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尖子生突破13 CRISPR/Cas9 技术和电泳图谱分析
应用一—CRISPR/Cas9 技术
1．CRISPR/Cas9 技术敲除掉部分基因原理
(1)CRISPR/Cas9 是细菌的一种后天免疫防御机制——CRISPR 序列示意图如下(其中，菱形框表示
高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列)，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源
质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。
(2)病毒或外源质粒上存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”
的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为
PAM(原间隔序列临近基序)。
(3)当病毒或外源质粒DNA 首次入侵到细菌体内时，
细菌会对外源DNA 潜在的PAM 序列进行扫描识别，
将临近PAM 的序列作为候选的“原间隔序列”，将其
整合到细菌基因组上CRISPR 序列中的两个“重复序
列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。
(4) 当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导
CRISPR 序列的表达。同时，在CRISPR 序列附近还有
一组保守的蛋白编码基因，称为Cas 基因。CRISPR 序
列的转录产物CRISPR RNA 和Cas 基因的表达产物等
一起合作，通过对PAM 序列的识别，以及“间隔序
列”与外源DNA 的碱基互补配对，来找到外源DNA
上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实
现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。
2．CRISPR/Cas9 技术的运用和发展
(1)具体运用如下图所示，在待敲除基因的上下游各设
计一条向导RNA(指导RNA)，将其与含有Cas9 蛋白
编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA 通过碱基
互补配对可以靶向PAM 附近的目标序列，Cas9 蛋白
会使该基因上下游的DNA 双链断裂。对于DNA 双链
的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA 损伤修
复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，
1
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从而实现了细胞中目标基因的敲除。
(2)CRISPR/Cas9 基因魔剪：当研究人员要用基因魔剪来编辑一个基因组时，他们会人工构建一个
指导RNA，它与将要被切割的DNA 代码相匹配。魔剪蛋白Cas9 与指导RNA 形成复合物，将魔
剪带到基因组中将要进行切割的地方。
(3)原始的CRISPR/Cas9 会由于RNA 定位偏差而出现脱靶效应，现在通过改进，可以大幅降低脱
靶效应。同时还发现了一些新的系统，除了最开始的Cas9，后面又找到了Cas12 的一系列酶，机
理上有一定不同，但还是用以切割DNA；还有Cas13 则用于切割RNA。基于Cas12 和Cas13 的开
发以及机制研究，又发展出了新的工具用于快速检测病毒，效率可以达到几分钟检测一个样品，
并且用到了现在的新冠病毒检测中。
应用二—电泳图谱分析
电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定的pH
条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。在分析核酸、蛋白质等生物
大分子时，电泳是一个非常有效的手段。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，
此时移动的速度可因电离子大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区
别各种大小不同的分子。
琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等
电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中(pH 约8.5)，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。
线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA 分子量对数成反比，分子越大则所
受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
一、单选题
1．2020 年诺贝尔化学奖授予了两位女科学家以表彰她们在基因编辑研究领域做出的卓越贡献。
这两位科学家巧用CRISPR/Cas9 基因剪刀，以极高的精度编辑了动物、植物和微生物的DNA．
CRISPR/Cas9 基因组编辑系统工作原理如图所示，关于此技术的解释错误的是（ ）
A．Cas9 为一种能使磷酸二酯键断裂的酶
B．DNA-RNA 杂交区域不存在T-A 碱基对
C．在单链引导RNA 中也存在碱基互补配对
D．人为改变引导RNA 的序列可实现对特定基因的切
割
2
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【答案】B
【详解】A、分析题意可知，Cas9 蛋白功能类似于基因工程中限制酶的作用，Cas9 能够切割
