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第18 讲 基因工程
目录
01 题型突破练
【题型一】基因工程的基本工具
【题型二】基因工程的基本操作程序
【题型三】PCR 技术及其应用
【题型四】蛋白质工程的原理和应用
02 重难创新练
03 真题实战练
题型一 基因工程的基本工具
1．[经典题]质粒是基因工程最常用的运载体，下列有关质粒的说法，错误的是（ ）
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为运载体时，应具有标记基因和一至多个限制酶切割位点
C．质粒为小型环状DNA 分子，存在于拟核（区）外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存。并在宿主细胞内复制
【答案】A
【解析】质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子，
病毒中没有，A 错误；质粒作为运载体应具有标记基因以便于目的基因的检测，有一个或多个限制酶切点
以便于和目的基因拼接，B 正确；质粒为小型环状DNA 分子，主要存在于细菌拟核外的细胞质中，C 正确；
质粒能够避免宿主细胞的酶切，从而稳定保存，并能够在宿主细胞内自主复制，D 正确。
2．在基因工程操作中限制酶是不可缺少的工具。下列关于限制酶的叙述错误的是（ ）
A．限制酶主要是从原核细胞中获取的
B．每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列
C．限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的氢键
D．同一种限制酶切割不同的DNA 分子可产生碱基互补配对的黏性末端
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【答案】C
【解析】限制酶主要从原核细胞中分离纯化而来，A 正确；限制酶具有特异性，每一种限制酶只能识别双
链DNA 分子中特定的核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，B 正确；限制酶的作用位点是相邻核苷酸之
间的磷酸二酯键，C 错误；同一种限制酶切割不同的DNA 分子产生的黏性末端相同，因此产生的黏性末端
能够进行碱基互补配对，D 正确。
3．[经典题]下表为4 种限制酶的识别序列和切割位点(↓表示切割位点),下列叙述正确的是（ ）
限制酶1
—↓GATC—
限制酶2
—CATG↓—
限制酶3
—G↓GATCC—
限制酶4
—GG↓CGCC—
A．在使用限制酶的同时还需要解旋酶
B．限制酶1 和3 切割DNA 分子产生的黏性末端相同
C．图中限制酶的识别序列都由4 个核苷酸组成
D．限制酶4 作用后产生的是平末端
【答案】B
【解析】限制酶能识别双链DNA 的特定核苷酸序列并在特定位点进行切割，在使用限制酶时，不需要解旋
酶，A 错误；限制酶1 和3 切割DNA 分子，产生的黏性末端相同，均为GATC，B 正确；限制酶3 和4 识别的
序列分别是-GGATCC-和-GGCGCC-，均由6 个核苷酸组成，C 错误；限制酶4 切割后产生的是黏性末端，D 错
误。
4．[改编题]某DNA 分子大小为4kb，用限制酶Ⅰ和Ⅱ进行充分酶切，酶切结果如图所示。下列叙述错误的
是（ ）
A．该DNA 分子含有两个游离的磷酸基团
B．DNA 分子上有1 个酶Ⅰ的切割位点，3 个酶Ⅱ的切割位点
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C．限制酶切割的化学键是磷酸二酯键
D．酶Ⅰ和酶Ⅱ的识别序列一定不同，但可能产生相同的黏性末端
【答案】A
【解析】某DNA 分子大小为4kb，用限制酶Ⅰ充分酶切后，只有4kb 的条带，说明该DNA 分子是环状DNA，
不含游离的磷酸基团，A 错误；从电泳图看，酶Ⅰ单独切割得到一条4kb 条带，说明DNA 分子上有1 个酶Ⅰ
的切割位点，酶Ⅱ单独切割得到2kb、1.5kb、0.5kb 三条条带，说明DNA 分子上有3 个酶Ⅱ的切割位点，B
正确；限制酶能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之
间的磷酸二酯键断裂，C 正确；从电泳图看，限制酶Ⅰ和Ⅱ同时进行充分酶切，产生四条条带，说明酶Ⅰ
和酶Ⅱ的识别序列一定不同，但有可能产生相同的黏性末端，D 正确。
5．[经典题]以下是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA 分子后形成的部分片段。下列有关叙述，正确的是
（ ）
A．以上DNA 片段是由5 种限制酶切割后产生的，切割产生①片段的限制酶识别序列由5 个碱基对构成
B．限制酶只存在于原核生物，作用的化学键为磷酸二酯键和氢键
C．上述能进行连接的两个黏性片段，其连接后形成的DNA 分子是
D．两个③片段只能被EcoliDNA 连接酶催化连接形成重组DNA
【答案】C
【解析】图中①④是同一种限制酶切割形成的，因此以上DNA 片段是由4 种限制酶切割后产生的，切割产
生①片段的限制酶，识别的碱基序列为-CTGCAG-，由6 个碱基对构成，A 错误；限制酶主要是从原核细胞
中分离纯化出来的，作用的化学键为磷酸二酯键，B 错误；图中①④具有相同的黏性末端，可被DNA 连接
酶连接形成DNA 分子是
，C 正确；两个③片段属于平末端，只能被T4 DNA 连接酶催化
连接形成重组 DNA，D 错误。
题型二 基因工程的基本操作程序
6．[新情境]将具有抗肿瘤作用的细胞因子IFNγ 基因连接到Egr-1 基因启动子上后，利用Egr-1 基因启动
子的放射诱导性，在X 射线等电离辐射诱导下，启动Egr-1 基因启动子，进而诱导与其连接的IFNγ 基因
表达。这样在肿瘤部位可以通过射线和IFNγ 的双重作用杀伤肿瘤细胞。图示为重组质粒的构建过程，下
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列叙述正确的是（ ）
A．重组质粒上的Egr-1 基因启动子可以被肿瘤细胞核糖体识别
B．通过PCR 扩增cDNA 进行30 轮时，共需要消耗的引物数量为230个
C．将外源IFNγ 基因送入到肿瘤细胞的载体还可以是动物的病毒
D．T4DNA 连接酶能连接质粒和IFNγ 基因双链之间的氢键和磷酸二酯键
【答案】C
【解析】启动子驱动遗传信息转录，是RNA 聚合酶识别和结合的位点，A 错误；PCR 扩增cDNA 进行30 轮时，
产生了230个产物，每条新合成的链都要消耗一个引物，但产物中有两条起始的模板链不含引物，故共需要
消耗的引物数量为
个，B 错误；在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物
病毒等，故将外源IFNγ 基因送入到肿瘤细胞的载体还可以是动物的病毒，C 正确；T4DNA 连接酶连接质粒
和IFNγ 基因间的磷酸二酯键，D 错误。
7．[经典题]将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又
保持了目的基因表达产物的活性，因此可通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关叙述错
误的是（ ）
A．荧光蛋白可以用于检测目的基因表达产物在植物体内的转移和分布情况
B．将荧光蛋白基因转入叶绿体中可防止其逃逸到亲缘关系较近的植物体内
C．连接荧光蛋白基因和目的基因时，通常用同种限制酶对二者进行切割
D．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在质粒中的不同启动子后面
【答案】D
【解析】荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物具有荧光蛋白的特性，可以通过
检测荧光强度来检测目的基因表达产物的转移和分布情况，A 正确；将荧光蛋白基因转入叶绿体中可防止
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其逃逸到亲缘关系较近的植物体内，因为细胞质基因一般不会进入到花粉内，进而可以避免基因污染，B
正确；
使用同种限制酶切割荧光蛋白基因和目的基因，可以形成相同的末端，以便连接，C 正确；需要将荧光蛋
白基因和目的基因连接在相同的启动子后面，进而可以保证目的基因和荧光蛋白基因都能进行表达，D 错
误。
8．[改编题]某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两
个抗性基因：A 是抗链霉素基因，B 是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B 中，且大肠杆菌本身不
带有任何抗性基因。下列叙述正确的是（ ）
A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件
C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长
D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求
【答案】D
【解析】导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A 错误；抗生素抗性基因是标记基因，
是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，与目的基因表达无关，
B 错误；由于目的基因要插入到基因B 中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，即工程菌不能抗氨苄青霉素，因
此成功导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，C 错误；能在含链霉素的培养基中
生长的大肠杆菌可能含有重组质粒或普通质粒，因此不一定符合生产要求，D 正确。
9．某基因表达载体构建过程中，需将目的基因1 和目的基因2 按照下图所示导入整合区域。用四种产生的
黏性末端各不相同的限制酶将目的基因1 和目的基因2 切割，先后插入ZS 质粒时，最佳的限制酶使用方案
是（ ）
A．①③
B．①④
C．②③
D．②④
【答案】D
【解析】若使用①③或①④，目的基因1 两端都是酶1 切割产生的黏性末端，当将目的基因1 和目的基因2
先后插入ZS 质粒时，目的基因1 会因为两端黏性末端相同而反向插入，AB 错误；②中目的基因1 一端是酶
1 切割产生的黏性末端，另一端是酶2 切割产生的黏性末端；③中目的基因2 一端是酶1 切割产生的黏性末
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端，另一端是酶4 切割产生的黏性末端。 这样将目的基因2 插入ZS 质粒时，可能会将目的基因1 切除，C
错误；若使用②④，目的基因1 两端分别是酶1 和酶2 切割产生的黏性末端，目的基因2 两端分别是酶3
和酶4 酶4 切割产生的黏性末端。 用不同的酶切割产生不同的黏性末端，这样在将目的基因1 和目的基因
2 先后插入ZS 质粒时，目的基因不会反向插入，所以该方案可行，D 正确。
10．由于PCR 扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P 将目的基
因接入载体E，下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（ ）
A．选择 EcoRV 或SmaI 对载体P 进行酶切，再用T4DNA 连接酶连接目的基因和载体P
B．为防止载体E 自身环化，可选用Xho Ⅰ和 Pst Ⅰ对重组载体 P 和载体 E 进行酶切
C．载体E 中的a 是终止密码子序列，其作用是使转录在所需要的地方停下来
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体 E 成功导入受体细胞
【答案】B
【解析】由于载体E 只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P 接入载体E，同时防止载体E 自身环化，
需要用两种限制酶分别切割载体E 和中间载体P，据图可知，中间载体P 和载体E 均含有XhoI 和PstI 酶识
别序列，故可选用XhoI 和PstI 酶进行酶切，载体P 的这两种酶识别序列中含有EcoRV 识别位点，并且其
切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI 酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于
XhoI 和PstI 酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P 进行切割，连接平末端只能用T4DNA 连接酶，A
