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热点微练22 PCR技术的应用（尖子生特训）
（时间：10分钟）
1（. 2022·河北保定调研）穿梭载体是一类具有两种不同复制原点、能在两种不同的
生物体（物种不同）中复制的载体，一般在原核生物和真核生物中都能复制和表达，
如Ti质粒和哺乳动物表达质粒pMT2。回答下列问题。
（1）用PCR技术从基因文库中获取并扩增目的基因时，需要加入人工合成的
作为引物；PCR反应体系中需加入的原料是______________________________。
（2）若要构建一个穿梭质粒，使其能够在大肠杆菌中大量复制，且能在哺乳动物
细胞中表达，质粒上除含启动子、终止子、多个限制酶酶切位点和标记基因外，还
需要有 的复制原点。
（3）如图为某种哺乳动物穿梭质粒示意图，现欲使用该质粒表达人生长激素，但人
生长激素基因所在的DNA片段上不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的人
生长激素基因定向插入该质粒，扩增的人生长激素基因两端设计的序列应含有
（填图中的限制酶名称）的切割位点。
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生物学（配人教版）Q 新教材（琼津京…）\\F304.TIF" \* MERGEFORMATINET
注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同
（4）将该穿梭质粒、目的基因混合后形成的重组质粒与感受态的大肠杆菌细胞混
合，完成转化过程，再从培养的大肠杆菌细胞中提取质粒，可获得大量该质粒。在
含卡那霉素的培养基中能够生长的大肠杆菌细胞中 （填“一定”或“不
一定”）含有目的基因，原因是_____________________________________。
答案 （1）一小段单链DNA 4种脱氧核苷酸 （2）大肠杆菌和哺乳动物细胞
（3）Nde Ⅰ和BamH Ⅰ （4）不一定 若大肠杆菌细胞中导入的是未携带目的基
因的（穿梭）质粒，大肠杆菌细胞也能在含卡那霉素的培养基中生长（合理即可）解析 （1）在PCR反应体系中，需加入一小段已知目的基因的核苷酸序列，以便
根据这一序列合成引物；需加入四种脱氧核苷酸作为合成DNA的原料。
（2）基因表达载体的组成成分包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基
因等。穿梭载体具有两种不同复制原点，要构建一个能够在大肠杆菌中大量复制，
且能在哺乳动物细胞中表达的穿梭质粒，需要加入大肠杆菌和哺乳动物细胞的复
制原点。（3）如果在哺乳动物的穿梭质粒中插入人生长激素基因，基因表达载体中
目的基因的上游为启动子，下游为终止子。题图中启动子和终止子之间有限制酶
Nde Ⅰ、Xba Ⅰ、BamH Ⅰ的识别序列，但是，终止子下游，还有一段限制酶Xba Ⅰ
的识别序列，所以为使PCR扩增的人生长激素基因定向插入该质粒，扩增的人生
长激素基因两端设计的序列应含有Nde Ⅰ和BamH Ⅰ的切割位点。
（4）导入大肠杆菌细胞的有可能是没有携带目的基因的穿梭质粒，该穿梭质粒上
含有卡那霉素抗性基因，导入未携带目的基因的穿梭质粒的大肠杆菌也可在含有
卡那霉素的培养基中生长，所以在含卡那霉素的培养基中能够生长的大肠杆菌细
胞中不一定含有目的基因。
2（. 2022·山东烟台调研）如图为转基因抗病毒马铃薯培育过程图，请据图回答有关
问题：
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（1）PCR技术利用的基本原理是 。
利用该技术扩增目标DNA片段（子链的延伸方向从5′－端→3′－端），应选择图中
的引物 （填字母）与模板DNA结合。
（2）PCR体系经过n次循环可使DNA数量得到约2n倍的扩增。若反应体系加入m
个靶DNA，经3次循环后图中所示目标DNA片段所占的比例为 。
（3）在构建基因表达载体时，常用两种不同的限制酶切割目的基因和质料，获得不
同的黏性末端，其主要目的是 。
（4）重组细胞经过G、H过程成功培育出了转基因抗病毒马铃薯植株，此过程涉及
的细胞工程技术是 ，该技术广泛应用于 、 等
育种过程。（5）研究表明，转基因植物可以通过花粉将外源基因扩散到其他植物，从而对生态
环境造成潜在的危害。因此，科学家设法将目的基因整合到受体细胞的
（填“细胞核”或“叶绿体”）基因组中，以防止目的基因通过花粉向其
他植物扩散。
答案 （1）DNA半保留复制 B和E （2） （3）防止目的基因和质粒自身环化
及反向连接 （4）植物组织培养技术 基因工程育种 单倍体育种
（5）叶绿体
解析 （1）PCR技术扩增目的基因的原理是DNA半保留复制。引物是一小段单链
DNA，引物5′－端的碱基可以与DNA两条链的3′－端的碱基进行碱基互补配对，
可作为DNA复制的起始点。子链的延伸方向从5′－端→3′－端，DNA聚合酶从引
物的3′－端开始延伸DNA链。因此要扩增目的基因，应选用图中的B和E作为引
