文档内容
3.1 重组 DNA 技术的基本工具
知识梳理
教学目标
课程标准 目标解读
基因工程是一种重组DNA技术。 1. 阐明重组 DNA 技术所需的三种基本工具的作
1. 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学 用。
和分子生物学等学科基础上发展而来的。 2. 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技
2. 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性核酸 术创新。
内切酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 3. 进行DNA的粗提取和鉴定。
教学重点
1.重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
2.DNA粗提取和鉴定。
教学难点
1. 基因工程载体需要具备的条件。
2. DNA的粗提取和鉴定。
一、基因工程
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类
型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作
重组DNA技术、基因拼接技术。
操作对象：基因
操作水平：DNA分子水平
操作原理：基因重组
操作环境：体外
基本过程：剪切→拼接→导入→表达
操作结果：定向地改造生物的遗传性状，获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
优点：定向改造生物体的性状，目的性强（与诱变育种相比）
育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍（与杂交育种相比）二、基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要从原核生物中分离出来。
（2）种类：约4000种
（3）作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷
酸二酯键断开。
（4）限制酶识别序列的长度最常见的为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个、或其他数
量的核苷酸组成。
①在中轴线两侧切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，为6个核苷酸，并在G和
A之间切开。
②在中轴线处切割，形成平末端。如：Sma I限制酶能识别CCCGGG序列，为6个核苷酸，并在G和C之
间切开。2.“分子缝合针”—— DNA连接酶
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。即把脱氧
核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口连接起来。
(2)类型：
3.“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
（1）载体作用：将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
（2）载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等
（3）最常用载体：质粒
特点：
①裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链
DNA。
②有一个至多个限制酶切割位点。
③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。④有特殊的标记基因，如：抗生素的抗性基因（四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)等）、
荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
⑤对细胞无毒无害。
⑥大小适中，便于提取和操作。
三、DNA的粗提取与鉴定
（一)提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
DNA粗提取的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取
DNA，去除其他成分。
（二)提取DNA的基本原理
1.DNA在NaCl中的的溶解性：
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，
DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为
2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA
在盐溶液中溶解或析出。
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
（1）对酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
（2）对温度的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
（3）对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响。
3.DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。
（三）DNA的鉴定沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
课后培优练级
练
培优第一阶——基础过关练
一、单选题
1. 下列有关基因工程的说法不正确的是（）
A. 基因工程得以实现的原因之一是不同的生物DNA的结构相同
B. 限制酶和DNA连接酶作用的化学键相同
C. EcoliDNA连接酶可以连接黏性末端和平末端
D. 质粒存在于原核细胞和某些真核细胞中
【答案】
C
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的知识点，熟知基因工程的原理和操作工具是解题的关键，题目难度适中。
【解答】
A.基因工程得以实现的原因之一是不同的生物DNA的结构相同，A正确；
B.限制酶和DNA连接酶作用的化学键相同，都是磷酸二酯键，B正确；
C.E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起
来；而TDNA连接酶来源于T 噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，C错误；
4 4
D.质粒一般存在原核细胞体内，但是真核细胞也有，比如酵母菌，酵母菌的质粒存在于细胞质中，D
正确。故选C。
2. 我国科学家将含有人凝血因子基因的DNA片段注射到羊的受精卵中，由该受精卵发育而成的羊，
分泌的乳汁中含有人的凝血因子，可治疗血友病。下列叙述错误的是( )