错误，B 正确；载体E 中的a 是终止子序列，C 错误；无论重组载体E 是否构建成功，只要载体E 导入了受
体细胞都能表现出抗性基因的相应性状，D 错误。
题型三 PCR 技术及其应用
11．[新情境]RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）成cDNA（与mRNA 互补的DNA 单链）和聚合酶链式反应（PCR）
相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
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A．过程Ⅰ获得cDNA 的过程与DNA 复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B 两种引物在72°C 时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，则共需要加入引物的数量为63 个
【答案】D
【解析】过程I 是逆转录过程，是以mRNA 为模板合成cDNA，该过程的碱基配对方式为A-T、U-A、G-C、C-
G，而DNA 复制过程的碱基配对方式为A-T、T-A、G-C、C-G，二者碱基配对方式不完全相同，A 错误；引物
是通过碱基互补配对结合到模板链上的，该过程是在复性阶段完成的，复性的温度一般为55-60°C，而不
是72°C，72°C 是延伸阶段的温度，B 错误；图中子链的合成是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，从引物的
一端开始进行合成，C 错误；过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，最终产生的DNA 单链数为26=64（条），新合成
的子链数为63 条，则进行6 轮循环，共需要加入引物的数量为63 个，D 正确。
12．PCR 技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称
为引物的Tm 值。下列叙述正确的是（ ）
A．引物与模板链的结合属于延伸过程
B．变性过程的温度一般要低于复性过程
C．复性过程的温度应设置为略低于Tm 值
D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合
【答案】C
【解析】PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，引物与模板链的结合
属于复性过程，A 错误；变性过程的温度一般要高于复性过程，变性的目的是使DNA 解旋成为单链，B 错误；
题意显示，引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm 值，复性过程的温度应设置为略低于
Tm 值，否则会导致解螺旋发生，C 正确；引物的 Tm 值越接近，引物之间越不容易结合，因为该温度下氢
键不容易形成，D 错误。
13．[新情境]双脱氧测序法是第一代DNA 测序方法。在4 支试管中分别加入4 种dNTP 和少量的1 种ddNTP
进行PCR，再把PCR 产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比
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较某疾病患者与对照个体DNA 模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP 是PCR 的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP 四种；在DNA
聚合酶作用下，ddNTP 与dNTP 竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延
伸终止；若配对的为dATP，继续延伸。
A．上述PCR 反应体系中模板链需要足够多
B．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T
C．5'－TAGTGCCCATC－3'为对照个体的一段序列
D．沿电泳方向，核苷酸链长
度逐渐减小
【答案】C
【解析】在进行序列时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性。如果模板DNA 量不足，
可能会导致测序结果不准确或无法进行，A 正确；患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，对照个体的测序
结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C 突变
为T，B 正确；依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA 片段）的3'终端的碱基，如
+ddATP 的泳道中出现的条带（DNA 片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止
点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA 序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，
即对应的DNA 片段为长→短，则对应的DNA 测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为
+ddCTP 泳道组的条带，则说明该DNA 片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-
CTACCCGTGAT-3'，C 错误；
电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，故据图可知沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小，D 正确。
14．关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．PCR 体系中G-C 碱基对含量将影响使DNA 解链的所需温度
B．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
C．扩增得到的PCR 产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
D．待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA 跑出凝胶
【答案】D
【解析】G-C 碱基对含有3 个氢键，目的基因中G-C 碱基对含量越多，使DNA 解链的所需温度越高，因此
PCR 体系中G-C 碱基对含量将影响使DNA 解链的所需温度，A 正确；PCR 实验使用到的器具和试剂如微量离
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心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，避免对实验结果产生影响，B 正确；将扩增得到
的PCR 产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，以防样品
飘散，C 正确；待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，D 错误。
15．Sanger 测序是一种用于确定DNA 序列的经典方法。核心原理是在DNA 复制过程中引入一种特殊的化学
物质——ddNTP 来中断DNA 链的延伸。遵循碱基互补配对原则，ddNTP 与dNTP 均能结合在延伸的子链上，
当ddNTP 结合在子链上时，DNA 合成终止。对得到的长短不一的DNA 片段进行凝胶电泳，即可确定序列信
息。其过程如下图所示，下列说法错误的是（ ）
A．离心管中除加入图中所示物质外，还需加入耐高温的DNA 聚合酶、含Mg2+
B．ddNTP 掺入子链导致DNA 合成终止的原因是其3'端无-OH，无法形成磷酸二酯键
C．根据电泳结果可知待测序列为5'-CGTGACGCTA-3'
D．dNTP 既可以作为DNA 复制的原料，也可为DNA 复制提供能量
【答案】C
【解析】PCR 的原理是体外DNA 复制，故离心管中应加入DNA 聚合酶。PCR 利用高温解旋，故加入的应是耐
高温的DNA 聚合酶，真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要 Mg2+激活。因此，PCR 反应缓冲液中一般要添加
Mg2+，A 正确；据图可知，ddNTP3'端无-OH，ddNTP 掺入子链导致 3'端无法与核苷酸的磷酸反应形成磷酸
二酯键，从而导致DNA 合成终止，B 正确；电泳时，长链移动慢，离进样孔近，短链移动快，离进样孔远。
结合图示可知，引物后面的序列为：5'-CGTGACGCTA-3'，故待测序列为3'-GCACTGCGAT-5'，C 错误；据图
可知，dNTP 含两个高能键，这两个键水解后释放大量能量，供DNA 复制用。dNTP 水解后所得核苷酸中作为
DNA 复制的原料，D 正确。
题型四 蛋白质工程的原理和应用
16．[新情境]人工智能（AI）技术通过大数据分析、机器学习、深度学习等方法，为生物医药研究、药物
开发、临床诊断和治疗等带来革命性的变化。下列关于AI 技术在生物医药领域的应用，下列叙述错误的是
（ ）
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A．AI 技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，且基因序列中不包含启动
子和终止子
B．AI 技术通过智能穿戴设备和移动应用程序可实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相
应的诊断和治疗建议
C．AI 技术对大量的基因组数据进行处理和分析，可以识别疾病相关的基因突变，为精准医疗提供支
持
D．AI 技术对大量的蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，
该过程属于蛋白质工程技术
【答案】D
【解析】密码子具有简并性，故AI 技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，启
动子和终止子为非编码区，由氨基酸序列推理的基因序列中不包含启动子和终止子，A 正确；利用AI 技术，
通过智能穿戴设备和移动应用程序，能够实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相应的诊断和
治疗建议，AI 技术为临床诊断和治疗等方面带来了革命性的变化，B 正确；AI 技术在基因组数据处理和分
析中的应用，通过识别疾病相关的基因突变，为精准医疗的实现提供了强大的技术支持，C 正确；蛋白质
工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白
质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用AI 技术设计新药物，没有对现有蛋白质进行改造，或制造一种
新的蛋白质，不属于蛋白质工程技术，D 错误。
17．科学家利用现代生物技术将小鼠单克隆抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上，获得的人鼠嵌
合抗体引起的免疫副作用显著降低。制备人鼠嵌合抗体需要从根本上改造（ ）
A．小鼠单克隆抗体
B．抗体合成基因
C．人体特异性抗体
D．编码抗体的mRNA
【答案】B
【解析】对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规
律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，
以满足人类生产和生活的需求。人鼠嵌合抗体是自然界不存在的蛋白质，制备的方法主要是蛋白质工程，
蛋白质工程从根本上就是改造或合成目的基因。ACD 没有涉及基因层面，ACD 错误，B 正确。
18．天然β 淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β 淀粉酶的第476 位天冬氨酸替
换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
