文档文本内容
3.2 基因工程的基本操作程序
知识梳理
教学目标
课程标准 目标解读
基因工程是一种重组DNA技术。 1. 阐明基因工程的原理和基本操作程序。
1. 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因 2. 针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的
的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体 基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因
细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 产品的方案。
3. 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的
产物。
教学重点
1.基因工程基本操作程序的四个步骤。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。
教学难点
1. 利用PCR获取和扩增目的基因。
2. DNA片段的扩增及电泳鉴定。
第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。也指能
够编码特定蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2.筛选目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一
3.获取目的基因：
（1）人工合成
（2）基因文库中获取目的基因
（3）利用PCR获取和扩增
①PCR：PCR全称为聚合酶链式反应，又叫做体外DNA扩增技术。根据DNA半保留复制的原理，在体外
提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。通过这项技
术可在短时间内大量扩增目的基因。
②PCR利用的原理：DNA半保留复制③DNA复制的基本条件：
④PCR的前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
⑤PCR的条件：
DNA模板（需含有目的基因）。
分别与模板DNA相结合的2种引物。
四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
能严格控制温度的温控设备。
⑥PCR的过程：
⑦PCR的结果：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）
⑧鉴定PCR的产物：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子基因表达载体构建过程：一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接
酶将两者连接。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内稳定存在和表达的过程。2.将目的基因导入受体细胞的方法：
（1）花粉管通道法：
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉
管通道进入受体细胞。
（2）农杆菌转化法：
①农杆菌的特点：
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子
叶植物没有感染能力。
当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌
中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。
②农杆菌转化法的原理：根据农杆菌的特点，将目的基因插入Ti质粒上的T-DNA中，通过农杆菌的转化
作用，就可以使目的基因进入细胞。
③农杆菌转化法适用于那些植物：农杆菌转化法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌转化在一些
单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
3.方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的
染色体DNA上→目的基因表达。
第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中：DNA分子杂交或PCR等技术。
基因探针：简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂）、且顺序已知的、与
目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。将转基因生物的基因组DNA提取出
来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。
(2)检测目的基因是否转录：分子杂交或PCR技术。
将转基因生物提取出来的mRNA和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经转录。
(3)检测目的基因是否翻译出蛋白质：抗原—抗体杂交技术。
从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。
2.个体水平的鉴定
(1) 抗虫或抗病的接种实验。
(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA片段扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够
自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这
些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
3.PCR 产物的鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过
染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
课后培优练级
练
培优第一阶——基础过关练
一、单选题
1. 人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程不涉及（）
A. 用适当的酶对胰岛素基因与载体进行切割并拼接
B. 把重组后的DNA导入受体细胞内
C. 检测重组DNA是否导入受体细胞内并表达出相应的性状
D. 检测目的基因是否发生结构上的改变
