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文献分享 | 旋覆花叶中咖啡酰葡萄糖酸和咖啡酰奎宁酸及其在TNF-α诱导的正常人皮肤成纤维细胞损伤中的抗皮肤老化作用
2025年5月，韩国庆熙大学Dae Sik Jang和嘉泉大学Sullim Lee等人在期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry发表题为Caffeoylglucaric and Caffeoylquinic Acids from Inula japonica Leaves and Their Anti-Skin Aging Effects in TNF-α-Induced Normal Human Fibroblast Damage的论文。
研究表明，日本旋覆花（Inula japonica）叶的30%乙醇提取物（IJE）中富含咖啡酰葡萄糖酸（caffeoylglucaric acids）和咖啡酰奎宁酸（caffeoylquinic acids）。研究首次发现了三个新的咖啡酰葡萄糖酸化合物，命名为inulajaponic acids A-C。其中，**inulajaponic acid C（化合物4）**在TNF-α诱导的人皮肤成纤维细胞（NHDF）中表现出显著的抗皮肤老化活性，能够抑制ROS和MMP-1产生，促进I型前胶原蛋白合成，并通过MAPK-NF-κB/AP-1信号通路调节炎症反应，展现出作为天然抗皮肤老化成分的潜力。（这个部分没有包括所有的摘要内容，省略了部分内容，但是内容没问题）
研究背景
皮肤为什么会老化？
人体皮肤是由表皮、真皮和皮下组织组成的多层器官，是人体最大的器官。皮肤不仅保护内部器官，还在维持年轻外观方面发挥重要作用。然而，在皮肤老化过程中，会出现皱纹、干燥和皮肤厚度增加等明显标志。
皮肤老化可分为内源性老化和外源性老化。内源性老化由遗传、激素变化和时间推移等内部因素引起；外源性老化则归因于紫外线辐射、空气污染和心理压力等环境因素。其中，紫外线辐射是皮肤老化的主要诱因，它能深入真皮层，激活肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子级联反应。
炎症与皮肤老化有什么关系？
在正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）中，TNF-α会提高细胞内活性氧（ROS）水平。ROS的过度表达会引发氧化应激，破坏细胞内氧化还原稳态，导致丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和激活蛋白1（AP-1）等转录因子的磷酸化。同时，TNF-α会诱导降解胶原蛋白的基质金属蛋白酶（MMPs）表达，同时下调胶原蛋白的合成，这种破坏会损害细胞外基质（ECM），导致皱纹形成和色素沉着。
慢性炎症在加速皮肤老化中起着关键作用，而TNF-α作为核心促炎细胞因子，在被刺激后会促进IL-6和IL-8等其他细胞因子的产生，并上调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）等炎症介质的表达。iNOS催化一氧化氮（NO）的合成，导致氧化应激和组织损伤；COX-2则负责前列腺素的产生，进一步加剧炎症。相反，血红素加氧酶-1（HO-1）作为一种诱导性细胞保护酶，能够减轻氧化损伤并抑制炎症信号传导。
因此，调节iNOS、COX-2和HO-1的表达是缓解皮肤炎症和延缓老化的潜在策略。
旋覆花是什么植物？
日本旋覆花（Inula japonica Thunb.）属于菊科植物，广泛分布于东北亚的山地、田野和河边，平均高度为30-60厘米。其花朵俗称"旋覆花"，在传统东方医学中被用作治疗支气管炎、肝炎和消化系统疾病的药材。近年来的研究表明，旋覆花具有抗炎、抗过敏、抗糖尿病和抗肥胖等多种药理作用，其主要生物活性成分包括倍半萜、三萜类、黄酮类和酚酸类化合物。（对植物拉丁名的中文名理解有偏差，核实植物志后是旋覆花）
然而，尽管日本旋覆花的叶子可食用，并与花朵一起用于传统东方医学，但关于其叶子的成分和生物活性的详细研究仍然有限。在种植过程中，叶子通常被丢弃。在前期研究中发现，日本旋覆花叶的30%乙醇提取物（IJE）能够抑制TNF-α刺激的NHDF细胞中ROS和MMP-1的分泌，因此本研究旨在系统分析IJE中的生物活性成分，评估其作为抗皮肤老化剂的潜力。
