淋巴细胞功能流式细胞术检测专家共识(附下载)

流式细胞术（FCM）检测淋巴细胞亚群的比例与数量是当前临床进行免疫功能评估的主要方法之一，在疾病诊断、预后评估及治疗监测中发挥重要作用。目前，国内多篇指南与专家共识阐述了淋巴细胞及其他免疫细胞的FCM检测在血液肿瘤、实体瘤等多种疾病诊疗及健康管理中的检测流程、临床应用价值与质量控制相关内容^[1-10]。然而，单纯依赖淋巴细胞亚群数量和比例的变化，难以全面揭示淋巴细胞的功能状态，也无法准确反映免疫系统的动态调控能力及其在疾病发生发展中的关键作用^[11]。淋巴细胞功能检测则主要是指通过评估淋巴细胞不同亚群的功能（如杀伤、分泌、分化等）来反映其免疫活性^[12]。近年来，随着FCM技术的不断发展，淋巴细胞的功能检测正逐步应用于肿瘤、感染及自身免疫性疾病等疾病的免疫功能评价及科研探索^[11,13-15]。

NK细胞杀伤功能FCM检测

共识1：

建议采用Annexin V/7-AAD双染法检测靶细胞凋亡及死亡比例，以评价NK杀伤功能。建议使用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-K562稳定细胞株作为靶细胞。

推荐强度：强推荐。

共识2：

NK细胞杀伤功能FCM检测需要提取PBMCs。靶细胞的台盼蓝检测细胞成活率在95%以上。PBMCs和靶细胞需要在37 ℃、5% CO2培养箱中共培养4 h后，进行Annexin V/7AAD双染法及FCM上机检测，至少获取10 000个细胞。NK细胞杀伤功能活性检测结果报告方法为样本管与对照管的靶细胞（EGFP-K562细胞）凋亡比例的差值。

推荐强度：强推荐。

共识3：

NK细胞杀伤功能活性增高常见于病毒感染早期、长期使用干扰素、习惯性流产及宿主抗移植物反应等患者；NK细胞活性降低或缺如已作为HLH的诊断标准之一，此外，NK细胞杀伤功能活性降低还常见于恶性肿瘤、免疫缺陷病、长期使用免疫抑制剂及部分病毒、细菌和真菌感染等患者。

推荐强度：强推荐。

淋巴细胞细胞内IFN-γ的FCM检测

共识4：

建议使用6色及6色以上的方案，检测的抗体组合应包含CD3、CD4、CD8、CD16、CD56、CD45、IFN-γ，其中，CD16与CD56可共用同一检测通道，IFN-γ推荐使用荧光强度高、信噪比佳的荧光素如PE、APC。

推荐强度：强推荐。

共识5：

细胞内的IFN-γ是T和NK细胞激活后产生和分泌的，推荐采用PMA和离子霉素等作为淋巴细胞刺激剂，并于37 ℃、5% CO2培养箱孵育4 h，然后按照细胞内染色标准步骤进行操作。结果报告方法为报告CTL细胞中表达IFN-γ的细胞比例，NK细胞中表达IFN-γ的细胞比例。

推荐强度：强推荐。

共识6：

淋巴细胞细胞内IFN-γ流式细胞术检测可用于评估不同淋巴细胞亚群（如CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞及NK细胞）在体外刺激条件下的反应能力。CD4⁺T细胞IFN-γ表达主要反映Th1细胞免疫应答状态；CD8⁺T细胞IFN-γ表达反映CTL的效应功能；NK细胞IFN-γ表达反映先天免疫活化水平。其表达水平变化提示相关淋巴细胞亚群功能状态的增强或减弱，在肿瘤免疫监测、感染性疾病、免疫缺陷、自身免疫疾病及移植免疫评估中具有参考价值。

推荐强度：强推荐。

体外刺激的Th1/Th2/Th17的FCM检测

共识7：

建议使用6色及6色以上的方案，检测的抗体组合应包含CD3、CD4、CD45、IFN-γ、IL-4、IL-17，其中IFN-γ、IL-4、IL-17推荐使用IFN-γ推荐使用荧光强度高、信噪比佳的荧光素如PE、APC、FITC，并注意荧光素的强弱搭配。

推荐强度：强推荐。

共识8：

体外刺激的Th1、Th2、Th17检测时，淋巴细胞刺激、细胞内染色标准步骤和细胞内IFN-γ检测相同。报告时将体外刺激后检测CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺、CD3⁺CD4⁺IL-4⁺及CD3⁺CD4⁺IL-17⁺细胞，分别作为Th1型、Th2型及Th17型功能性Th细胞的指标，并报告Th1、Th2、Th17占CD4⁺T细胞的比例及Th1/Th2比值。

推荐强度：强推荐。

共识9：

Th细胞免疫偏向的改变可能与多种疾病相关。Th1型免疫反应增强常见于部分自身免疫性疾病及慢性病毒感染，减弱可能提示细胞免疫功能受损；Th2型反应增强多见于过敏及寄生虫感染；Th17型反应增强与自身免疫及慢性炎症相关，在肿瘤中可能具有双重作用。Th1/Th2比值可作为免疫偏向的参考指标，其异常需结合临床及其他免疫学参数综合解读。

推荐强度：中推荐。

质量控制要点

共识10：

由于 NK细胞杀伤功能的FCM检测、淋巴细胞细胞内IFN-γ的FCM检测、体外刺激的Th1/Th2/Th17的FCM检测操作流程较为复杂，目前缺乏统一的生物参考区间，实验室应熟悉操作过程中的注意事项，加强生物参考区间的建立与验证、检测流程标准化质量控制，应结合患者疾病背景、相关指南、诊疗标准等对患者检测结果进行解读。

推荐强度：强推荐。

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