A. 该羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子基因
B. 该羊的后代也可能含有人的凝血因子基因
C. 这项研究说明人和羊共用一套遗传密码
D. 这项技术的工具包括限制酶、DNA连接酶和运载体
【答案】
A
【解析】
【分析】
本题考查基因工程及其应用相关知识，意在考查学生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力，
本题解题关键是理解凝血因子是基因表达产物。
【解答】
A.凝血因子基因不会进入到的羊分泌的乳汁中，A错误；
B.该羊是由转基因受精卵发育而成的羊，因此其生殖细胞中可能含有人凝血因子基因的 DNA片段，
可能传递给后代，B正确；
C.自然界中所有生物都共用一套遗传密码，这是生物界共性，C正确；
D.基因工程所使用的工具包括限制酶、DNA连接酶和运载体，D正确。
故选A。
3. 下列提到的物质不是基因工程常用的工具的是（）
①限制性核酸内切酶 ②DNA聚合酶 ③DNA连接酶 ④运载体 ⑤解旋酶．
A. ②④⑤ B. ①③④ C. ①②③ D. ②⑤
【答案】
D
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的工具，要求考生识记基因工程常用的工具及其作
用，能根据题干要求做出准确的判断，属于考纲识记层次的考查。DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
1、限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷
酸之间的磷酸二酯键断裂。
2、DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3、运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【解答】
①限制性核酸内切酶是基因工程常用的工具，用于获取目的基因和构建基因表达载体，①错误；
②DNA聚合酶不是基因工程常用的工具，②正确；
③DNA连接酶是基因工程常用的工具，用于构建基因表达载体，③错误；
④运载体是基因工程常用的工具，用于将目的基因导入受体细胞，④错误；
⑤解旋酶不是基因工程常用的工具，⑤正确。
故选D。
4. 下列有关基因工程基本工具的叙述,错误的是 ( )
A. DNA连接酶与限制酶作用的化学键相同
B. 限制酶可以对烟草花叶病毒的核酸进行切割
C. 载体质粒的复制和表达也遵循中心法则
D. E·coli DNA连接酶来自大肠杆菌,只能连接黏性末端
【答案】
B
【解析】
【分析】
本题考查基因工程基本工具相关知识，意在考查学生的识记与理解能力。
【解答】
A.DNA连接酶与限制酶都作用于磷酸二酯键，A正确；
B.烟草花叶病毒的核酸是RNA，限制酶切割的是DNA，B错误；
C.质粒是一种小型环状DNA分子，其复制和表达的过程也遵循中心法则，C正确；
D.E·coli DNA连接酶是从大肠杆菌中分离获得的，它只能连接黏性末端，D正确。
5. 某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体
结合后导人马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程
的叙述，正确的是（）A. 获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B. 基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C. 连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D. 一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
【答案】
A
【解析】
【分析】
本题考查基因工程，意在考查学生对知识的理解和记忆能力、分析题图获取信息的能力。
图中为某DNA分子片段，其中①部位为磷酸二酯键，是限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶的作用位
点；②部位为氢键，是解旋酶的作用位点。
【解答】
A.获取基因a的限制酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，A正确；
B.基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，B错误；
C.连接基因a与运载体的DNA连接酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，C错误；
D.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，D错误。
故选A。
6. 下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是（）
基因供体 基因剪刀 基因针线 运载体 受体细胞
A 提供目的基因的生物 限制酶 DNA连接酶质粒 大肠杆菌等
B 提供目的基因的生物 DNA连接酶 限制酶 质粒 大肠杆菌等
C 质粒 限制酶 DNA连接酶提供目的基因的生物 大肠杆菌等
D 大肠杆菌等 DNA连接酶 限制酶 提供目的基因的生物 质粒
A. A B. B C. C D. D
【答案】
A【解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作工具和操作步骤，能正确区分供
体、受体，再结合所学的知识做出准确的判断。
1、基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和
转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核
苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【解答】
基因工程中，供体是提供目的基因的生物，分子手术刀是限制性核酸内切酶，分子缝合针是 DNA连
接酶，载体常用质粒、噬菌体和动植物病毒，受体是大肠杆菌等。
故选A。
7. 下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是( )
①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接 ②催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接 ③催化
两个黏性末端互补碱基间氢键的形成 ④催化两个核苷酸之间的磷酸二酯键的形成
A. ①③ B. ②④ C. ②③ D. ①④
【答案】
D
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的原理及技术，意在考查学生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形
成知识的网络结构。
DNA重组技术至少需要两种工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、运载体；限制酶：能够识别