研究材料及方法
1. 植物材料与提取
日本旋覆花叶子于2021年6月、7月和8月在韩国顺昌郡采集并干燥。干燥的日本旋覆花叶（3.0 kg）用30%乙醇在80°C下提取5小时，经55 μm滤膜过滤后，在45°C下真空蒸发，得到浓缩液（收率16.7% Brix）。
2. LC-MS分子网络分析
使用UHPLC-Orbitrap-MS进行LC-MS/MS分析，采用HALO C18色谱柱（2.7 μm，2.1 × 100 mm）。原始MS数据经MZmine软件处理后，上传至GNPS平台构建分子网络，结合MS-FINDER进行硅片断裂分析预测化合物结构。
3. 化合物分离与结构鉴定
IJE经Diaion HP-20柱色谱分离，再通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、MCI凝胶及制备型HPLC等方法，共分离得到20个化合物。通过¹H NMR、¹³C NMR、HR-MS等波谱技术确定化合物结构。
4. 体外细胞活性验证
细胞培养：正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）用含10% FBS的DMEM培养基培养
细胞活力测定：使用EZ-Cytox法
ROS测定：使用DCFDA荧光探针
ELISA检测：测定MMP-1、I型前胶原蛋白α1、IL-6、IL-8分泌水平
Western blot分析：检测MAPK、NF-κB、AP-1通路蛋白磷酸化水平及iNOS、COX-2、HO-1表达
研究结果
（1）分子网络分析与化合物鉴定
通过LC-MS分子网络分析，从IJE数据集中提取了252个特征峰。结合GNPS光谱库匹配和MS-FINDER硅片预测，鉴定出咖啡酰奎宁酸和咖啡酰葡萄糖酸为IJE的主要成分。
📁 图片文件：
图示内容：通过分子网络分析鉴定IJE中的咖啡酰葡萄糖酸和咖啡酰奎宁酸类化合物。Cluster 1和3为咖啡酰葡萄糖酸衍生物，Cluster 2为咖啡酰奎宁酸衍生物。红色边框节点表示含有咖啡酰基团的化合物。
（2）化合物分离与结构解析
研究共分离得到20个化合物，包括：
3个新咖啡酰葡萄糖酸：inulajaponic acids A-C（化合物1、2、4）
1个四咖啡酰葡萄糖酸：2,3,4,5-四咖啡酰葡萄糖酸（3）
4个三咖啡酰葡萄糖酸（5-8）
3个二咖啡酰葡萄糖酸（9-11）
2个单咖啡酰葡萄糖酸（12、13）
6个咖啡酰奎宁酸（14-19）
1个黄酮类化合物：槲皮素（20）
📁 图片文件：
图示内容：(A) 从IJE中分离得到的化合物1-20的化学结构式；(B) Inulajaponic acids A-C（1、2、4）的¹H-¹H COSY（粗线）和¹H-¹³C HMBC（箭头）关键相关性分析。
新化合物结构解析：
化合物 | 分子式 | 结构特征 |
|---|---|---|
Inulajaponic acid A（1） | C₃₇H₃₄O₁₈ | 2,3,4-O-三咖啡酰-5-O-异丁酰-D-葡萄糖酸 |
Inulajaponic acid B（2） | C₃₈H₃₆O₁₈ | 2,3,4-O-三咖啡酰-5-O-异戊酰-D-葡萄糖酸 |
Inulajaponic acid C（4） | C₃₄H₃₀O₁₇ | 2,3,5-O-三咖啡酰-葡萄糖酸-1-O-甲酯 |
📁 图片文件：
图示内容：(A) IJE的UHPLC-PDA色谱图；(B) 负离子模式下的基峰色谱图（Base Peak Chromatogram），标注了各峰的鉴定结果（A-Z, AA）。
（3）IJE对ROS和MMP-1产生的抑制作用
📁 图片文件：
图示内容：IJE对NHDF细胞的影响：(A) 细胞活力测定；(B) ROS水平变化；(C) MMP-1分泌量。数据显示为均值±SD或SEM（n=3）。
实验结果：
TNF-α处理组ROS水平显著增加（1.73 ± 0.04倍，p < 0.001）
IJE处理组显著降低ROS水平（浓度依赖性）
TNF-α处理组MMP-1水平显著增加（2.51 ± 0.03倍，p < 0.001）
IJE处理显著降低MMP-1分泌
（4）分离化合物的抗氧化活性筛选
📁 图片文件：
图示内容：从IJE分离的各化合物（25、50、100 μM）对TNF-α诱导的NHDF细胞中ROS产生的影响。ROS水平通过DCFDA荧光法测定。