物。（2）PCR体系经过n次循环可使DNA数量得到约2n倍的扩增，则m个靶DNA
经3次循环得到8m个DNA分子，目标DNA片段所占的比例为＝。（5）花粉中含
有精子，几乎不含细胞质，而受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，所以科学家
设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中，以防止目的基因通过花粉向
其他植物扩散。
3（. 2022·四川大数据统一监测）如图是利用转基因技术生产干扰素的简化流程。回
答下列问题：
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（1）进行Ⅰ过程的前提是要根据干扰素基因的 设计引物。
（2）Ⅰ过程需加热至90 ℃以上，然后冷却至50 ℃左右，如此操作的目的是
。据图可知，欲获得干扰素基因，至少需要复制 次。
（3）图中A的名称是 ，A上与RNA聚合酶识别和结合的部位称为
。
（ 4 ） 为 检 测 干 扰 素 基 因 在 酵 母 菌 细 胞 中 是 否 转 录 ， 可 用
作探针，与从细胞中提取的 进行分子杂交。答案 （1）一小段核苷酸序列 （2）使DNA解链，然后使引物结合到互补DNA
链上 3 （3）重组质粒 启动子 （4）放射性同位素、生物素或荧光染料等标记
的干扰素（目的）基因 mRNA
解析 （1）进行PCR的前提条件是要有一小段已知目的基因的核苷酸序列，以便
合成一对引物，因此进行Ⅰ过程的前提是要根据干扰素基因的一小段核苷酸序列
设计引物。（2）PCR过程中需加热至90 ℃以上，目的是使DNA双链解旋，然后冷
却至50 ℃左右，目的是使引物结合到互补DNA链上。根据PCR复制的特点，结
合图示可知，图示中干扰素基因的两条链均应是第二次复制才能形成的子链，所
以至少需要复制三次才能形成图中的干扰素基因。（3）图中A是干扰素基因和质
粒连接形成的重组质粒（或基因表达载体），A上与RNA聚合酶识别和结合的部
位称为启动子。（4）基因转录的产物包括mRNA，由于转录过程中遵循碱基互补配
对原则，因此为检测干扰素基因在酵母菌细胞中是否转录，可用放射性同位素、生
物素或荧光染料等标记的干扰素（目的）基因作探针，与从细胞中提取的mRNA
进行分子杂交。
4.（2021·山东青岛一模）2020年诺贝尔化学奖授予两位在CRISPR/Cas9系统编辑
技术方面做出了突出贡献的女科学家。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序
列的简称，Cas9指CRISPR相关蛋白9，是进行DNA切割的酶的名字。CRISPR/
Cas9具有切割其他类型细胞中DNA序列的潜力，可对生物的DNA序列进行修剪
切断、替换或添加。它作为基因组“编辑器”在全球数千个实验室中得到广泛应
用。如图是某实验室将编辑好的人胰岛素基因导入大肠杆菌时所用的载体质粒。
请回答问题：
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甲
（1）研究发现CRISPR/Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，推测该系统在细菌细胞
内的作用是 。
（2）Cas9在基因编辑过程中所起的作用是 ，编辑后的基因应该
插 入 甲 载 体 的 位 点 ， 甲 载 体 中 的 荧 光 素 酶 基 因 的 作 用 是
_____________________________________________________。（3）在基因工程过程中可利用PCR技术对编辑后的目的基因进行大量扩增，它利
用的是 的原理，扩增时通常需要在引物的 －端添加相应的酶切
位点，1个DNA分子经过n轮扩增，理论上至少需要的引物数量为 。
答案 （1）切割外源DNA，保护自身 （2）断裂磷酸二酯键 2 鉴别受体细胞中
是否含有目的基因，将含有目的基因的受体细胞筛选出来 （3）DNA半保留复制
5′ 2n＋1－2
解析 （1）CRISPR/Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，具有切割其他类型细胞中
DNA序列的潜力，推测该系统在细菌细胞内的作用是切割外源DNA，保护自身。
（2）Cas9可以切开DNA序列，相当于限制酶的作用，断开磷酸二酯键；编辑后的
基因插入质粒时应在启动子和终止子之间，且不能破坏标记基因序列，即位点2。
荧光素酶基因是标记基因，便于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，将含有目的
基因的受体细胞筛选出来。（3）PCR技术原理是DNA的半保留复制，DNA复制时，
新链延伸的方向是从5′－端到3′－端，因此要在5′－端加上酶切位点。DNA复制
时，每个DNA的两条模板链需要两种不同的引物，由此可知，进行n次DNA复制，
第一次需要2个，第二次需要4个，第三次需要8个……第n次需要2n个，则一共
需要（2＋4＋8＋…＋2n）＝（2n＋1－2）个。