2. 盐害是全球水稻减产的重要原因之一，中国水稻研究所等单位的专家通过农杆菌中的质粒将
CMO基因、BADH基因、mtld基因、gutD基因和SAMDC基因5个耐盐基因导入水稻，获得了一批
耐盐转基因植株。有关耐盐转基因水稻培育的分析正确的是（ ）
A. 该转基因水稻与原野生型水稻存在生殖隔离
B. 该基因工程所需的限制性核酸内切酶可能有多种
C. 只要目的基因进入水稻细胞，水稻就会表现出抗盐性状
D. 可通过将水稻种植到有农杆菌的土壤中观察目的基因是否表达
3. 为获得抗病的马铃薯往往采用转基因技术，将相关抗病基因转移到马铃薯体内．其过程大致如图
所示．下列相关叙述，正确的是（ ）A. 图中①过程涉及两种工具酶，目的基因插入的位置为T-DNA所在的区段
B. 图中②过程，农杆菌需经镁离子溶液处理，处理后的细胞处于感受态
C. 图中③④过程，所用培养基中应添加两种激素，添加顺序对细胞的分化方向无影响
D. 检测相关抗病基因是否在受体细胞内转录，可采用抗原-抗体杂交法
4. 将某病毒的外壳蛋白（L ）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建L-GFP融合基因，再将
1 1
融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。图中限制酶E-E 处理产生的黏性末端均不相同。下列叙
1 4
述不正确的是（ ）
A. 构建L-GFP融合基因需要用到E、E、E 三种酶
1 1 2 4
B. E、E 双酶切确保L-GFP融合基因与载体的正确连接
1 4 1
C. GFP可用于检测受体细胞中目的基因是否表达
D. 将表达载体转入乳腺细胞培育乳汁中含L 蛋白的转基因羊
1
5. 图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo
表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是（ ）
A. 图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B. 在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C. 用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以保证重组DNA序列的唯一性
D. 导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
6. 转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有 PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点，同时质粒中含有卡那霉素的抗性基因。以下叙述正确的是（ ）
A. 可以在香蕉组织块的培养基中加入卡那霉素，以筛选成功导入重组质粒的农杆菌
B. 过程中构建的重组质粒除了目的基因和标记基因还应该包含起始密码子和终止密码子
C. 构建含抗病基因的重组DNA分子A时，应选用的限制酶有PstⅠ、EcoRⅠ
D. 转基因抗病香蕉实质是人为基因重组，具有不定向变异的特点
7. 关于基因工程下列说法正确的有（ ）
①重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工
③限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列
④只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达
⑤所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
⑥基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上
⑦质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的载体
A. 2项 B. 3项 C. 4项 D. 5项
8. 下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A. 这三种方法都用到酶，都是在体外进行 B. ①②③碱基对的排列顺序均相同
C. 图示a、b、c三种方法均属人工合成法 D. 方法a不遵循中心法则
9. 甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二
者杂交后得到F ，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果
1
的叙述，错误的是（）A. 将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B. 通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C. 调整培养基中植物激素比例获得F 花粉再生植株
1
D. 经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
10. 用某人胰岛素基因制成DNA探针，用来检测下列物质，不能形成杂交分子的是（ ）
A. 该人胰岛A细胞中的DNA B. 该人胰岛B细胞的mRNA
C. 该人胰岛A细胞的mRNA D. 该人肝脏细胞中的DNA
二、填空题
11. 人参是一种名贵药材,具有良好的滋补作用。口服α- 干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治
疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程,①~④表示相关的操
作,EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶,它们的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题:
(1) 步骤①中,利用PCR技术扩增干扰素基因时,设计引物序列的主要依据是____________。科研人员
还在两种引物的____端分别加上了____________和____________序列,以便于后续基因的剪切和连接。
(2) 过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________。
(3) 过程④中,科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后,先通过______过程获得DNA,再进行PCR扩增,若
最终未能检测出干扰素基因,其可能原因是_____________________。
(4) 科研人员认为,将转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好,其依据是