DNA，是一种能使磷酸二酯键断裂的酶，A 正确；
B、DNA 分子的碱基组成是A、T、G、C，RNA 的碱基组成是A、U、G、C，故DNA-RNA 杂交区域存在
T-A 碱基对，B 错误；
C、据图可知，向导RNA 有折叠成双链的片段，故在单链引导RNA 中也存在碱基互补配对，C 正确；
D、向导RNA 能识别并结合特定的DNA 序列，所以人为改变向导RNA 的序列可实现对特定基因的切
割，D 正确。
2．下图1 是某单基因遗传病的遗传系谱图，在人群中的患病率为1/8100，科研人员提取了四名
女性的DNA，用PCR 扩增了与此基因相关的片段，并对产物酶切后进行电泳（正常基因含有一个
限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点）。结果如图2，相关叙述正确的是（ ）
A．该病为X 染色体上的隐性遗传病 B．Ⅱ-1 与Ⅱ-2 婚配生一个患病男孩的概率是1/8
C．该突变基因新增的酶切位点位于310bp 中
D．如果用PCR 扩增Ⅱ-2 与此基因相关的片段，酶切后电泳将产生2 种条带
【答案】C
【详解】A、Ⅰ-1 和Ⅰ-2 表现正常，但生下了Ⅱ-2 的患病女性，所以该病是常染色体隐性遗传病，
A 错误；
B、该病在人群中的患病率为1/8100，则致病基因频率为1/90，正常基因频率为89/90，根据基
因平衡定律，Ⅱ-1 的基因型为89/91AA、2/91Aa，其与Ⅱ-2Aa 婚配生一个患病男孩的概率为
2/91×1/4=1/182，B 错误；
C、结合图2 可知，正常基因酶切后可形成长度为310bp 和118bp 的两种DNA 片段，而基因突变酶
切后可形成长度为217bp、93bp 和118bp 的三种DNA 片段，这说明突变基因新增的酶切位点位于
长度为310bp（217+93）的DNA 片段中，C 正确；
D、基因突变酶切后可形成长度为217bp、93bp 和118bp 的三种DNA 片段，Ⅱ-2 基因型是aa，只
含有突变基因，所以酶切后电泳将产生三种条带，D 错误。
3．用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA 片段，酶切位点及酶切产物分离结
3
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果如图。下列关于电泳技术叙述错误的是（ ）
A．电泳是指带电的分子在电场的作用下发生迁移的过
程
B．泳道①、②分别是用Xho Ⅰ、Sal Ⅰ处理得到的产物
C．若用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种酶同时处理该DNA 片段后电
泳，其泳道可能只有5 个条带
D．电泳技术可以用于亲子鉴定、生物间亲缘关系鉴定
【答案】B
【详解】A、电泳是指带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程，A 正确；
B、限制酶Sal Ⅰ有三处切割位点，切割后产生4 个DNA 片段，泳道①中是用Sal Ⅰ处理得到的酶
切产物，限制酶Xho Ⅰ有2 处切割位点，切割后产生3 个DNA 片段，泳道②中是用Xho Ⅰ处理得到
的酶切产物，B 错误；
C、限制酶Sal Ⅰ有三处切割位点，切割后产生4 个DNA 片段，限制酶Xho Ⅰ有2 处切割位点，切
割后产生3 个DNA 片段，结合题图可知，若用XhoI 和SalI 两种酶同时处理该DNA 片段后电泳，可
能存在相同长度的DNA 片段，其泳道可能只有5 条，C 正确；
D、不同生物的DNA 切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关
系的鉴定，D 正确。
4．下列关于凝胶电泳实验操作，叙述错误的是（ ）
A．加样孔应靠近负极端，以便带负电的DNA 分子向正极移动
B．接通电源后电泳一段时间，离加样孔越近的DNA 分子越小
C．紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度与DNA 含量正相关
D．通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳
【答案】B
【详解】A、靠近加样孔的一端为负极，接通电源，带负电的DNA 分子向正极移动而使不同DNA 逐
渐分离，A 正确；
B、相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA 片段相对分子质量越大，迁移就越慢，
分子量越小，迁移速度越快，电泳一段时间，离加样孔越近的DNA 分子迁移越慢，分子量越大，B
错误；
4
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C、为了便于对分离后的DNA 片段进行检测，在凝胶制备中加入核酸染料，能够与DNA 分子结合发
荧光，DNA 含量越多，荧光强度越强，即凝胶上条带的荧光强度与DNA 含量正相关，C 正确；
D、点样时应在样品中加入指示剂，根据指示剂泳动的位置判断是否停止电泳，D 正确。
5．美国纽约大学朗格尼健康中心日前实施了一台特殊的肾移植手术，医生成功将一头转基因猪
（通过基因编辑技术敲除α-Gal 基因）的肾脏移植到人体，且随后3 天里均未发生排异现象，病
人体内的一些指标也降至正常水平。CRISPR/Cas9 系统是目前最常用的一种基因编辑工具，该系
统由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白组成，由SgRNA 引导Cas9 蛋白在特定的基因位点进行切割完
成基因编辑过程，其原理如图所示。下列相关叙述中，错误的是（ ）
A．通常选择受精卵作为受体细胞，是因为受精卵体积大容易操作
B．将Cas9-SgRNA 复合体注入受体细胞的常用方法是显微注射法
C．推测Cas9 蛋白与限制性核酸内切酶具有相似的功能
D．转基因猪的培育过程还需要用到胚胎移植等现代生物技术