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C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β 淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β 淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
【答案】B
【解析】蛋白质工程生产的是自然界中不存在的蛋白质，而不是自然界已有的蛋白质，A 错误；蛋白质工
程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，因为蛋白质的结构决定其功能，所以
要先预期功能再设计结构，B 正确；由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能有多种密码子对应，所以
根据中心法则推断出的新的天然β 淀粉酶的脱氧核苷酸序列不是唯一的，C 错误；蛋白质工程是在分子层
次上进行的，但它不是对天然β 淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造，而是通过对基因的改造来实现对蛋白
质的改造，D 错误。
19．AlphaFold 是一个人工智能程序，它能通过深度学习技术来预测蛋白质的三维结构。 经过多轮的预测
和调整后，AlphaFold 最终生成一个高精度的三维模型。 用AlphaFold 研究蛋白质时不需要人为提供
（ ）
A．氨基酸的种类
B．氨基酸的排列顺序
C．氨基酸的数量
D．氨基酸的组成元素
【答案】D
【解析】蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸种
类、数量、序列→找到并改变相应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→目的基因转录形成mRNA→mRNA 翻译
形成多肽链→多肽链折叠形成具有三维结构的蛋白质→行使特定的生物功能，故用AlphaFold 研究蛋白质
时需要人为提供氨基酸的种类、数量、排列顺序，不需要人为提供氨基酸的组成元素，D 不符合题意。
20．[新情境]控制合成凝血因子Ⅷ的基因主要在肝脏中表达，A 型血友病是凝血因子Ⅷ基因发生突变，导致
凝血因子Ⅷ含量降低或功能异常所致。研究人员发现，用丝氨酸替换凝血因子第309 位的丙氨酸，可以增
加凝血因子Ⅷ的分泌量，从而达到基因治疗的目的。下列相关说法错误的是（ ）
A．对凝血因子Ⅷ的改造属于蛋白质工程，需要在分子水平对基因进行操作
B．基因工程和上述改造工程的相同点之一是均只能生产自然界存在的蛋白质
C．进行基因治疗时需要将改造后的凝血因子Ⅷ基因构建的表达载体导入患者肝细胞中
D．通过选择肝脏特异性启动子，可以实现凝血因子Ⅷ基因只在肝细胞中特异性表达
【答案】B
【解析】分析题意，用丝氨酸替换凝血因子第309 位的丙氨酸，可以增加凝血因子Ⅷ的分泌量，由此可知
对凝血因子Ⅷ的改造属于蛋白质工程，需要在分子水平对基因进行操作，A 正确；对凝血因子Ⅷ的改造属
于蛋白质工程，该工程能生产自然界不存在的蛋白质，B 错误；分析题意，控制合成凝血因子Ⅷ的基因主
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要在肝脏中表达，由此可知进行基因治疗时需要将改造后的凝血因子Ⅷ基因构建的表达载体导入患者肝细
胞中，C 正确；选择肝细胞特异性的启动子，可使凝血因子Ⅷ基因表达严格限于肝细胞，D 正确。
1．（2025·云南曲靖·一模）酒精是高中生物学实验中常用的化学试剂，在不同实验中可能有不同的作
用，下列叙述正确的是（ ）
A．“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，酒精只能用来冲洗卡诺氏液
B．“绿叶中色素的提取和分离”实验中可用95%的酒精直接提取色素
C．“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，可用95%的酒精初步分离DNA 和蛋白质
D．“检测生物组织中的脂肪”实验中，常用50%的酒精使组织细胞相互分离
【答案】C
【解析】在“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，酒精有两个作用，一是用卡诺氏液固定细胞
形态后，用体积分数为95%的酒精冲洗2 次，冲洗卡诺氏液；二是在解离步骤中，使用质量分数15%的盐酸
和体积分数95%的酒精1:1 混合制成解离液进行解离，所以酒精不只是用来冲洗卡诺氏液，A 错误；“绿叶
中色素的提取和分离”实验中，若用95%的酒精提取色素，需要加入适量的无水碳酸钠，以除去酒精中的
水分，才能提取色素，不能直接用95%的酒精提取，应该用无水乙醇直接提取色素，B 错误；“DNA 的粗提
取与鉴定”实验中，DNA 不溶于95%的酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精，所以可用95%的冷却酒精初步分
离DNA 和蛋白质，C 正确；“检测生物组织中的脂肪”实验中，常用50%的酒精洗去浮色，而不是使组织细
胞相互分离，D 错误。
2．（2025·福建厦门·一模）RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）成cDNA（与mRNA 互补的DNA 单链）和聚合酶
链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
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A．过程Ⅰ获得cDNA 的过程与DNA 复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B 两种引物在72°C 时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，则共需要加入引物的数量为63 个
【答案】D
【解析】过程I 是逆转录过程，是以mRNA 为模板合成cDNA，该过程的碱基配对方式为A-T、U-A、G-C、C-
G，而DNA 复制过程的碱基配对方式为A-T、T-A、G-C、C-G，二者碱基配对方式不完全相同，A 错误；引物
是通过碱基互补配对结合到模板链上的，该过程是在复性阶段完成的，复性的温度一般为55-60°C，而不
是72°C，72°C 是延伸阶段的温度，B 错误；图中子链的合成是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，从引物的
一端开始进行合成，C 错误；过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，最终产生的DNA 单链数为26=64（条），新合成
的子链数为63 条，则进行6 轮循环，共需要加入引物的数量为63 个，D 正确。
3．（2025·广东深圳·一模）为探究DNA 片段P 与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P 不同位点的
突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。
下列分析正确的是（ ）
注：“－”表示未添加，“+”表示添加，指示探针的浓度很低
A．条带1 越宽说明O2蛋白与待测物的结合越强
B．显示条带2 就说明O2蛋白与P 无法结合
C．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合
D．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同
【答案】C
【解析】泳道2 与泳道1 相比较，条带2 变窄，条带2 变宽，说明O2蛋白与指示探针结合，二者结合的越
多，条带1 就会越宽，条带2 就会越窄，由于无荧光标记的蛋白P 和突变体（M1、M2、M3）会竞争指示探针
与O2蛋白结合，从而使条带2 变宽，条带1 变窄，且突变体与O2蛋白的结合能力越强，条带1 会越窄，条
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带2 越宽，所以显示的条带2 的宽度说明了O2蛋白与P 的结合能力，而并不是说，显示条带2 就说明O2蛋
白与P 无法结合，AB 错误；M1的电泳条带与片段P 的电泳条带大体一致，说明了M1的突变位点几乎不影响
O2蛋白的结合，C 正确；M2和M3的电泳条带不同，说明其与O2蛋白的结合强度不同，D 错误。
4．（2025·湖北武汉·一模）PCR 技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成
的杂合分子的解链温度称为引物的Tm 值。下列叙述正确的是（ ）
A．引物与模板链的结合属于延伸过程
B．变性过程的温度一般要低于复性过程
C．复性过程的温度应设置为略低于Tm 值
D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合
【答案】C
【解析】PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，引物与模板链的结合
属于复性过程，A 错误；变性过程的温度一般要高于复性过程，变性的目的是使DNA 解旋成为单链，B 错误；
题意显示，引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm 值，复性过程的温度应设置为略低于
Tm 值，否则会导致解螺旋发生，C 正确；引物的 Tm 值越接近，引物之间越不容易结合，因为该温度下氢
键不容易形成，D 错误。
5．（2025·山东菏泽·一模）肝脏是生物实验中的常见材料。下列关于肝脏操作处理与目的不相符的是
（ ）
A．在离心后肝脏研磨液的上清液中加入等量冷却的酒精溶液——粗提取DNA
B．向2mL 过氧化氢溶液中滴入2 滴肝脏研磨液——检测过氧化氢酶的催化效率
C．在25mL 肝匀浆中滴入5 滴HCl 溶液后测pH——比较不同pH 下酶的活性
D．在2mL 鲜肝提取液中先后加入双缩脲试剂A 液1mL 和B 液4 滴——检测蛋白质
【答案】C
【解析】由于DNA 不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质等杂质溶于酒精，因此在离心后肝脏研磨液的
上清液中加入等量冷却的酒精溶液可以粗提取DNA，A 不符合题意；肝脏研磨液中含有过氧化氢酶，向2mL
过氧化氢溶液中滴入2 滴肝脏研磨液，可以检测过氧化氢酶的催化效率，B 不符合题意；在25mL 肝匀浆中
滴入5 滴HCl 溶液后测pH，只能测定该PH 条件下酶的活性，而不能比较不同PH 下酶的活性，C 符合题意；
鲜肝提取液中含有蛋白质，蛋白质的检测试剂是双缩脲试剂，因此在2mL 鲜肝提取液中注入1mL 双缩脲试
剂A 液后滴入双缩脲试剂B 液可以检测蛋白质，D 不符合题意。
6．（2025·四川巴中·一模）科学家发现一未知DNA 分子，该DNA 分子存在多种限制酶切位点。研究人员
利用三种限制酶对该DNA 分子进行不同的酶切处理，将处理后的DNA 片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图
所示。据图推断，下列选项最可能为该DNA 分子原始图谱的是（ ）
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A．
B．
C．
D．
【答案】D
【解析】由选项A 的图可以看出，只有BglII，XhoI 的酶切位点，不符合题意，A 错误；由选项B 图可以看
出，用HindIII 切割产生的是6Kb 和8Kb，不符合题意，B 错误；由选项C 图可以看出，无HindIII 的酶切
位点，C 错误； 由选项D 图可以看出，被XhoI 切割后产生了一个2Kb 和14Kb 的片段，被BglII 切割后产
生了一个6Kb 和10Kb 的片段，被HindIII 切割后产生了一个16Kb 的片段，XhoI+HindIII 切割，产生一个
2Kb 和6Kb 和8Kb 的片段，D 正确。
7．（2025·新疆·一模）cDNA 文库是利用某一生物体特定发育时期细胞内的mRNA 为模板，合成互补单链
cDNA，再以单链cDNA 为模板合成双链cDNA，将这些双链cDNA 片段插入到适当的载体中，再转入宿主细胞
所构建的文库。从cDNA 文库中可筛选出所需要的目的基因片段。下列叙述不合理的是（ ）
A．构建cDNA 文库过程中需使用逆转录酶、限制酶和DNA 聚合酶
B．从不同组织细胞中提取的mRNA 建立的cDNA 文库不完全相同
C．通过定向改变cDNA 序列进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程
D．从cDNA 文库中筛选出的目的基因与真核生物中的原基因相同
【答案】D
