
12．基因启动子中胞嘧啶甲基化与生物的表观遗传密切相关。甲基化特异性PCR（MSP）技术
是测定基因是否甲基化的常用方法，其主要原理及过程如下图。下列有关叙述正确的是（
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）
A．基因启动子中胞嘧啶甲基化造成基因碱基序列的改变
B．MSP 过程中应根据亚硫酸钠处理前后的碱基序列设计两对引物
C．PCR 过程中甲基化组的退火温度比非甲基化组的高
D．PCR 完成后，可采用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计对MSP 产物进行鉴定分析
三、综合题
13．纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作
用机制具有重要意义，请回答下列问题。
(1)细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是
。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进
行了PCR 扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的
DNA 分离出来，溶液中添加NaCl 至2.0mol/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在
催化下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有
绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图I 所示载体质粒Y，构建Y-M
重组质粒（在BcoRV 位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中
融合片段M 中有白色的箭头，代表方
向）
①选择图Ⅱ引物 ；②PCR 目的产物
约为 bp
确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连
接处上游含有HindIII+EcoRV 的识别序
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选
填序列编号）
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列，下游含有EcoRV+BamHI 的识别序列
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M
分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而
实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
14．In-Fusion 技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性
化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序列，通常为15-20bp），然后用In-Fusion 酶处理即可实现
无缝连接。它的操作步骤大致为：①利用PCR 技术将质粒线性化；②PCR 扩增出两端含线性化质
粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion 酶作用下形成重组质粒；
④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题。
(1)过程①需要用到的酶是 。过程③中，同源序列1 与同源序列2 中的碱基序列不同，
这样设计的好处是 。
(2)为保证扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因，引物A 或引物B 要依据 序列
进行设计。
(3)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的
抗性效果，在含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的培养基上分别接种等量的已转化大肠杆菌并培
养相同时间，然后采用 法进行计数，若结果较真实值偏小，原因是 。
(4)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion 技术的优势有 。（至少答出两点）
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