________________。
12. 如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。请回答：
（1）A→B 利用的技术称为______________________________，其中②过程需要热稳定的
____________________酶才能完成。
（2）图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建_____________，该过程中，要将
目的基因插入Ti质粒的_______________中。
（3）上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是____________法，该方法一般
__________________(填适宜或不适宜)用于将目的基因导入单子叶植物。
（4）欲确定抗虫基因是否整合G的染色体DNA上，可以用______________检测。如果抗虫基因导入
成功，且与某条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一
代，预计后代中抗虫植株占__________。
培优第二阶——拓展培优练
一、单选题
1. 科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶主要蛋白。以下有关基因工程的叙述错误
的是（ ）
A. 在基因工程中，PCR技术可用于任何目的基因的获取，且能迅速获得大量目的基因
B. 启动子对于目的基因在块茎中的表达是不可缺少的
C. 应用DNA探针技术，可以检测转基因马铃薯植株中目的基因的存在及其转录产物
D. 用同一种限制酶，分别处理质粒和含目的基因的DNA，可用DNA连接酶连接形成重组DNA分子
2. 乙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒分别是乙型肝炎、戊型肝炎的病原体，病毒结构见下图。研究人员
用基因工程技术获得了两种含肝炎病毒抗原基因（DNA序列）的细胞，用转基因细胞来生产病毒表面
蛋白抗原，然后制备成疫苗，用于肝炎的预防。下列说法正确的是（）A. 获得的两种肝炎疫苗在人体内都不能复制，需多次接种
B. 获取两种肝炎病毒的抗原基因都必需要用到逆转录酶
C. 获取的两种肝炎病毒抗原基因都可以直接转入受体细胞中进行表达
D. 用抗原-抗体杂交法可确定肝炎病毒抗原基因是否插入到受体细胞DNA上
3. 某制药公司研制了基于DNA的个性化新生抗原靶向疫苗，并用于相关癌症治疗。该公司依据不
同癌细胞的特点合成出能编码一个或多个新生抗原的DNA片段。该DNA片段导入人体细胞后，可产
生相应的新抗原，新抗原能激活机体的免疫系统，诱导人体产生特异性免疫应答。据此判断，下列叙
述错误的是（）
A. 获取新生抗原基因可在癌细胞内提取相应的mRNA，通过反转录获取cDNA
B. 由mRNA在细胞内逆转录获取的cDNA中含内含子
C. 利用PCR技术扩增新生抗原基因时需要设计2种引物
D. 检测受体细胞中的新生抗原基因是否成功表达可采用抗原-抗体杂交技术
4. 动物乳腺生物反应器是一项利用转基因动物的乳腺代替传统的生物发酵，进行大规模生产可供治
疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技术。目前科学家已在牛和羊等动物的乳腺生物反应
器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品，大致过程如图所示。下列有关说法错误
的是（）
A. 通过③形成的重组质粒具有人的药用蛋白基因、启动子、终止子和标记基因
B. ④通常采用显微注射法
C. 转基因母牛乳腺细胞中人的药用蛋白基因才会得以表达，因此可以从乳汁中提取药物
D. 该技术生产药物的优点是产量高、质量好、易提取
5. 下图表示利用细菌中抗虫基因培育抗虫玉米的过程，其中①～⑧表示操作步骤，a、b表示相关分子，c～e表示培养过程，其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养。下列有关叙述正确的是（）
A. 图中需要用到限制酶的是步骤①②③ B. 图中导入目的基因的是步骤④
C. 步骤⑤的主要目的是扩增目的基因 D. 脱分化和再分化的步骤分别是⑦和⑧
6. 蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强度的抗张蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，
有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造肌腱。科学
家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因蜘蛛羊作为乳腺生物反应器。下列有关乳腺生物反应
器的说法，错误的是（）
A. 将蜘蛛丝蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等结合在一起构建成表达载体
B. 可通过显微注射技术将表达载体导入羊的受精卵中
C. 可用丝蛋白基因探针与该羊口腔上皮细胞mRNA杂交，检测目的基因是否发挥作用
D. 上述培育转基因蜘蛛羊的过程涉及到基因工程、动物细胞培养、胚胎移植等技术
7. 下图是基因文库的构建和获取目的基因的示意图。
下列叙述正确的是（ ）A. 通过该途径获得的目的基因，通常是序列已知的
B. ①过程通常只用一种DNA酶切割全部DNA
C. ③过程需用CaC1 处理，使大肠杆菌细胞处于易于吸收周围DNA分子的状态
2
D. ④过程可用相应抗体，利用核酸分子杂交技术获取目的基因
8. 将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如图所示。下
列叙述不正确的是（ ）
A. 过程①需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶
B. 过程②可用含有卡那霉素的培养基筛选含重组Ti质粒的农杆菌
C. 采用DNA分子杂交可检查出过程③中含Bt基因的细胞
D. 检验转基因棉的抗虫性状，常用的方法是检测其是否含有Bt蛋白
9. 环境雌激素(EEs)影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在EEs的诱导下，会表达出卵黄蛋白原
(vtg)。已知绿色荧光蛋白(GFP)基因能使斑马鱼发光，欲获得能检测水中是否含有EEs的转基因斑马
鱼，下列操作合理的是（ ）
A. 将EEs基因的启动子与GFP基因重组B. 将vtg基因的启动子与GFP基因重组
C. 将GFP基因的启动子与GFP基因重组 D. 将GFP基因的启动子与vtg基因重组
