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10XscATAC的结果说明（1）之概述

方老师小课堂

前言

在介绍10X的scATAC的结果之前，首先要了解单细胞ATAC的技术在10Xgenomics中存在两种。一类是scATAC是单细胞中ATAC测序的方法，一类是scATAC ARC是单细胞同时测定RNA和ATAC的方法。本次首先介绍scATAC的数据分析的结果。

基于10XscATAC数据分析的方法，采用的是cellranger-atac软件进行的。

理应注意：区别于转录组，scATAC的参考基因组无法和scRNA的参考基因组共用。因此，scATAC数据的参考基因组需要另一套，而非scRNA的。创建基因组的方法后续会详细介绍，本次以scATAC数据的结果让大家了解scATAC的一个基本情况。

文件输出目录详解

以cellranger-atac count分析结果为准，如下方所示，同scRNA一样，scATAC也会输出一系列问题，其中有些文件和scRNA类似，有些又有ATAC独有的文件。

- Per-barcode fragment counts & metrics:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/singlecell.csv- Position sorted BAM file:                     /home/jdoe/runs/sample345/outs/possorted_bam.bam- Position sorted BAM index:                    /home/jdoe/runs/sample345/outs/possorted_bam.bam.bai- Summary of all data metrics:                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/summary.json- HTML file summarizing data & analysis:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/web_summary.html- Bed file of all called peak locations:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/peaks.bed- Smoothed transposition site track:            /home/jdoe/runs/sample345/outs/cut_sites.bigwig- Raw peak barcode matrix in hdf5 format:       /home/jdoe/runs/sample345/outs/raw_peak_bc_matrix.h5- Raw peak barcode matrix in mex format:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/raw_peak_bc_matrix- Directory of analysis files:                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/analysis- Filtered peak barcode matrix in hdf5 format:  /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_peak_bc_matrix.h5- Filtered peak barcode matrix in mex format:   /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_peak_bc_matrix- Barcoded and aligned fragment file:           /home/jdoe/runs/sample345/outs/fragments.tsv.gz- Fragment file index:                          /home/jdoe/runs/sample345/outs/fragments.tsv.gz.tbi- Filtered tf barcode matrix in hdf5 format:    /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_tf_bc_matrix.h5- Filtered tf barcode matrix in mex format:     /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_tf_bc_matrix- Loupe Browser input file:                     /home/jdoe/runs/sample345/outs/cloupe.cloupe- csv summarizing important metrics and values: /home/jdoe/runs/sample345/outs/summary.csv- Annotation of peaks with genes:               /home/jdoe/runs/sample345/outs/peak_annotation.tsv- Peak-motif associations:                      /home/jdoe/runs/sample345/outs/peak_motif_mapping.bed

主要文件简介

 web_summary.html 

对于10XscATAC而言，我们首先要看的也就是网页报告：web_summary.html。这里记录了分析数据过程中所有的指标特征，以评估单细胞scATAC实验是否合格，是否可用于后续分析。 singlecell.csv 这里存储了scATAC数据分析后的每个细胞关于比对和ATAC一些指标的具体信息，该文件可被纳入到后续分析的metadata中作为数据质控和展示的参考。 

  possorted_bam.bam和possorted_bam.bam.bai   

这是经过序列比对生成的bam原始文件，由于ATAC数据的特殊性，有时候，我们可能会看比对后的原始bam的情况，bam查看可使用IGV软件进行查看，也可以使用samtools等软件进行检查。 

peaks.bed

cellranger-atac软件本身会进行peakcalling，将测定的fragments鉴定成peaks，这是ATAC、chip等这类染色体开发程度测定方法独有的计算方法。每个peaks是基因组上转座酶剪切位点局部富集的一个区间。 

Feature-Barcode Matrices 

同scRNA一样，有这几类文件和文件夹，但是会发现比scRNA的种类更多，比如： 

• raw_peak_bc_matrix.h5 

• raw_peak_bc_matrix 

• filtered_peak_bc_matrix.h5 

• filtered_peak_bc_matrix 

• filtered_tf_bc_matrix.h5 

• filtered_tf_bc_matrix 

raw_peak_bc_matrix.h5和raw_peak_bc_matrix，存放的是原始barcodes包含真实细胞和背景噪音一起的单细胞和鉴定peaks的矩阵信息。 

filtered_peak_bc_matrix.h5和filtered_peak_bc_matrix，存放的是进行cellcalling后过滤后被鉴定成真实细胞的单细胞和鉴定peaks的矩阵信息。 

filtered_tf_bc_matrix.h5和filtered_tf_bc_matrix，存放的是进行cellcalling后过滤后被鉴定成真实细胞的单细胞和鉴定的TF的矩阵信息。

fragments.tsv.gz和fragments.tsv.gz.tbi

这个文件是保留了每个细胞单独Tn5酶捕获的fragments片段的具体情况，不仅仅是peaks峰，peakcalling可以根据这个fragments文件的具体结果分析获得每个细胞每个peaks的峰值。因此，这类文件较为原始，往往会用作后续分析过程中。

  peak_annotation.tsv

这是peak的注释文件，这里面包含了peaks上下游位置可能相关联的基因，每个peak可能是该基因的什么元件类型的描述信息。这个和上述peaks文件是一一对应的。

下游分析需要的文件

正常情况下，对于我们下游分析具体数据而言，哪些文件是必不可少的呢？

一般来说。filtered_peak_bc_matrix.h5和filtered_peak_bc_matrix是两者二选一是必须的。

此外fragments.tsv.gz和fragments.tsv.gz.tbi也是需要在内的。这样获取的结果才是相对比较完整的，可用于后续下游数据分析。

此外，singlecell.csv文件最好也是拥有，这样对scATAC数据质控信息有所了解。

因此，我们关于scATAC的数据尽量要保证上述三类文件存在。 以Seurat扩展包Signac为例：

创建一个完整的scATAC的数据对象

counts <- Read10X_h5(filename = "10k_pbmc_ATACv2_nextgem_Chromium_Controller_filtered_peak_bc_matrix.h5")metadata <- read.csv(  file = "10k_pbmc_ATACv2_nextgem_Chromium_Controller_singlecell.csv",  header = TRUE,  row.names = 1)chrom_assay <- CreateChromatinAssay(  counts = counts,  sep = c(":", "-"),  fragments = "10k_pbmc_ATACv2_nextgem_Chromium_Controller_fragments.tsv.gz",  min.cells = 10,  min.features = 200)pbmc <- CreateSeuratObject(  counts = chrom_assay,  assay = "peaks",  meta.data = metadata)