【答案】A
【详解】A、由于受精卵的全能性高，因此基因工程中常选用受精卵作为外源基因的受体细胞，A
错误；
B、结合题意可知，本操作中的受体细胞为受精卵，将Cas9-SgRNA 复合体注入受精卵细胞的常用
方法是显微注射法，B 正确；
C、结合题意“由SgRNA 引导Cas9 蛋白在特定的基因位点进行切割来完成基因的编辑过程”可知，
该基因编辑工具中对基因进行剪切的是Cas9 蛋白，即Cas9 蛋白与限制性核酸内切酶具有相似的
功能，C 正确；
D、转基因猪的肾脏需要移植到人体中起作用，故在此之前还需要用到胚胎移植等现代生物技术，
D 正确。
6．基因编辑技术CRISPR/Cas9 系统包括两个组分：一个是人工合成的短链RNA（sgRNA）和一个
来自细菌的核酸酶Cas9。sgRNA 与目的基因中希望被编辑的DNA 序列相结合，然后Cas9 切割该
DNA 序列，使DNA 双链断裂，此时向细胞中加入大量可用于修复的模板DNA，细胞就会以这些片段
为模板合成DNA，从而使特定的碱基序列被引入基因组中、下列说法错误的是（ ）
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A．Cas9 决定了基因编辑的位点和基因编辑的效率
B．基因编辑技术可以破坏某个基因使其失去功能
C．基因突变是不定向的而基因编辑能定向改变基因
D．Cas9 类似限制酶能够使双链DNA 中的磷酸二酯键断裂
【答案】A
【详解】A、由题干可知，Cas9 只能切割与sgRNA 结合的DNA 序列，所以决定基因编辑位点的是
sgRNA，而不是Cas9，A 错误；
B、基因编辑技术可以修改特定基因的碱基排列顺序，因此可以通过去除启动子等方式使得某个基
因无法进行表达，B 正确；
C、基因突变具有不定向性，而基因编辑技术可以对特定基因进行特定的修改，是定向改变，C 对；
D、Cas9 和限制酶一样，都可以切割DNA，使得DNA 双链断裂，说明二者都能使得DNA 中的磷酸二
酯键断裂，D 正确。
7．CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，
在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9
基因编辑技术的工作原理如图所示，下列分析正确的是（ ）
A．构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子上游
B．SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后，其功能类似于DNA 聚合酶
C．根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标DNA 的定点切割
D．CRISPR/Cas9 识别目标DNA 序列主要与Cas9 蛋白的特异性相关
【答案】C
【详解】A、构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子下游，便于转录产生
SgRNA，A 错误。
B、SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后，可切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因，其功能类
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似于限制酶，B 错误；
C、SgRNA 可以特异性切割DNA 位点，根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标DNA 的定点
切割，C 正确；
D、CRISPR/Cas9 识别目标DNA 序列主要与SgRNA 编码序列有关，D 错误；
8．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引导Cas9 蛋白
到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白相当于限制酶，切割特定基因位
点的脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，
合成的原料包括四种核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA
错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA 序
列越短，脱靶率越低
D．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和不同的sgRNA 进行基因编辑
【答案】D
【详解】A、Cas9 蛋白切割特定基因位点，相当于限制酶，作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二
酯键，A 错误；
B、向导RNA 是以DNA 的一条链为模板通过转录形成的，可以在RNA 聚合酶的催化下合成，合成的
原料包括四种核糖核苷酸，B 错误；
C、CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA 的序列越短，
可识别的DNA 上的特定碱基序列越短，越容易发生脱靶现象，即脱靶率越高，C 错误；
D、在对不同目标DNA 进行编辑时，应使用Cas9 蛋白和“不同”的sgRNA 结合进而实现对不同基
因的编辑，D 正确。
9．亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与
8 号染色体的~880 kb 至~903 kb 区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠
引物进行PCR，扩增后电泳结果如图所示，下列说法错误的是（ ）
A．提取该突变体和野生型亚洲棉的8 号染色体上的DNA