双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
断裂；DNA连接酶：两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成重组DNA。
【解答】
①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接，形成磷酸二酯键，①正确；②不同黏性末端的DNA片段之间不能连接，②错误；
③两个黏性末端互补碱基间氢键不需要酶的催化，③错误；
④DNA连接酶催化两个核苷酸之间的磷酸二酯键的形成，④正确；
综上所述，②③错误，①④正确，ABC错误，D正确。
故选D。
8. 大肠杆菌经溶菌酶和阴离子去垢剂（SDS）处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一
段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。下列关于质粒的粗提取和鉴定的
分析错误的是（ ）
A. DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的DNA
B. DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
C. 用限制酶I和Ⅱ处理提取的产物，电泳出现图结果，说明未提取到质粒
D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
【答案】
C
【解析】
【分析】
本题考查基因工程和质粒DNA的提取和鉴定，需要掌握实验的目的，流程及注意事项，需【解答】
1、DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的
试剂。
2、DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA
进一步分离。
A、通过分析可知，DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的
DNA，A正确；
B、DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，这样可以去除DNA中的某些杂质，提取的DNA可用二苯胺试剂在沸水加热条件下生成蓝色，B正确；
C、限制性酶Ⅰ和限制性酶Ⅱ处理提取的产物，只得到一条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质
粒，C错误；
D、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果，D正确。
故选：C。
9. 如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、
DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（ ）
A. ①②③④ B. ①②④③ C. ①④②③ D. ①④③②
【答案】
C
【解析】
【分析】
本题考查了不同酶作用原理的相关知识。意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联
系，形成知识网络结构的能力。此题容易混淆，基本知识必须扎实，易混知识必须区分清楚。
【解答】
1.限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两
个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，如①形成末端；
2.DNA聚合酶将一个个脱氧核苷酸连接起来，形成子链，如④；
3.DNA连接酶是同时连接DNA双链的切口，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，如②；
4.解旋酶是解开两条链之间的氢键，如③。
综上所述，C正确，ABD错误。
故选C。
二、填空题
10. 实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作，请根据表格回答问题。试管 A B
1 加2mol/L的NaCl溶液5mL 加2mol/L的NaCl溶液5mL
2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌
3 加4mL二苯胺，混匀 加4mL二苯胺，混匀
4 沸水浴5min 沸水浴5min
实验现象 ① ②
实验结论 ③
（1）根据上图，完成表格空白处的实验内容。
①______________________________________________________________________________；
②______________________________________________________________________________；
③______________________________________________________________________________。
（2）对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？______________________________。
（3）在沸水浴中加热的目的是_____________________________________________________，同
时说明DNA对高温有较强的____________。
（4）A试管在实验中的作用是____________。
（5）B试管中溶液颜色的变化程度主要与______________________________________有关。
【答案】
（1）溶液不变蓝色；溶液逐渐变蓝色；DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色（2）溶液颜色
基本不变
（3）加快颜色反应速度；耐受性
（4）对照
（5）加入试管中的DNA的多少11. 人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的过程，
图中Tetr表示四环素抗性基因，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，五种限制酶的识别序列及切割位点如
表所示，请回答以下问题：
限制酶 BamHⅠ HaeⅢ BclⅠ Sau 3A Ⅰ NotⅠ
识别序
列
及切割
位点
（1）①过程常采用的方法是_______。
（2）要将人乳铁蛋白基因插入质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是_____。
（3）据图分析，筛选含有重组质粒的受体细胞首先需要在含_______（填“四环素”或“氨苄青霉
素”或“四环素或氨苄青霉素”）的培养基上进行。
（4）若BamH I酶切的DNA末端与BclI酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为