【解析】mRNA 为模板合成cDNA 单链的过程需要逆转录酶；将双链cDNA 片段插入到适当的载体时，需要用
限制酶切割载体和cDNA，使它们产生相同的黏性末端或平末端，再用DNA 连接酶连接；以单链cDNA 为模
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板合成双链cDNA 的过程需要DNA 聚合酶，A 正确；由于基因的选择性表达，不同组织细胞中表达的基因不
完全相同，即转录出的mRNA 不完全相同，所以从不同组织细胞中提取的mRNA 建立的cDNA 文库也不完全相
同，B 正确；蛋白质工程的基本途径是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨
基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因），通过定向改变cDNA 序列进而改造蛋白质结构属于蛋白
质工程的范畴，C 正确；cDNA 文库中的基因是由mRNA 逆转录形成的，由于真核生物基因中含有内含子，而
转录形成的mRNA 中不含内含子对应的序列，所以从cDNA 文库中筛选出的目的基因与真核生物中的原基因
不相同，原基因中含有内含子序列，而cDNA 中没有，D 错误。
8．（2025·陕西西安·一模）下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”和“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验的
叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA 时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA 时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
【答案】A
【解析】在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象有关。凝胶的浓度越大，DNA
分子越大，DNA 分子的迁移速率越慢，DNA 构象也影响迁移速率，A 正确；鉴定DNA 时，应先将丝状物溶解
在2mol/L 的NaCI 溶液中，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴，B 错误；选用植物细胞提取DNA 时，研磨后用
纱布进行过滤，C 错误；DNA 分子带负电荷，在电场的作用下，向着与它所带电荷相反的电极移动，故琼脂
糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的负极，D 错误。
9．（2025·河北·一模）科学家为了探究光呼吸的关键基因——羟基丙酮酸还原酶编码基因(NbHPRI 基
因) 的表达模式，通过PCR 扩增的手段克隆得到NbHPRI 基因5'端上游的启动子序列。通过构建融合表达
载体并进行农杆菌遗传转化，获得NbHPRI 启动子驱动的GUS 基因的转基因材料。染色结果表明，在本氏烟
草的上胚轴、叶中均检测到GUS 信号，其中叶片的表达量较高。用到的质粒如图所示，质粒的相关信息如
表。回答下列问题：
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启动子
无
复制子
pVS1 oriV、ori
终止子
NOS terminator
质粒大小
10657 bp
原核抗性
KanR(卡那霉素抗性)
真核抗性
HygR(潮霉素抗性)
(1)研究表明，光呼吸的其中一个作用在于它可以消耗过剩的NADPH 和ATP， 据此推测，光照
(填“过强”或“过弱”)时容易发生光呼吸。
(2)启动子的作用是 ，本实验中PCR 扩增时要根据 设计引物。
(3)构建基因的表达载体时，需要将启动子连接在GUS 基因的 端，科学家利用限制性内切核酸酶
PstI、EcoRI 对pCAMBIA1391 进行双酶切，其优点有 。
(4)GUS 基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因，以X-Gluc 作为反应底物，可将X-Gluc 水解生成蓝色产物，所以
GUS 基因属于表达载体中的 ，在分子水平，检测GUS 的方法为 。
(5)利用农杆菌转化植物的原理是 ，可用 基因烟草。
【答案】(1)过强
(2)作为RNA 聚合酶识别并结合的位点，启动转录NbHPRI 基因5'端上游的启动子 序列
(3)5' 不同的限制酶产生不同的黏性末端，避免目的基因和载体自身环化，同时也能确 保它们以正确的
方向连接
(4) 标记基因 抗原—抗体杂交法
(5)农杆菌的T-DNA 可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA 中 潮霉素
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【解析】（1）NADPH 和ATP 是光反应的产物，所以当光反应过强时，产生的NADPH 和ATP 过剩，此时光呼
吸容易发生。
（2）启动子是RNA 聚合酶识别并结合的位点，可启动基因的转录。本实验是为了探究NbHPRI 基因5'端上
游的启动子的功能，所以需要根据NbHPRI 基因5'端上游的启动子序列设计引物进行PCR。
（3）启动子位于基因的5'端上游，所以获得的启动子序列需要连接在GUS 基因的5'端，通过启动GUS 基
因的表达，检测启动子的作用。利用双酶切，可产生不同的黏性末端，从而避免目的基因和载体自身环化，
同时也能确保它们以正确的方向连接。
（4）GUS 以X-Gluc 作为反应底物，可将X-Gluc 水解生成蓝色产物，所以GUS 基因是标记基因，便于筛选。
根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗原—抗体杂交法检测GUS 基因是否表达了GUS。
（5）农杆菌的T-DNA 可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA 中，所以可以利用农杆菌转染植物。
质粒中含有卡那霉素和潮霉素的抗性基因，其中，潮霉素抗性基因在真核生物中表达，由于烟草是真核生
物，因此可利用潮霉素筛选转基因烟草。
10．（2025·山东菏泽·一模）北京紫眼果蝇（基因型hh）是从野生型红眼果蝇（基因型HH）中分离出来
的隐性突变体。对控制果蝇眼色的H、h 基因进行了相关研究。F1、F2、F3、P1、P2、P3 这六种引物及H
基因结构如图1 所示。
(1)为获取h 基因，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA 作为 ，用图1 中F1、P1 作为引物进行PCR，推
测这对引物中与α 链结合的引物碱基序列为5’- -3'（写出前6 个碱基），扩增得到的DNA 片段长
度超过7000bp，说明北京紫眼的h 基因是由于H 基因中插入外来片段形成的。
(2)根据图1，运用PCR 继续探究突变位点在H 基因上的大致位置，简要写出实验思路： 。
(3)为验证H 基因突变是北京紫眼性状产生的原因，运用UAS-GAL4 转基因体系将H 基因导入北京紫眼果蝇
中，流程如图2。GAL4 基因的表达产物是一种转录因子，UAS 是一段特殊的具有调控功能的DNA 片段。UAS
上有GAL4 蛋白的结合位点，只有当GAL4 和UAS 存在于同一个体时，GAL4 才能激活与UAS 相连接的下游基
因的转录。
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①H 基因在品系1、2 中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，H 基因应该插入到位点 （填
“a”、“b”或“c”）。
②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，品系1 和品系2 杂交的F1代中红眼果蝇所占比例
为 ，F1代红眼果蝇雌雄杂交得到的F2代中红眼所占比例可能为 。
【答案】(1) 模板 GAACCT
(2)分别用引物P1 和F3、P2 和F2、P3 和F1，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA 为模板进行PCR，在通过电
泳检测产物片段的长度
(3) b 1/4/25% 1/2 或9/16
【解析】（1）为获取h 基因，PCR 技术中，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA 作为模板，以图中的P1、P1 作
为引物进行PCR 扩增，根据引物P1 对应的α 链的羟基端可推知，与α 链结合的引物碱基序列为5'-
GAACCT-3'。
（2）由图，结合题意可知，h 基因是H 基因中插入外来片段形成的，欲探究突变位点在H 基因上的位置，
可分别用引物P1 和F3、P2 和F2、P3 和F1，以北京紫眼果蝇体细胞的全DNA 为模板进行PCR，分段扩增出
H 基因的相关片段，再通过电泳检测产物片段的长度，若出现长度与H 基因的长度不同片段，即不是
1200bp、2400bp、3785bp，则对应片段为H 基因的突变位点。
（3）①由题意可知，UAS 上有 GAL4 蛋白的结合位点，只有当 GAL4 和 UAS 存在于同一个个体中时，
GAL4 才能激活与UAS 相连接的下游基因的转录，H 基因在品系1、2 中均不表达，只在两个品系杂交的后
代中表达，则H 基因应该插入到位点b，品系1、2 的杂交后代同时含有GAL4 和 UAS ，且b 位点位于UAS
的下游，才能正常表达。
②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，在UAS-GAL4 系统中，红眼性状表现需要GAL4 和
UAS 同时存在于同一果蝇中才能激活H 基因的表达。假设品系1 携带GAL4 基因，品系2 携带UAS-H 基因，
则在F1代杂交中，同时获得这两部分的比例为1/2（GAL4）×1/2（UAS-H）=1/4。因此F 代中红眼果蝇比
₁
例为1/4。若GAL4 与UAS-H 在一对同源染色体上（GAL4 位于其中一条染色体上，UAS-H 位于另一染色体
上），则F1杂交产生的F2中红眼为GAL4-UAS-H 的概率为1/2，若GAL4 与UAS-H 位于非同源染色体上，要
同时含有GAL4 、UAS 和H 才能表现出红眼，则杂交得到的F 代中红眼
₂
GAL4-UAS-H 比例为9/16。
11．（2025·广东汕头·一模）成骨不全症(OI)是一类病因复杂的遗传性骨疾病，可由仅位于X 染色体上
的PLS3 基因发生突变引起。研究人员对某一OI 家系(下图)进行研究，以探索该病的遗传方式和致病机理。
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回答以下问题：
(1)研究人员分别提取Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅲ1多种体细胞的mRNA，在 酶作用下合成cDNA，之后利用
特异性地对PLS3 基因的cDNA 进行PCR 扩增，并对扩增产物进行电泳鉴定，结果如下图a。
(2)据图a 分析，成骨不全症(OI)的遗传方式为 ；若Ⅱ2、Ⅱ3计划生二胎，在不考虑新发突变
的情况下，二胎患OI 的概率是 。
(3)临床观察发现，Ⅲ1的患病程度比相同病因的男性患者轻，原因可能是 。采用抗原-抗体杂
交技术对特定对象体细胞(多种)中的PLS3 蛋白进行检测，请补充图b 横线处的相关信息，并在电泳图中将
对应的位置涂黑以证明该猜测正确 。
【答案】(1) 逆转录 PLS3 基因的引物
(2) 伴X 染色体显性遗传 0
(3) 男性患者无正常PLS3 基因，Ⅲ1 为杂合子，未突变的PLS3 基因能表达出正常的蛋白质【补充答
案：男性患者无正常PLS3 基因，Ⅲ1 为杂合子，体细胞中的一条X 染色体随机失活导致部分细胞表达出正
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常的PLS3 蛋白】
【解析】（1）以RNA 为模板合成DNA 的过程称为逆转录，需要逆转录酶催化，因此研究人员分别提取
Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅲ1多种体细胞的mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，若要扩增PLS3 基因的cDNA，所设计的
引物应与PLS3 基因特定部位的碱基发生特异性结合，即利用PLS3 基因的引物特异性地对PLS3 基因的cDNA
进行PCR 扩增，并对扩增产物进行电泳鉴定。
（2）已知该病由仅位于X 染色体上的PLS3 基因发生突变引起，Ⅱ2、Ⅱ3表型正常，电泳的条带只有一条，
而Ⅲ1电泳的条带为两条，且患病，因此该病致病基因为显性致病基因，即遗传方式为伴X 显性遗传。由