主要发现：
**Inulajaponic acid C（4）**在25、50和100 μM浓度下均显示出显著的ROS抑制作用
**Inulajaponic acids A和B（1和2）**也能有效降低TNF-α诱导系统中的ROS水平
（5）分离化合物的抗MMP-1活性筛选
📁 图片文件：
图示内容：从IJE分离的各化合物（25、50、100 μM）对TNF-α诱导的NHDF细胞中MMP-1分泌的影响。MMP-1分泌量通过ELISA试剂盒测定。
主要发现：
Inulajaponic acid B（2）、**2,3,4,5-四咖啡酰葡萄糖酸（3）和Inulajaponic acid C（4）**在25 μM浓度下有效抑制MMP-1分泌
大多数测试化合物在100 μM浓度下降低MMP-1分泌
（6）Inulajaponic acids A-C的抗皮肤老化活性
📁 图片文件：
图示内容：化合物1-4对TNF-α处理的NHDF细胞的影响：(A) ROS产生水平；(B) I型前胶原蛋白α1分泌量。I型前胶原蛋白水平通过ELISA试剂盒测定。
实验结果：
指标 | TNF-α组变化 | 化合物4效果（50 μM） |
|---|---|---|
ROS产生 | 1.47 ± 0.02倍 ↑ | 0.26 ± 0.04倍（抑制率最高） |
I型前胶原蛋白α1 | 0.14 ± 0.06倍 ↓ | 0.43 ± 0.02倍（显著恢复） |
（7）炎症因子抑制效果
【图片位置：Figure 8 - IL-6和IL-8抑制】
📁 图片文件：
图示内容：化合物1-4对TNF-α诱导的NHDF细胞中炎症因子分泌的影响：(A) IL-6分泌水平；(B) IL-8分泌水平。
实验结果（100 μM浓度下）：
化合物 | IL-6分泌 (ng/mL) | IL-8分泌 (ng/mL) |
|---|---|---|
TNF-α组 | 9.76 ± 0.24 | 3.22 ± 0.20 |
化合物1 | 3.94 ± 0.06 | 0.96 ± 0.04 |
化合物2 | 3.79 ± 0.09 | 1.17 ± 0.00 |
化合物3 | 4.75 ± 0.70 | 1.04 ± 0.03 |
化合物4 | 1.64 ± 0.01 | 0.28 ± 0.01 |
（8）雷达图综合分析
📁 图片文件：
图示内容：化合物1-4在五个皮肤老化相关指标上的综合效果雷达图分析。五个指标包括：ROS抑制、MMP-1抑制、I型前胶原蛋白恢复、IL-6抑制、IL-8抑制。
结论：Inulajaponic acid C（4）在五个皮肤老化相关指标中表现出最强且均衡的效果，被选为进一步机制研究的先导化合物。
（9）Inulajaponic acid C（4）的作用机制
MAPK通路调控
📁 图片文件：
图示内容：Inulajaponic acid C（4）对TNF-α诱导的NHDF细胞中JNK、ERK和p38蛋白磷酸化水平的影响。细胞用25、50、100 μM化合物4处理1小时后，再用20 ng/mL TNF-α处理15分钟。
MAPK通路实验结果：
蛋白 | TNF-α组磷酸化 | 化合物4（100 μM）效果 |
|---|---|---|
JNK | 1.71 ± 0.08倍 ↑ | 0.06 ± 0.02倍（强烈抑制） |
ERK | 3.3 ± 0.05倍 ↑ | 2.26 ± 0.03倍（浓度依赖性抑制） |
p38 | 11.08 ± 0.09倍 ↑ | 无显著影响 |
NF-κB和c-Jun调控
📁 图片文件：
图示内容：Inulajaponic acid C（4）对TNF-α诱导的NHDF细胞中NF-κB和c-Jun蛋白磷酸化水平的影响。
NF-κB/AP-1通路实验结果：
蛋白 | TNF-α组磷酸化 | 化合物4效果 |
|---|---|---|
NF-κB | 2.4 ± 0.15倍 ↑ | 浓度依赖性抑制（100 μM: 0.58倍） |
c-Jun | 3.00 ± 0.02倍 ↑ | 50 μM以上抑制（100 μM: 1.48倍） |
炎症介质调控
📁 图片文件：
图示内容：Inulajaponic acid C（4）对TNF-α诱导的NHDF细胞中iNOS、COX-2和HO-1蛋白表达水平的影响。
炎症介质实验结果：
蛋白 | TNF-α组表达 | 化合物4（100 μM）效果 |
|---|---|---|