进行PCR
B．图中PCR 产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行
的
C．据图分析可知，相对分子质量较大的扩增产物与点
样处的距离较近
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D．该突变体出现的根本原因是引物6 对应区间发生了碱基对的替换
【答案】D
【详解】A、由于8 号染色体的~880 kb 至~903 kb 区间与突变体的光籽表型相关，故提取突变体
和野生型的8 号染色体上的DNA 进行PCR 扩增，A 正确；
BC、图中PCR 产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，相对分子质量较大的扩增产物迁移速
率较慢，与点样处的距离较近，B、C 正确；
D、根据题图分析，野生型和突变体经引物6 扩增的产物不同，其中突变体的相应扩增产物较大，
故可推知8 号染色体上的引物6 对应的区间发生碱基对的增添是该突变体光籽性状出现的根本原
因，D 错误。
10．神经性耳聋、腓骨肌萎缩症是两种单基因遗传病，分别由B、b 和D、d 基因控制。图1 为某
家族遗传系谱图，其中已死亡个体无法知道其性状，经检测Ⅳ21 不携带上述致病基因。为了确定
腓骨肌萎缩症基因在染色体上的位置，科研人员对Ⅲ9～Ⅲ13 个体的该基因扩增后用某种限制酶
处理并进行电泳，结果如图2。下列相关叙述错误的是（ ）
A．神经性耳聋为常染色体隐性遗传病 B．腓骨肌萎缩症基因位于X 染色体上
C．Ⅲ10 个体的基因型为BbXDXd D．V22 与V23 婚配，后代中表型正常男孩的概率是5/32
【答案】D
【详解】A、Ⅲ9 和Ⅲ10 都不患神经性耳聋，他们的女儿Ⅳ16 患有神经性耳聋，该病是隐性基因
控制，且该致病基因位于常染色体上，A 正确；
B、据图2，正常健康男女电泳结果是第1、4 条带谱，第2、3 条带谱是致病基因带谱，若控制该
病的基因是显性基因，假设位于常染色体上，Ⅲ12 的基因型是DD，其父亲Ⅱ6 基因型是dd，不
合题意；假设位于X 染色体上，符合题意。若控制该病的基因是隐性基因，Ⅲ10 的基因型是dd
或XdXd，不合图2 带谱分布，故腓骨肌萎缩症基因位于X 染色体上且是显性基因致病，B 正确；
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C、Ⅲ10 个体的基因型为B_XDX-，其女儿Ⅳ16 患有神经性耳聋（bb），Ⅲ10 个体的基因型为
BbXDX-，其父亲Ⅱ6 基因型是XdY，则Ⅲ10 个体的基因型为BbXDXd ，C 正确；
D、V22 的基因型是B_XdY，其母亲Ⅳ16 的基因型是bb，则V22 的基因型是BbXdY，V23 的基因型
是B_XDX-，Ⅲ14 患神经性耳聋（bb），Ⅳ20 的基因型是BbXDY，Ⅳ21 不携带上述致病基因，基
因型是BBXdXd，则V23 的基因型是1/2BBXDXd、1/2BbXDXd，则V22 与V23 婚配，子代第一对基因
型是3/8BB、1/2Bb、1/8bb，子代第二对基因型是1/4XDXd、1/4XdXd、1/4XDY、1/4XdY，后代中
表型正常男孩的概率是7/8×1/4=7/32 ，D 错误。
二、多选题
11．用限制性内切核酸酶EcoR I、Not I 单独或联合剪切同一个DNA 分子，获得的DNA 片段电泳
结果如图所示，最左边为DNA Marker（1kb=1000 碱基对）。下列叙述正确的是（ ）
A．该DNA 分子的大小为10kb
B．该DNA 分子上至少有3 个酶切位点
C．Not I 单独剪切后的产物与该DNA 分子电泳时的迁移速
率不相同
D．可以确定该DNA 分子上EcoR I、Not I 切割位点的相
对位置
【答案】ABC
【详解】AB、EcoR I 单独切割后获得6kb 和4kb 片段，Not I 切割后获得10kb 的片段，假设该
DNA 分子是一个线状DNA 分子，则其长度应为10kb，且其上不存在Not I 的切割位点，但EcoR
I、Not I 联合切割后获得6kb、3kb、1kb 的片段，说明该DNA 分子上存在Not I 的切割位点，故
该DNA 分子为环状，长度为10kb，其上有2 个EcoR I 酶切位点和1 个Not I 酶切位点，AB 正确；
C、Not I 单独剪切后的产物为10kb 的线状DNA，与10kb 的环状DNA 电泳时的迁移速率（影响因
素：分子大小、形状、所带电荷等）不相同，C 正确；
D、该DNA 分子上EcoR I、Not I 切割位点的相对位置有两种，D 错误。
12．细菌抵御噬菌体的机理如下图所示∶当某些细菌第一次被特定的噬菌体感染后，细菌 Cas2
基因开始表达出 Cas2（一种限制酶），Cas2 会随机低效切断入侵的噬菌体DNA，并将切下的
DNA 片段插入 CRISPR 位点。当再次遭到同种噬菌体入侵时，细菌转录产生的crRNA 便会将另一种
限制酶（如 Cas9）准确带到入侵者 DNA 处，并将之切断。下列叙述错误的是（ ）
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A．Cas2 切下1 个DNA 片段的过程中，只需破坏2 个磷酸二酯键
B．切下的 DNA 片段插入CRISPR 位点后，会随着细菌DNA 的复制而复制
C．Cas9 借助 crRNA 识别外来噬菌体身份最可能是依靠碱基互补配对来实现
D．上图中 crRNA 的模板链最初来源于噬菌体 DNA，其翻译的产物是Cas9
【答案】AD
【详解】A、Cas2 切下1 个DNA 片段的过程中，需要切割DNA 片段的两侧，而DNA 是双链结构，共
破坏4 个磷酸二酯键，A 错误；
B、切下的 DNA 片段插入CRISPR 位点，相当于基因重组，会随着细菌DNA 的复制而复制，B 正确；
C、由图可知：当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR 位点转录产生的crRNA 便会将另一种核