于Ⅱ2、Ⅱ3不携带致病基因，因此在不考虑新发突变的情况下，二胎个体均不会出现该致病基因，患OI
的概率是0。
（3）由于男性患者无正常PLS3 基因，而Ⅲ1为杂合子，未突变的PLS3 基因能表达出正常的蛋白质，因此
Ⅲ1的患病程度比相同病因的男性患者轻。若上述推测是正确的，则含有正常PLS3 蛋白的男性个体不含致
病基因，因此表现为正常男性，而男患者由于只含有致病基因，因此只含异常的PLS3 蛋白，而Ⅲ1为杂合
子，即含有正常的PLS3 基因，也含有突变的PLS3 基因，因此即含有正常PLS3 蛋白，也含有异常的PLS3
蛋白，即电泳图为
。
12．（2024·湖南·一模）柑橘是广受欢迎的水果之一，无核是其作为鲜食水果的优良经济性状之一。柑
橘为雌雄同株植物。位于线粒体DNA 上的雄性不育基因CMS 使植株形成无核果实（传粉受精后，种子不能
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正常发育导致无核）。位于染色体上的一等位基因R 和r 对育性起调控作用，其中R 可以让育性恢复使植
株产生有核果实，r 无此效应。研究人员通过设计特定的引物对不同品种的柑橘细胞的DNA 进行PCR，然后
检测细胞中CMS 和R 基因的数量，结果如表所示。
品
种
A
B
C
D
E
F
CMS
+
+
+
—
—
—
R
+
+
+
—
+
+
+
—
注：“+”代表有此基因及数量，“—”代表无此基因。
(1)CMS 基因的遗传 （填“遵循”或“不遵循”）分离定律。利用PCR 技术扩增CMS 基因和R 基因
需要设计 对引物。
(2)表中所列的六个品种中结无核果实的是 （填字母）。
(3)等量品种C 与品种D 间行种植，随机授粉。收获C 植株上所结的全部F1，理论上其体细胞中
（填“有”或“无”）CMS 基因，核基因型为 。D 植株上收获的果实中，有核果实所占的比例为
。
(4)培育三倍体是获得无核品种的另一条有效途径，科研工作者以二倍体柑橘为母本，以四倍体柑橘为父
本培育了57 株三倍体柑橘。用分子标记技术对亲本及子代群体进行PCR 扩增及凝胶电泳，结果如下图所示。
若父本产生配子时染色体随机组合，两两分离，则母本和父本的基因型分别为 ，理论上F1的基因
型及比例为 。
【答案】(1) 不遵循 2
(2)C
(3) 有 Rr 100%
(4) aa、A1A2aa A1aa∶A2aa∶A1A2a∶aaa=2∶2∶1∶1
【解析】（1）根据题意，CMS 基因属于细胞质基因，其遗传不遵循分离定律。利用PCR 技术扩增每个DNA
片段一般都需要设计1 对引物，CMS 基因和基因的序列不同，因此需要设计2 对引物。
（2）结无核果实需要具有CMS 基因且没有基因，表中品种C 线粒体上含有CMS 基因，细胞核中无R 基因，
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因此品种所结柑橘为无核果实。
（3）品种C 与品种间行种植，随机传粉。C 植株收获的种子所接受的花粉来自D 植株，题表中品种D 只有
一个R 基因，则另一个为r 基因，即品种D 含R 和r 花粉，卵细胞来自C 植株，即核基因为r，线粒体基因
也来自C 植株，由于C 植株的线粒体上有CMS 基因，因此理论上C 植株上所结的F1体细胞中都有CMS 基因。
收获D 植株上全部的F1，形成这些F1的卵细胞来自D 植株，卵细胞的核基因型为1/2R 和1/2r，即核基因
型为Rr，线粒体基因类型与D 植株相同，即无CMS 基因，因此这些F1的表型全部为有核果实。
（4）由四倍体父本的电泳条带可知，其含有A1、A2和a 基因，因此其基因型为A1A2a ，同样的分析方法，
可知二倍体母本基因型为aa,二者杂交后代全为三倍体，由子代3 号个体可以推知，其只含有a 基因，因
此子代3 号个体基因型为aaa,由二倍体母本aa 产生a 配子，可以倒推，四倍体父本可以产生aa 配子，因
此推出父本基因型为A1A2aa。由题干可知，四倍体父本产生配子时染色体随机组合两两分离，因此产生的
配子基因型和比例为A1a：A2a：A1A2：aa=2：2：1：1，因此其与母本产生的a 配子结合后的形成F1的基因
型及比例为A1aa：A2aa：A1A2a：aaa=2：2：1：1。
1．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵
母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1
次PCR 扩增出该基因的中间部分，再通过第2 次PCR 分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序
列，如图所示，回答下列问题：
(1)分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的
，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。以该菌株基因组DNA 为模板进行第1 次PCR，利用 凝胶电泳
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分离并纯化DNA 片段，进一步测定PCR 产物的序列。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸取不同
试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR 扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是
__________。
A．DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染
B．每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点
C．在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝
D．在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd 基因，分别用限制性核酸内切酶Pst Ⅰ和Sal Ⅰ单酶切基因组DNA 后，各自用DNA 连
接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR
产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA 为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二
次PCR 的一对引物，其序列应是DNA 链上的 （A．P1 和P2 B．P3 和P4 C．P1 和P4 D．P2 和
P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd 基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd 基
因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用
酿酒酵母高效合成甘油的目的。
【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头
(2)C
(3) 冷的95%乙醇 D 调控
(4) 基因数据库/序列数据库 表达载体
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物
细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检
测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；
②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交
技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解析】（1）分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的
密码子，根据碱基互补配对，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标
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DNA 片段。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以
避免交叉污染。
（2）A、DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A 错
误；
B、每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA 片段，从而出现另外一条条带，B
错误；
C、在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝，扩增出的DNA 是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C 正确；
D、在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外
一条条带，D 错误。
故选C。
（3）DNA 在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA 经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的
95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。PCR 过程中，子链的延伸方向为5'→3'，结合图示可知，应选择P2 和P3
引物进行第二次扩增。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。
（4）为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者
相同，则说明克隆获得的Gpd 基因准确。将Gpd 基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组
质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
2．（2024·广西·高考真题）M 蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M 基因表达可控的实验
模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre 重组酶来敲除两个LoxP 位点间的序列，
同时利用体内表达的蛋白A 激活诱导型T 启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M 基因（M-GFP）的表达，
恢复小鼠自身被敲除的M 基因功能，同时便于示踪。回答下列问题：
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注：基因型A/+指的是A 基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP 位点的
M 基因称为floxM。
(1)在PCR 扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于
引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1 时，为了阻断A 基因的表达，从转录水平考虑，
连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2 是否构建成功，
需要限制酶切割载体后，再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2 方面）。
(3)为了快速高效繁育出含有4 对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/
+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM 小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交
后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M 基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A 蛋白的四环素，抑制T 启动