____________，对于该部位，这两种酶________（“都不能”或“只有一种能”）切开。
【答案】
（1）显微注射法
（2）Sau3AⅠ
（3）氨苄青霉素
（4） ；都不能
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的知识点，熟知基因工程的原理和操作过程是解题的关键，题目难度适中。
【解答】（1）①过程将目的基因导入动物细胞，常采用的方法是显微注射法。
（2）从表中可知，Sau3AⅠ可以切割限制酶BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，因此要将人乳铁蛋白基因插入
质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是Sau3AⅠ。
（3）据图分析，Sau3AⅠ切割破坏了四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，所以筛选含
有重组质粒的受体细胞首先需要在含氨苄青霉素的培养基上进行。
（4）若BamH I酶切的DNA末端与BclI酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为
，对于该部位，这两种酶都不能切开。
故答案为：
（1）显微注射法
（2）Sau3AⅠ
（3）氨苄青霉素
（4） ；都不能
培优第二阶——拓展培优练
一、单选题
1. 关于基因工程下列说法正确的有（）
①限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 ②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工 ③
重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和运载体 ④只要目的基因进入受体细胞就能成
功实现表达 ⑤所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 ⑥基因工程可以将一种生物的优
良性状移植到另一种生物身上 ⑦质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的运载体
A. 2项 B. 3项 C. 4项 D. 5项
【答案】
A
【解析】
【分析】
本题属于简单题，属于考纲中识记层次的要求，考查了基因工程的工具和操作步骤等方面的知识，要
求考生能区分工具和工具酶，并且理解细菌作为受体细胞的优点等知识。1、基因工程：是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外 DNA重组和转基因等技术，赋予
生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细
胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微
注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基
因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】
①一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，其具有特异性，所以限制酶的切口不都是GAATTC
碱基序列，①错误；
②基因工程又称转基因技术，是在DNA上进行的分子水平的设计施工，②正确；
③重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，运载体不属于工具酶，③错误；
④目的基因进入受体细胞需要检测和鉴定，不一定能成功实现表达，④错误；
⑤一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，即具有特异性，⑤错误；
⑥基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外 DNA重组和转基因等技术，赋予生
物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，因而可以将一种生物的
优良性状移植到另一种生物身上，⑥正确；
⑦基因工程常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等，⑦错误。
综上，A正确，BCD错误。
故选A。
2. 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位
点。下列说法正确的是（）A. 重组 DNA 技术所用的工具酶是限制酶、DNA 连接酶和运载体
B. 只有用同种限制酶切割 DNA 产生的粘性末端才能互补
C. 用图中质粒和外源基因 DNA 构建重组质粒，可使用 SmaⅠ切割
D. 使用 EcoRⅠ同时处理质粒和外源 DNA，可能会发生质粒或者目的基因的自身环化
【答案】
D
【解析】
【分析】
本题考查了基因工程的工具和操作步骤等方面的知识，要求考生能认真审题并区分工具和工具酶、熟
悉基因工程的操作步骤等知识是解题关键。DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限
制酶）、DNA连接酶、运载体。每一种限制酶都具有特异性。
【解答】
A.重组 DNA 技术中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶，运载体不属于工具酶，A错误；
B.可用同种限制酶切割DNA 产生互补的粘性末端，也可用双酶切法切割DNA产生互补的粘性末端，
B错误；
C.若使用SmaⅠ切割质粒和外源基因DNA 会导致质粒中抗生素抗性基因（标记基因）和目的基因被破
坏，C错误；
D.使用 EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA，可能会产生质粒与质粒的结合、目的基因与目的基因的结
合即自身环化，D正确。故选D。
3. 番茄红素（C H ）是一种重要的类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性，能防止动脉粥样硬化和
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冠心病等，目前利用基因工程生产的大肠杆菌能大量生产番茄红素。据此有关的下列叙述，正确的是
（ ）
A. 该大肠杆菌细胞内含4种碱基、4种核苷酸
B. 番茄红素在核糖体上合成，经加工分泌到细胞外
C. 该大肠杆菌可遗传变异来源有基因突变和基因重组
D. 基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和运载体
【答案】
C
【解析】A、大肠杆菌细胞内含有两种核酸: DNA和RNA，DNA中含有A、C、G、T四种碱基，
RNA中含有A、C、G、U四种碱基，因此该大肠杆菌细胞内含5种碱基、8种核苷酸（4种脱氧核苷
酸和4种核糖核苷酸)，A错误;
B、核糖体是蛋白质合成的场所，番茄红素是一种类胡萝卜素，不属于蛋白质，B错误;
C、由题意"利用基因工程生产的大肠杆菌能大量生产番茄红素"可知:该大肠杆菌可遗传变异来源有基