二、填空题
10. IKK激酶由 IKk ，IKK 和IKK 三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分
化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致，
IKK 上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如图1、2。分析回答:
(1)在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物:
引物A:5ˈ- CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3ˈ(下划线字母为突变碱基)
引物B:5ˈ- ITAAGCTTCGAACATCCTA-3ˈ(下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列)
引物C:5ˈ- GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3ˈ(下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列)
则PCR 中使用的引物有 ，PCR 中使用的引物有 和图中大引物的
1 2
(①/②)链。
(2)在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKB基因外，还需要加入 等。PCR中尽可能提
高退火温度以减少 。
(3)图2模型鼠培育过程中杂合模型鼠(F )的培育涉及了一系列现代生物技术，下表是其中的
0
一些步骤，请根据题意完成表格内容。
(4) 根据图2杂交结果，可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的 上，在遗传时
遵循 定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋巴细胞中组成 IKK激酶的三种亚基进行提
纯和电泳，结果如图3。请依据此结果提出SCID患者免疫缺陷产生的机制： 。11. 某特殊病毒为RNA病毒，易引起大规模流行。科学家发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，
主要环节如下。
环节1： 环节2： 环节3：
改造病毒的部分基因，使其失去 构建适合改造病毒增殖的 利用转基因宿主细胞
在正常细胞内的增殖能力 转基因宿主细胞 制备疫苗
请回答下列问题：
（1）环节1中，以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某
些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的
基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基
因、表面抗原基因等其他基因构建重组质粒，并保存。
（2）环节2中，设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与环节1中的终止密码子配对
结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________拼接后导入宿主细胞。提取宿主细胞总
的________（填“DNA”或“RNA”）进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主
细胞。
（3）将环节1中的重组质粒导入环节2中的转基因宿主细胞，并在补加________的培养基中进行培养，
则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制
备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________（填“病毒的RNA聚合酶”或“宿主
的RNA聚合酶”）。
（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。
与不具侵染性的灭活病毒疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是还可引起________（填“体液”或
“细胞”）免疫，增强免疫保护效果。培优第三阶——高考沙场点兵
一、单选题
1. 土壤农杆菌是基因工程中将目的基因导入植物细胞时常用的中间媒介．它含有一个大型的Ti质粒
（如图所示），在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段转入植物的基因组．若想用基因工程
并通过土壤农杆菌向某种植物中导入抗旱基因，以下分析不合理的是（ ）
A. 若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在 T-DNA 片段内，且要保证复制起
始点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏
B. 将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用CaCl 处理细菌以增加细胞壁的通透性
2
C. 用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染正在组织培养中的植物细胞，再将被感染后的细胞培养成
植株，就可能获得具有抗旱基因的植物
D. 若能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，则说明该基因工程项目获得成功
2. 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的核酸检测主要通过荧光定量PCR进行，核酸检测可能存在“假
阴性”现象，下列情况最不可能导致假阴性的是（ ）
A. 病毒由呼吸道转移到肺泡
B. 咽拭子采集时取样的深度不够
C. 患者病毒载量较低
D. 标本转运时间过长，病毒RNA降解
3. 利用基因工程手段将Myc和Ras两种癌基因导入小鼠体内，检测转基因小鼠的癌症发病率，结果
如图所示。进一步研究发现，乳腺和唾液腺的癌变率较高的。下列说法正确的是（ ）
A. 可用农杆菌转化法将癌基因导入小鼠体内
B. 两种癌基因共同作用使细胞更易发生癌变
C. 只要有Myc或Ras基因，细胞就会癌变
D. Myc和Ras基因的表达没有组织特异性4. 重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR
扩增，从而获得目的基因的方法。某科研团队运用重叠延伸 PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入