子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。
【答案】(1) 5′端 两端包含loxP 序列的终止子 两端包含loxP 序列的可转录出终止密码子
相应的DNA 序列 电泳
(2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压
(3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM
(4)添加四环素会竞争性结合A 蛋白，无法激活T 启动子，导致M-GFP 基因不能表达，从而不能恢复被敲除
的M 基因的功能；不添加四环素，A 蛋白基因表达激活T 启动子，启动M-GFP 基因表达，从而恢复被敲除的
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M 基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。
【解析】（1）PCR 扩增DNA 时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。
终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA 片段。转录
是以DNA 为模板合成RNA 的过程。从转录水平考虑为了阻断A 基因的表达，连接的片段可以是两端包含
LoxP 序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA 上的三联体碱基序列。从翻译
水平考虑为了阻断A 基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP 序列的可转录出终止密码子相应的DNA
序列。为鉴定载体2 是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条
带。
（2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定
期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和
繁殖。
（3）实验的目的是制备M 基因表达可控的实验模型小鼠，对M 基因的控制是通过蛋白A 激活诱导型T 启动
子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M 基因，方便观察 M 基因的表达情况，而自身
所带的M 基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP 位点的M 基因可被Cre 重组酶敲除，所以需要构建两端添
加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre 重组酶来切除自身
的M 基因，同时还要有表达蛋白A 的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M 基因来替换被敲除的M 基因。
综上分析，需进行如下杂交：
最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM 的实验模型小鼠。
（4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A 蛋白，无法激活T 启动子，导致M-GFP 基因不
能表达，从而不能恢复被敲除的M 基因的功能；不添加四环素，A 蛋白基因表达激活T 启动子，启动M-GFP
基因表达，从而恢复被敲除的M 基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。
3．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出
现多重抗药性Sa。
(1)Sa 产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2 点）。
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(2)推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测，以图1 中R 基因的上、下游片段和质粒1
构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2 中的上、下游片段分别与Sa 基因组中R 基因上、下游片段配对，
并发生交换）敲除Sa 的R 基因。
①根据图1 信息，简述质粒2 的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，
再与SacII 酶切质粒1 所得大片段连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培
养获得含质粒2 的Sa 单菌落。
③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛
选并获得不再含有质粒2 的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，
若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因疑似被敲除。
④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图2，表明R 基因已
被敲除的是 。
【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等
(2) 采用引物1 和4 进行PCR 扩增（或采用引物1 和3 以及引物2 和4 分别进行PCR 扩增），用Sac Ⅱ
和EcoR Ⅰ对PCR 产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D
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【解析】（1）Sa 为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。
（2）①由图1 可知，质粒2 上依次接有Sac Ⅱ、EcoR Ⅰ、Sac Ⅱ三个酶切位点，而质粒1 上只有Sac Ⅱ酶
切位点，R 基因的上下游依次含有Sac Ⅱ、EcoR Ⅰ、EcoR Ⅰ、Sac Ⅱ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用
引物1 和4 进行PCR 扩增可得到整个R 基因，以及上下游片段（或采用引物1 和3 以及引物2 和4 分别进行
PCR 扩增），用Sac Ⅱ和EcoR Ⅰ对PCR 产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII 酶切质粒1 所
得大片段连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2 上含有氯霉素抗性
基因，所以可以将重组后的含质粒2 的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来
的菌落就是，含质粒2 的Sa 单菌落。
③推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测需要敲除R 基因，因为质粒2 上含有Y 可被脱
水四环素又到表达的Sa 致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的几率，随
后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R 基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因疑似
被敲除。
④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图2，表明R 基因已
被敲除的是D 组，由图1 可知，R 基因两侧含有的引物为2 和3，所以扩增后含有引物2 或3，或者2 和3
的可能含有R 基因，所以表明R 基因已被敲除的是D 组。
4．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
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(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，
应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因
是 。
【答案】(1)两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
(2) EcoR Ⅰ和NotI Age Ⅰ和Hind Ⅲ
(3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床
(4)排除PCR 体系中外源DNA 的污染
(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR 以应对感染
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。PCR 是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。通过这
一技术，可以获取大量的目的基因。PCR 扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4 种脱氧核苷酸）、酶
（耐高温的DNA 聚合酶）。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【解析】（1）利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模
板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
（2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoR Ⅰ和NotI 的识别序列，且这两个序列位
于启动子和终止子之间，因此，将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是EcoR Ⅰ和NotI。为提高转基因
效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用Age Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因
为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。
（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将
胚胎移植到小鼠c 的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚
胎的存活率。
（4）利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组作为空白对照，这样可
以排除PCR 体系中外源DNA 的污染，提高实验结果的可信度。
（5）若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而
机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR 无法表达，因而干扰
素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。
5．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产
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等。研究人员对酿酒酵母菌株A 进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题：
(1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用
于制作果酒等。
(2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。
(3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A 存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有