因突变和基因重组，C正确;
D、基因工程常用的工具有限制酶、DNA连接酶和运载体，其中限制酶和DNA连接酶属于工具酶，D
错误。
故选C。
4. 下列关于载体的叙述中，错误的是（）
A. 载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B. 对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C. 目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
D. 载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
【答案】
D
【解析】
【分析】
关于运载体，考生可以从以下几方面把握：（1）常用的运载体：质粒（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA之外并具有自我复
制能力的双链环状DNA分子）、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
（2）作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），
以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且
要易从供体细胞分离出来。
（3）天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改
造的。
本题考查运载体的相关知识，要求考生识记基因工程常用的运载体种类，掌握基因表达载体的构建过
程及作为基因工程运载体需要具备的条件，能结合所学的知识作出准确的判断。
【解答】
A.运载体与目的基因结合后，就会形成一个重组DNA分子，A正确；
B.运载体中，对某种限制酶而言，最好只有一个切点，但还要有其他多种限制酶的切点，便于与目的
基因定向连接，B正确；
C.目前常用的运载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒，C正确；
D.运载体上要具有某些标记基因，便于筛选重组子，D错误。
故选D。
5. 某种线性DNA含有限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ的1个酶切位点。该DNA样品(甲)经EcoR Ⅰ酶切后，
在DNA连接酶催化下形成产物乙。则反应液中产物乙共有()
A. 1种 B. 2种 C. 3种 D. 4种
【答案】
C
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的原理及技术，要求考生掌握基因工程的工具酶，重点掌握限制酶和 DNA连接酶的特点及作用，明确DNA连接酶能够连接相同的黏性末端，最后选出正确的答案，考生易错选A项。
【解答】
根据题意可知，线性DNA含有限制性核酸内切酶EcoR I的1个酶切位点，因此经过该酶切割后会形
成两个相同的黏性末端，但是黏性末端两侧的序列不同，可以分别用 a和b表示。由于a和b具有相
同的黏性末端，因此利用DNA连接酶催化后，能够产生aa连接、bb连接、ab连接三种产物。
综上所述，C符合题意，ABD不符合题意。
故选C。
6. 据图分析，下列有关基因工程的说法不正确的是（ ）
A. 为防止目的基因与质粒任意结合而影响基因的表达，应用限制酶Ⅰ、Ⅱ同时切割二者
B. 限制酶、DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键
C. 与启动子结合的是RNA聚合酶
D. 能够检测到标记基因表达产物的受体细胞中，也一定会有目的基因的表达产物
【答案】
D
【解析】解：A、限制酶Ⅰ和酶Ⅱ识别的核苷酸序列不同，所以用限制酶Ⅰ和酶Ⅱ同时切割目的基因和质
粒可防止二者任意结合，A正确；
B、限制酶、DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键，前者是切割磷酸二酯键，后者是连接磷酸二酯
键，B正确；
C、启动子和终止子都是一段有特殊结构的DNA片段，其中启动子是RNA聚合酶的结合位点，能启
动转录过程，而终止子能终止转录过程，C正确；
D、重组DNA分子上的抗性基因可用于目的基因的检测与鉴定，但是有目的基因也不一定表达，D错
误。
故选：D。
基因表达载体的构建：
1、过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用 DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。
2、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。
3、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
（1）启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；
（2）终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；
（3）标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、工具、操作步骤及应用，掌握各步骤
中的相关细节，能运用所学的知识准确判断各选项，属于考纲识记和理解层次的考查。
7. 下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是（ ）
A. 甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B. 甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C. DNA连接酶的作用位点是b处
D. 切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段
【答案】
C
【解析】
【分析】
本题结合三种DNA片段，考查基因工程的相关知识，重点考查限制酶和DNA连接酶的相关知识，要
求考生识记限制酶的特点，能根据图中信息判断三种限制酶的识别序列；识记 DNA连接酶的作用，
能结合所学的知识准确判断各选项。
【解答】
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的，A正确；
B.甲、乙具有相同的黏性末端、可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能，B正确；
C.DNA连接酶的作用位点是磷酸二酯键a，不是氢键b，C错误；
D.切割甲的限制酶的识别序列和甲、乙片段形成的重组 DNA分子序列不同，因此切割甲的限制酶不
能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。故选C。
8. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序
列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据图判断下列操作正确的是
