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应用1：反向PCR测定未知DNA区域
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向 PCR技
术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，
这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一
对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩
增出未知序列。
应用2：PCR定点突变技术
该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，
而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3
和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA
聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的 DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到
含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
应用3：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR)
先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组
织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进
行PCR扩增， 在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为
一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报
告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板
结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发
出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到
达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。
跟踪训练
1．如图所示，在一段未知序列的突变体 DNA片段中，插入了已知序列的 T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是( )
A．用引物①和引物④直接进行 PCR 扩增之后再测序
B．用引物②和引物③直接进行 PCR 扩增之后再测序
C．用 DNA 连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR 扩增后测序
D．用 DNA 连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR 扩增后测序
2．重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后
的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技
术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错
误的是( )
A．过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合
酶等
B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA
分子的复制后，一共会产生2种DNA分子
C．经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因
D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物
3．(2023·北京顺义区高三检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生
插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是
研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入
______________________________；图甲所示的基因定点突变技术需要________次PCR；
获得产物A需要的引物是____________。
(2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B
进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为
______________，基因M1的长度为____________。
项目 基因M A B
长度 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05
(3)通过图甲过程获得的基因M1仍需要大量扩增，此时选择的引物是______________，为了
与图乙中的Ti质粒相连，还需要分别在它们的______端引入限制酶___________的识别序列。
(4)构建基因表达载体时，M1 基因必需插入到 Ti 质粒的______________中，原因是
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
4．(2023·河北唐山一中高三模拟)“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2 h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT—PCR技术中的一种常
用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出
的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使
探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与
PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题：
(1)结合图1和图2分析，“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有______酶、
_____________________酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子层面
的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的____________、
______________有关。
(2) 根 据 Taqman 探 针 功 能 分 析 ， 探 针 中 碱 基 序 列 的 设 计 应 主 要 依 据
__________________________。新冠病毒是冠状病毒大家庭中新的一员，其碱基序列与引起
SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计
Taqman探针时应筛选出该病毒特有的序列，以避免______________(填“假阴性”或“假阳
性”)的出现。
(3)根据图1和图2，Taq DNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能_______________。
(4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度
(Rn)主要与______________、______________有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反
应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，
一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧
光扩增曲线图(如图3)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中________________等有
限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。(5)虽然荧光RT—PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，
通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有______(填字母)。
a．通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足
b．在样本运输、检测中出现了损坏和污染
c．病毒相应关键序列发生了基因突变