和 。
(4)菌株A 含有1 个FLO 基因，其表达的FLO 蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO 蛋白量与乙醇产量成正相
关，研究人员基于菌株A 构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B 的目的是 ，预期菌株
A、B、C、D 发酵中乙醇产量的高低为 。
(5)菌株A 中，X 和Y 基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X 和Y 基因融合在一起，构建了
XY 融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E 中无单独的X 和Y 基因，
且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A 到菌株E 的构建思路 。
【答案】(1) 异养兼性厌氧 酒精
(2)新鲜水果表皮附着酵母菌
(3) 平板划线法 稀释涂布平板法
(4) 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D
(5)从菌株A 获得X、Y 基因，使用4 种引物分别扩增X、Y 基因，其中X 基因后端和Y 基因前端的引物末端
部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR 产物，接着利用融合PCR 技术构建融合基因，再将获得的融
合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。
【分析】酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵；醋酸菌是好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，
能将糖分分解成醋酸，当缺少糖源时，则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。
【解析】（1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于异养兼性厌氧型微生物，在无氧条件下能
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进行酒精发酵，因此常用于制作果酒。
（2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，因为新鲜水果表面附着着酵母菌。
（3）实验室获得该单一菌种的分离方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法中，经过一定
的稀释后将菌液涂布在固体培养基上，可以获得单菌落；平板划线法是在无菌平板表面进行连续划线，微
生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经多次划线培养后，可在平板表面得到单
菌落。
（4）菌株B 导入不含FLO 基因的表达载体作为空白对照组，可以排除表达载体对乙醇产量结果的影响，根
据题干可知，FLO 基因表达的FLO 蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO 蛋白量与乙醇产量成正相关，FLO 基
因数：菌株C＞菌株B＞菌株D，所以乙醇产量：菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D。
（5）菌株E 中无单独的X 和Y 基因，菌株A 含有X 和Y 基因，需要先利用限制酶从菌株A 获得X、Y 基因，
使用4 种引物分别扩增X、Y 基因，其中X 基因后端和Y 基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具
有重叠链的PCR 产物，利用融合PCR 技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因
表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。
6．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD
构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA
片段，序列为：限制酶a 识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b 识别序列，50 为重复次数。请回答
下列问题：
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a 和限制酶b 分别是 。
(2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含
有 的培养基进行筛选。用PCR 技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是
。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA 聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸
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残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD 抗体进行杂交，显示
的条带应是 （从图2 的“A~D”中选填）。
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl 对SOD-ELP50蛋白纯化效果
的影响，部分结果如图3。
（ⅰ）20℃时，加入NaCl 后实验结果是 。
（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。
（ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。
【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ
(2) CaCl2 卡那霉素 S-F 和P-R
(3) 启动子 C
(4) SOD-ELP50 组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl 有利于SOD 蛋白纯化，
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杂蛋白较少，有利于酶活性的保持
【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图
可知，PCR 扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F 和E-R。
【解析】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD 之后，由图可
知，限制酶a 和限制酶b 分别是EcoR I、Hind Ⅲ。
（2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA 分子的状态。由图可知，重
组DNA 含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成
功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD 和ELP50，结合图示可知，引物S-F 和P-R 对应序列包含SOD 和
ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，根据扩增产物相对的分子质量的大小判断大肠杆
菌中是否导入pET-SOD-ELP50。由于ELP50中含有重复序列，使用E-F 或E-R 对导入普通质粒和重组质粒的
大肠杆菌进行PCR 扩增，得到的产物可能无法区分。
（3）RNA 聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为
462+750=1212bp，编码1212÷3=404 个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为
0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。
（4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl 后纯化蛋白数量更多。
（ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。
（ⅲ）20℃，加入NaCl 时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl 有利
于SOD 蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。
7．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H 基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建
过程如下：在H 基因前后均插入LX 序列突变成h 基因（仍正常表达H 蛋白），获得Hh 雌性小鼠；将噬菌
体的G 酶基因插入6 号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G 酶基因）
(1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H 基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程
中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，
诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G 酶的小鼠，
经检测发现在6 号和8 号染色体上含有部分G 酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。
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(2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1 的原理，若将图2 中所有
基因型的小鼠都喂食TM 试剂一段时间后，检测H 蛋白水平为0 的是 （填序号）。
(3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H 蛋白表达下降有关（小鼠H 蛋白与人的功能相
同）。现有H 基因完全敲除鼠甲和H 基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H 蛋白导致该病发生的机制，更适合
的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。
【答案】(1) HhG+G- 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加 染色体片段从一条染色
体移接到另一条非同源染色体上
(2) HhG+G+、HhG+G- ④
(3) 乙 乙的H 基因敲除后表达受TM 试剂调控
【解析】（1）由题干可知，亲本为HhG-G-、HHG+G-，要获得H 基因条件敲除小鼠hhG+G-和hhG+G+，则用于繁
殖F1的基因型是HhG+G-。近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力
下降。6 号和8 号染色体上含有部分G 酶基因序列，G 酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异
为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上。
（2）由图2 可知，③含有基因H、h、G，故其基因型为HhG+G+、HhG+G-。结合图1 和图2，①只含有h 基因，
仍正常表达H 蛋白，②③都含有H 基因，可正常表达H 蛋白，④含有h 基因和G 基因，TM 试剂激活G 酶可
剪切LX 序列，使h 基因异常，无法表达H 蛋白，故检测H 蛋白水平为0 的是④。
（3）由题干可知，患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H 蛋白表达下降有关，由题干和题图可知，