( )
A. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D. 质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
【答案】
D
【解析】
【分析】本题主要考查基因工程相关知识，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在
联系的能力。
【解答】
限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC-，可知限制酶II能
够识别和切割限制酶I切割后的黏性末端。据题图可知，目的基因两端分别是限制酶 I的识别序列和
切点是-G↓GATCC-和限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC-，只有用限制酶II才能将目的基因切割下
来。质粒有GeneI和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶II的识别序列和限制酶I的识别序列；
如果用限制酶II切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因；用限制酶 I切割，则
破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组
DNA，故选D。
9. 某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是 ( )A. 用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段
B. 不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C. 构建重组DNA时,需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D. 导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
【答案】
C
【解析】限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2
条DNA片段，A正确；AluⅠ的识别、切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的
基因，B正确；选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，质粒中的两个标记基因均会被破坏
C错误；选择HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环
素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基
上生长，D正确。
二、探究题（本大题共1小题，共15.0分）
10. 下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的
过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1 巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受
到诱导而表达[5'AOX1和3'AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子]．
资料2 巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，
其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，可以将目的基因整合于染
色体中以实现表达。（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上 ______ 、
______ 限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用 ______ 将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导
入大肠杆菌以获取 ______ ．
（3）步骤3中应选用限制酶 ______ 来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母
菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的
细胞中是否含有HBsAg基因，可以用 ______ 方法进行检测。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入 ______ 以维持其生活，同时诱导
HBsAg基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白
质合成后，细胞可以对其进行 ______ 并分泌到细胞外，便于提取．
【答案】
（1）SnaBⅠAvrⅡ
（2）DNA连接酶 大量重组质粒（重组质粒不得分）
（3）BglⅡ
（4）DNA分子杂交
（5）甲醇
（6）加工（修饰）
【解析】
【分析】
本题结合将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图，考查基因工程的原理及技术，要求考生识记基因工程的原理、工具及操作步骤，能结合题干和
图中信息答题，有一定难度。
分析题图：图中质粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ
位于终止子上。要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割质粒，要获取
含有5′AOX1--3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割。5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗
性基因，在培养基中加入卡那霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。
【解答】
（1）重组质粒上的目的基因若要表达，需要目的基因的首尾含有启动子和终止子。而 SnaBⅠ、AvrⅡ
识别的序列在启动子与终止子之间，只要在目的基因两侧 A和B位置分别接上这两种序列，并用
SnaBⅠ、AvrⅡ这两种内切酶对质粒和目的基因同时切割，便会各自出现相同的粘性末端，便于重组与
表达，同时防止自身环化，因此在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的识别序
列。
（2）①用DNA连接酶将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒；②导入大肠杆菌体内，
目的是利用大肠杆菌无性繁殖速度，短时间内可获取大量的重组质粒。
（3）重组DNA的两侧分别是启动子和终止子，除BglⅡ外，其它限制酶会破坏含有启动子、终止子