特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、
AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图所示。下列说法错误的是（ ）
注：引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
A. 过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等
B. 若引物2的突变位点设计为A，则引物3的突变位点应设计为G
C. 经过过程④获得的杂交DNA有2种，只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因
D. 以过程⑤获得的目的基因为模板，可以使用引物1和引物4进行PCR5. 通过设计引物，运用PCR技术可以实现
目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获
取突变基因的过程，其中引物1序列中含有
一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不
影响引物与模板链的整体配对，反应体系中
引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a
和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是
（ ）
A. 在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq酶等
B. 第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
C. 引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入运载体
D. 第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占
6. 科研人员利用PCR技术扩增X基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR循
环后产生五种DNA分子，如图乙所示。下列叙述正确的是（ ）A. 利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程
B. 如果加入大量引物1和引物2，会干扰正常的PCR过程
C. ⑤片段最早出现在第三轮复制后，且会出现1个⑤片段
D. 经过第二轮PCR后会出现①、②、③、④4种DNA分子
7. 递减 PCR 是常规 PCR 技术的发展，下图表示递减 PCR 各阶段温度及时间控制。相关叙述错
误的是（ ）
A. PCR 反应体系中应加入 Taq 酶、模板 DNA、dNTP、引物、缓冲液等物质
B. 第 1 阶段的目的是使模板 DNA 充分解旋，减少 DNA 复杂结构对扩增的影响
C. 第 2 阶段中退火温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第 3 阶段提供更 多正确的模板
D. 第 4 阶段 72℃下维持 10min，主要目的是使子链与互补模板链结合形成双螺旋
8. PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，
下列有关叙述错误的是（ ）
A. 都遵循碱基互补配对原则
B. DNA聚合酶作用的最适温度不同C. 都是边解旋边复制的过程
D. 复制方式都是半保留复制
9. 荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是：在PCR反应体系中每加入一对
引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，
使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。相关叙述错误的是
（ ）
A. 引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B. Taq酶可以催化子链沿着3’→5’方向延伸，需dNTP作为原料
C. 反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
D. 若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
二、填空题
10. WWP2基因在肿瘤细胞中高度表达，WWP2蛋白参与肿瘤细胞的生长、存活和转移等。为获得
较多WWP2蛋白，利用基因工程技术设计引物，其中正向引物5′含有EcoRI酶切位点，反向引物5′含
有XhoI酶切位点。将WWP2基因与相应载体构建重组质粒导入人胚肾细胞。回答下列问题：
（1）利用上述的引物，以肺癌细胞的cDNA为模板，通过______扩增______的编码序列，获得需要
的目的基因片段。
（2）把获得的目的基因片段和相应载体，都用______进行酶切，分别在5′端与3′端形成______，避免
自身环化。然后利用______将目的基因片段和相应载体连接，得到重组质粒。
（3）先将重组质粒导入经______处理过的大肠杆菌细胞，培养后从中分离得到较多的重组质粒。
（4）培养人胚肾细胞时，先用______使人胚肾细胞分散成单个细胞，用含有______的合成培养液培
养，并将培养瓶置于体积分数为5%的______与空气混合气体的培养箱中培养。
（5）将重组质粒导入人胚肾细胞中，48小时后提取蛋白质并检测到WWP2蛋白，说明______。（6）致癌因子会损伤肺泡细胞中的______，使原癌基因和抑癌基因发生突变。研究WWP2蛋白的表
达，为肺癌治疗新靶点奠定了基础。
11. 复合型免疫缺陷症（SCID）患者缺失ada基因，利用利用现代生物工程技术将人正常ada基因转
入患者自身T细胞，可改善患者的免疫功能。如图显示该过程的主要步骤，回答下列问题：
（1）图中所示获取正常ada基因的方法是从基因文库中获取目的基因，基因文库包括基因组文库和
______。若要大量获取该目的基因，可通过PCR技术迸行扩增。PCR技术是利用______的原理，将基
因的核苷酸序列不断加以复制。
（2）与细胞内DNA复制过程相比，PCR技术的不同点有：需要______DNA聚合酶作为催化剂将引
物与目的基因DNA单链结合，另一个不同之处表现在温度控制方面，在 PCR中先用90～95 ℃左右
高温处理的目的是______，而这一过程在细胞内是通过______的催化作用实现的。
（3）将人正常ada基因转入患者自身T细胞进行治病的方法叫做______。
（4）步骤②是______。在该步骤中，病毒DNA作为______起作用，需使用的工具酶有______。