iNOS | 1.78 ± 0.01倍 ↑ | 0.28 ± 0.03倍（显著下调） |
COX-2 | 3.91 ± 0.01倍 ↑ | 3.43 ± 0.00倍（下调） |
HO-1 | 无显著变化 | 2.23 ± 0.00倍（显著上调，p < 0.001） |
（10）作用机制总结图
📁 图片文件：
图示内容：Inulajaponic acid C（4）在TNF-α诱导的NHDF细胞中潜在保护作用的机制示意图。展示了化合物4通过抑制MAPK-NF-κB/AP-1信号通路，调节炎症因子和防止胶原蛋白降解的抗皮肤老化机制。
研究结论与讨论
本研究系统分析了日本旋覆花叶提取物的化学成分及其抗皮肤老化特性。通过LC-MS分子网络分析与化合物分离相结合的方法，鉴定出咖啡酰葡萄糖酸和咖啡酰奎宁酸为主要成分。其中，三个咖啡酰葡萄糖酸——**inulajaponic acids A-C（1、2和4）**为首次报道的新化合物。
研究证明，IJE中的咖啡酰葡萄糖酸衍生物能够有效调节TNF-α诱导的NHDF细胞中ROS和MMP-1的过度产生。特别是**Inulajaponic acid C（4）**显著抑制了四个与皮肤老化症状相关的标志物（ROS、MMP-1、IL-6和IL-8），并轻微激活I型前胶原蛋白的生成。
机制研究表明，化合物4通过抑制ERK、JNK、NF-κB和c-Jun的磷酸化，通过MAPK-NF-κB/AP-1信号通路调节炎症细胞因子和其他皮肤老化过程。此外，化合物4下调iNOS和COX-2表达，上调HO-1表达，表明其具有缓解与皮肤老化相关炎症的潜力。
**综上所述，Inulajaponic acid C（4）有望成为保护皮肤免受TNF-α诱导的氧化应激、皮肤炎症和ECM降解的有效成分。日本旋覆花叶可作为天然抗皮肤老化成分的来源。**未来需要使用皮肤老化模型进行体内研究，以验证这些特性并促进活性化合物在化妆品配方中的应用。
图片文件清单
图片编号 | 文件名 | 内容描述 |
|---|---|---|
Figure 1 | Figure_01_molecular_network.png | 分子网络分析图 |
Figure 2 | Figure_02_compound_structures.png | 化合物结构式 |
Figure 3 | Figure_03_chromatogram.png | UHPLC色谱图 |
Figure 4 | Figure_04_IJE_cell_viability.png | IJE对细胞活力、ROS、MMP-1的影响 |
Figure 5 | Figure_05_compounds_ROS.png | 各化合物对ROS的影响 |
Figure 6 | Figure_06_compounds_MMP1.png | 各化合物对MMP-1的影响 |
Figure 7 | Figure_07_ROS_procollagen.png | 化合物1-4对ROS和I型前胶原蛋白的影响 |
Figure 8 | Figure_08_IL6_IL8.png | 化合物1-4对IL-6和IL-8的影响 |
Figure 9 | Figure_09_radar_chart.png | 雷达图综合分析 |
Figure 10 | Figure_10_JNK_ERK_p38.png | 化合物4对MAPK通路的影响 |
Figure 11 | Figure_11_NFkB_cJun.png | 化合物4对NF-κB/c-Jun的影响 |
Figure 12 | Figure_12_iNOS_COX2_HO1.png | 化合物4对iNOS/COX-2/HO-1的影响 |
Figure 13 | Figure_13_mechanism.png | 作用机制示意图 |
参考文献
Son S-R, Kim KS, Jang DS, Lee S. Caffeoylglucaric and Caffeoylquinic Acids from Inula japonica Leaves and Their Anti-Skin Aging Effects in TNF-α-Induced Normal Human Fibroblast Damage. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2025. doi: 10.1021/acs.jafc.4c13160