的目的基因。
（4）用DNA分子杂交技术检测是否导入目的基因。
（5）资料1显示，甲醇为该酵母菌的唯一碳源，同时诱导HBsAg基因表达。
（6）酵母菌为真核生物，细胞内具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体等细胞器，细菌等原核生
物，不具有内质网和高尔基体等细胞器。
培优第三阶——高考沙场点兵
一、单选题
1. 基因工程利用某目的基因（图甲）和Pl噬菌体载体（图乙）构建重组DNA．限制性核酸内切酶
的酶切位点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ．下列分析错误的是（ ）A. 构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3A I切割目的基因和Pl噬菌体载体
B. 构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和Pl噬菌体载体
C. 图乙中的Pl噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
D. 用EcoRⅠ切割目的基因和Pl噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
【答案】
D
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生获取图示信息的能力、审题能力以及分析能力；能理解
所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
分析图解：图甲中可以看出，在目的基因上存在三种酶切位点，只有EcoR I具有两个切点，而BglⅡ
和Sau3A I具有只有一个切点。图乙Pl噬菌体载体也具有这三种限制酶的切割位点。
【解答】
A.如果用 BglⅡ和Sau3A I切割目的基因，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用 BglⅡ和
Sau3A I切割Pl噬菌体载体也形成这两种相同的黏性末端，因此它们可构成重组 DNA，还可以防止它
们的自身环化和反向连接，故A正确；
B.构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和Pl噬菌体载体，但有部分重组DNA可能
没有目的基因，故B正确；
C.Pl噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoR I的切点，因此用EcoR I切割后，该环状DNA分
子变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸
基团，故C正确；
D.从图甲看出，用EcoR I切割目的基因后两端各有一切口，与图乙中EcoR I切口对接时，可能出现反
向连接，即有两种可能（正向连接和反向连接），即可产生两种重组DNA，故D错误。故选D。
2. 如图所示是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet
为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点．若要得到一个能在四环素培养基上
生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是（ ）
A. B. C. D.
【答案】
C
【解析】
【解答】
A、图中酶切位点在ori序列上，该序列被破坏，重组质粒将无法进行复制，因此受体细胞既不能在四
环素培养基上生长，也不能在氨苄青霉素培养基上生长，A错误；
B、图中酶切位点没有破坏三个基因，因此含重组DNA的细胞既能在四环素培养基上生长，也能在氨
苄青霉素培养基上生长，B错误；
C、图中酶切位点在氨苄青霉素抗性基因上，氨苄青霉素抗性基因破坏，则含重组DNA的细胞能在四
环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长，C正确；
D、图中酶切位点在四环素抗性基因上，由于仅四环素抗性基因破坏，则含重组 DNA的细胞能在氨苄
青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长，D错误。
故选：C。
【分析】
基因表达载体一般包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因．图中 amp为氨苄青霉素抗性基因，
tet为四环素抗性基因，一般这些抗性基因作为基因工程的标记基因，而 ori为复制必需的序列，因此
该基因不能被破坏．
本题难度适中，属于考纲中理解层次的要求，着重考查了基因工程中基因表达载体的构建以及目的基
因的检测与鉴定等相关知识，考生能够理解相关基因的功能，并审清题意即可。
3. 质粒是细菌中的有机分子，下列对其描述，正确的是（ ）
A. 质粒完全水解后最多可产生4种化合物 B. 质粒能够自主复制
C. 质粒中含有两个游离的磷酸基团 D. 质粒是基因工程的工具酶【答案】
B
【解析】解：质粒是一种具有自主复制能力的很小的双链环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，完
全水解后最多可产生6种化合物：脱氧核糖、磷酸、4种含氮的碱基，A、C错误，B正确；质粒是基
因工程的工具--载体，不是工具酶，D错误。
故选：B。
1、常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于
细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。）
2、作为运载体必须具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，
供外源 DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。④是安全的，对受体细胞无害，
而且要易从供体细胞分离出来。
3、天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造
的。
本题考查基因工程的相关知识，重点考查质粒的相关内容，要求考生识记质粒的存在细胞、质粒的化
学本质、质粒作为运载体的条件，能结合所学的知识准确判断各选项。
4. 已知限制性内切酶XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列分别为C↓CCGGG和CCC↓GGG．有关这两种酶及应
用的叙述，错误的是（ ）
A. 这两种酶作用的底物都是双链DNA
B. DNA中出现这两种酶识别序列的几率不同
C. XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是-GGCC
D. 使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等
【答案】
B
【解析】解：A、限制酶作用的底物是双链DNA分子，A正确；
B、这两种限制酶作用的核苷酸序列相同，所以识别序列的机率相同，B错误；