乙的H 基因敲除后表达受TM 试剂调控，故选择H 基因条件敲除鼠乙。
8．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国
研究人员发现，基因S 在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基
因（两品种中基因S 序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
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(1)基因S 启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN 克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S 的优质大豆品种YZ。根据题19
图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ 所得再生植株YZ-1 的种子变大。同时将从TL 克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2 的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN 较TL 种子
大的原因是 。
【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）
(2) EcoR Ⅰ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接
（反向链接）
(3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S 片段 PCR
(4)品种DN 的基因S 上游启动子效应比TL 强，使得基因S 表达量更高，种子更大
【解析】（1）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA 的转录，是一段DNA 片段，其基本组
成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
（2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA 序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶
EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，
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形成的DNA 片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向
连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
（3）①DNA 电泳可以分离不同大小的DNA 片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子
D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还
应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR 等技术检测受体细胞的DNA 上是否插入目的基因或
目的基因是否转录出mRNA。
（4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1 导入的目的基因为取自品种DN 的“启动子D＋基因S”序列，
再生植株YZ-2 导入的目的基因为取自品种TL 的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因
S 序列无差异”可推测：品种DN 的基因S 上游的启动子D 的效应强于品种TL 的启动子T，启动子D 使基因
S 表达量更高，因而种子更大。
9．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A 的野生型（含NV 基
因）、突变体（NV 基因突变）和转基因菌株（转入NV 基因），检测三种菌株NV 酶的生成与培养液中的葡
萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。
检测用菌
株
蔗糖
NV 酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
突变体
+
—
—
转基因菌
株
+
+
+
回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV 基因表达。NV 酶的作用是 。检测NV 酶活性时，需测定
的指标是 （答出1 点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA 随机插入野生型菌株基因组DNA 筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组
DNA 作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV 基因”）配对的引物进行PCR 扩增。若突变体扩
增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基
因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将NV 基因导入 细胞获得的。在构建NV
基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
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【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量
（或蔗糖的减少量等）
(2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列
(3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞
【解析】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV 酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基
因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV 酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，
将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。
（2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩
增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA
中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而
突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，
扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则
表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。
（3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由
于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入
突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有
特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基
因的细胞。
10．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组
织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因
上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包
含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表
达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图
B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活
报告基因的表达（图C）。
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获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR
扩增含有捕获载体序列的DNA 片段。对PCR 产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的
插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其
在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是
基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA 片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载
体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G 和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应
检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕
获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B 所示载体进行了改造，期望改造后的
载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因
功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达
(2)C
(3)各组织器官中G 和H 的mRNA
(4)
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【解析】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功
能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。
（2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,
增强子是含有特定碱基序列的DNA 片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，
AB 正确；
C、由图C 可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C 错误；
C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D 正确。
故选C。
（3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR 等技术检测其他器官细胞中G 和H 两个
基因是否转录出相应的 mRNA。
（4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体
中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因
突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研
究某目的基因的功能，可将图B 所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如
下：
。
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