酸内切酶准确带到入侵者DNA 处，涉及RNA 与DNA 的结合，与mRNA 与DNA 模板链的结合的机理类
似，利用的是碱基互补配对的原则，C 正确；
D、对比两图可知，crRNA 是由切下的噬菌体DNA 片段插入CRISPR 位点后转录形成的，其模板链最
初来源于噬菌体 DNA，但其翻译产物不是Cas9，Cas9 是由细菌基因组中Cas9 基因转录翻译形成
的，D 错误。
三、综合题
13．CRISPR/Cas9 基因编辑技术能够高效剪切、更改基因中的遗传信息。其基本原理是利用单链
向导RNA（sgRNA）引导Cas9 蛋白切割特定的基因位点，以达到敲除基因或插入新基因的目的。
回答下列问题：
(1)sgRNA 作为向导，其碱基序列应该与靶基因的碱基序列 ，Cas9 蛋白相当于
酶。sgRNA 序列长度不能过短，否则容易出现“脱靶”（与其他基因片段结合），推测“脱靶”
最可能的原因是 。
(2)进行基因编辑需构建CRISPR/Cas9 重组质粒，将重组质粒导入经 处理的大肠杆菌细
胞。要将目的基因整合到重组质粒中需确保两者具有相同的 。
(3)在分子水平上判断靶基因是否已从某生物的基因组DNA 上成功敲除，可采用的方法是
，请简述该操作方法及该方法的判断依据： 。
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【答案】(1) 互补配对 限制 sgRNA 序列长度越短，其序列的特异性越低，越容易
与其他基因片段结合，从而导致“脱靶”(2) Ca2+ 黏性末端
(3) DNA 分子杂交 将靶基因制成DNA 分子探针，与基因组DNA 杂交；若没有显示杂交带，
就表明靶基因已经被敲除
【详解】（1）据题可知，RNA（sgRNA）能引导Cas9 蛋白切割特定的基因位点，该引导过程依赖
于其碱基序列应该与靶基因的碱基序列互补配对；Cas9 蛋白能切割特定的基因位点，相当于限制
酶；sgRNA 序列长度越短，其序列的特异性越低，越容易与其他基因片段结合，从而导致“脱
靶”。
（2）将目的基因导入微生物细胞时，需要用钙离子处理微生物细胞，使其处于易于吸收环境中
DNA 分子的感受态；要将目的基因整合到重组质粒中需确保两者具有相同的黏性末端，便于用DNA
连接酶进行连接。
（3）在分子水平上判断靶基因是否已从某生物的基因组DNA 上成功敲除，可采用的方法是DNA 分
子杂交技术，通过观察是否有杂交带出现进行判断：将靶基因制成DNA 分子探针，与基因组DNA
杂交；若没有显示杂交带，就表明靶基因已经被敲除。
14．为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1 所示。
请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中
最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
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A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。
这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R
进行了PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有
。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 引物 (2)CD
(3)限制性核酸内切酶（限制酶） (4)ABC (5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序
列
【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进
行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、
引物。PCR 过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设
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计是决定PCR 反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-
GACGAG-3'能与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-
CTGCAG-3'能与EGFP 中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同
的黏性末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质
粒载体混合后，在DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制
酶）。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数
可能低于30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为
菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的
单菌落无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R
进行了PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基
序列，因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
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