前言

Aligned tissue image

cytassist_image.tiff:这是原始的CytAssist图像输入的图片的副本，说的更简单的就是这个是spaceranger输入参数中cytaimage的图片的副本。这个图片因为是高分辨的，所以所占空间比其他图片要大。 

分辨率大小一般Visium HD：3,200 x 3,000 像素；Visium v2：最大尺寸3,000像素。

这些就是我们后续分析常用的图片啦，是对图片进行降低分辨率处理后的结果，包含了如下两类。降低分辨率的方法是才去方框滤波的方法进行，每一个输出像素的是内核邻域像素值的平均值得到，简单来说，就是全分辨率图像中像素块中的RGB值进行平均，以获得降低分辨率图像中一个像素的RGB值，只是改变图片的清晰度，不改变图片的长宽比。 

tissue_hires_image:图片分析处理后的高分辨率的图片，不同的10X空间转录组的输入不一样，生成的这个分辨率大小存在一定差异，如下： 

• Visium v2 slide, 6.5 mm Capture Area：最大尺寸2000像素；

• Visium v2 slide, 11 mm Capture Area：最大尺寸像素；

• Visium HD slide, 6.5 mm Capture Area：最大尺寸6000像素。 

tissue_lowres_image:图片分析处理后的低分辨率的图片。其分辨率统一为600像素。

detected_tissue_image.jpg:在Visium HD和Visium V2中这个图片的分辨率和CytAssist image一致，在Visium V1中这个图片的分辨率和tissue_hires_image.png保持一致。 不同的10X方法可能这个图的结果不是一样的表达方法，这里是Visium HD的示例。

可以看到和aligned_fiducials.jpg相同的是存在一个框，框的边缘由若干圈圈组成。

在Visium HD中圈圈是红色标记，在Visium V1和Visium V2中是蓝色标记。

然后可以看到一个蓝色的边界框，是最终组织检测的区域。 在组织检测区域，在Visium HD中是蓝色的区域标记出来的（示例中就是蓝色部分），在Visium V1和Visium V2中是红色标记的。

可以看到这个框框中还有其他部分都是以灰色进行标记的。

• tissue_lowres_scalef‌：表示原始分辨率图像的像素位置在低分辨率图像中的对应像素位置。这个值是通过将原始分辨率图像的像素位置乘以‌tissue_lowres_scalef‌来得到的‌；

• tissue_hires_scalef‌：同理，表示原始分辨率图像的像素位置在高分辨率图像中的对应像素位置。这个值是通过将原始分辨率图像的像素位置乘以‌tissue_hires_scalef‌来得到的‌；

• fiducial_diameter_fullres：在 全分辨率（full resolution） 的组织学图像（如 tissue_image.tif）中，Visium 玻片上 定位标记点（fiducial markers） 的直径（单位为像素）。其主要用于计算基因表达斑点（spots）的物理坐标与图像像素坐标之间的缩放比例。

• spot_diameter_fullres：在全分辨率（原始尺寸）的H&E染色图像（如 tissue_image.tif）中，单个捕获斑点（spot）的直径，单位为像素（pixels）。将spot的坐标（tissue_positions_list.csv）映射到图像的实际物理位置。

那么scalefactor的计算方法是什么呢？

如下公式进行： 比如tissue_hires_image.png 按最大尺寸2000像素计算。

 其各列信息如下：

• 第一列barcode：细胞barcodes名称；

• 第二列in_tissue：是否是组织内，1是组织内，0是不在组织内；

• 第三列array_row：该spot位于空间位置点阵的横轴方向的位置，6.5 mm Capture Area捕获大小的区域有78横行，从0-77记录。11 mm Capture Area捕获大小的区域有128横行，从0-127记录；

• 第四列array_col：该spot位于空间位置点阵的纵轴方向的位置，6.5 mm Capture Area捕获大小的区域有127纵列，从0-126记录。11 mm Capture Area捕获大小的区域有223纵列，从0-222记录；

• 第五列pxl_row_in_fullres：该spot位于原始图片分辨率下空间位置点阵的像素横轴方向的位置；

• 第六列pxl_col_in_fullres：该spot位于原始图片分辨率下空间位置点阵的像素纵轴方向的位置；

pxl_row_in_fullres和pxl_col_in_fullres可以根据上面scalefactors_json.json的scalefactor来变换成各个分辨率图像的像素坐标。

注意，这个文件可能在一些文件夹叫tissue_positions.parquet。这个格式文件我在barcode_mappings.parquet讲过读取方法，可以转换成csv文件的。

tissue_positions.parquet转tissue_positions.csv方法如下：

注意：在使用pandas读取parquet文件前，还需要额外装两个包分别是pyarrow和fastparquet。

可能还存在以下文件：spatial_enrichment.csv和barcode_fluorescence_intensity.csv等，这里就不作详细介绍了，一般来说这些文件后续分析很少用到，这里就不作说明了，感兴趣的可以自己打开了解下，更多是对基因和barcodes的统计描述。

好了，本次10X空间转录组spaceranger分析结果常见文件基本介绍完毕，还有一些其他文件这里就不作介绍，一般来说很少能使用到其他文件。对于空间转录组而言，目前还在发展，无论是上游分析还是下游分析，不同公司的输出结果都存在较大的格式差别，下游分析软件的操作也是五花八门，这和最初单细胞转录组一样，未来个人觉得会逐渐趋于标准化的文件格式和数据结构和分析框架体系。因为只有标准化，才便于大家使用，才便于大家利用空间转录组这个工具探索自然世界并解决科学问题。一代代单细胞实验科学家和生信工作者会逐渐完善，最终众多实践中找到一条主要的分析框架。

未来方老师笔记中会介绍目前主流的基于10X空间转录组的常规分析应用，欢迎大家关注和交流！