C、根据碱基互补配对原则，CCCGGG的互补链是GGGCCC，并根据XmaⅠ的切割位点可知，切割后
的黏性末端是-GGCC，C正确；
D、温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等，D正确。
故选：B。限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸
之间的磷酸二酯键断裂。
本题考查限制酶相关知识，考查学生对限制酶功能的理解能力。
5. 如图中显示含目的基因的DNA片段、限制性核酸内切酶MunⅠ和EcoRⅠ的识别序列（其中箭头所
指部位为限制性核酸内切酶的切割位点）、四种质粒的阴影部分表示标记基因．适于作为图示目的基
因载体的质粒是（ ）
A. ①④ B. ②③ C. ① D. ③
【答案】
D
【解析】解：①用限制酶MumⅠ切割该质粒后，不会破坏标记基因，但不能识别目的基因两端特定的
碱基序列，所以不适于作为目的基因的运载体，①错误；
②该质粒含有标记基因，但用限制酶EcoRⅠ切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的运载体，②
错误；
③用限制酶EcoRⅠ切割该质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的
末端，适于作为目的基因的运载体，③正确；
④该质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的运载体，④错误．
故选：D．
根据题意和图示分析可知：目的基因两侧都是限制酶 EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切
割含有目的基因的外源 DNA分子．限制酶 MumⅠ和限制酶 EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是-
C↓AATTG-和-G↓AATTC-，可见两者切割后产生的黏性末端相同，用 DNA连接酶可将两者切割后的
DNA连接形成重组DNA分子．
本题结合目的基因和质粒上限制酶的识别序列及切割位点示意图，考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的工具，要求考生识记限制酶的特点及作用结果，掌握运载体必备的条件，能根据图示信
息选择合适的运载体．
6. 为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因
（ACA）与载体（pBI121）结合，然后导入棉花细胞。下列叙述错误的是（ ）
A. 用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因
B. 与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
C. 在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞即为成功转入目的基因的细胞
D. 用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
【答案】
C
【解析】A、由图可知，GNA、ACA都含有限制酶BsaBI的酶切位点，故用限制酶BsaBI和DNA连
接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因，A正确；
B、图中质粒与ACA-GNA上都含有KpnI和XhoI的酶切位点，与只用KpnI相比，KpnI和XhoI处理
融合基因和载体可保证基因转录方向正确，避免反向连接，B正确；
C、由于重组质粒和普通质粒上都含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养
基上不一定能筛选出转化成功的受体细胞，C错误；
D、PCR技术可用于基因探针的制备，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，即用 PCR技术可检测
GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，D正确。
故选：C。
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子、复制原点和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的
方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的
基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的 DNA是否插入目的基
因--DNA分子杂交技术和PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目
的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定
等。
本题考查基因工程和细胞工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各
操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
7. 某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用酶a切割，把得到的产物用酶b切割，得到的
DNA片段大小如表。酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法不正确的是（ ）
a酶切割产物 （bp） b酶切割产物 （bp）
2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；300；200
A. 在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和3个
B. a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C. a酶与b酶切断的化学键都是磷酸二酯键
D. 用a酶切割与线性DNA相同碱基序列的质粒，得到4种切割产物
【答案】
D
【解析】
【分析】
本题结合图表，考查基因工程的原理及技术，重点考查限制酶的相关知识，要求考生识记限制酶的特
点及作用，能比较图中a酶和b酶的识别序列，明确两者切割后产生的黏性末端相同；能分析表中数
据，明确a酶和b酶的识别位点均有3个，再结合所学的知识准确判断各选项。
分析题图：a酶和b酶识别的脱氧核苷酸序列不同，但切割后产生的黏性末端相同。
分析表格：a酶可以把原有DNA切成4段，说明该DNA分子上有3个切口，即a酶的识别序列有3个；
b酶把大小是2100的DNA切成大小分别为1900和200两个片段，把大小是1400的DNA切成大小分
别为800和600两个片段，把大小是500的DNA切成大小分别为300和200两个片段，且a酶和b酶
的识别位点不同，说明b酶的识别序列有3个。【解答】
A、由以上分析可知，在该DNA分子中，a酶和b酶的识别序列分别有3个和3个，A正确。
B、a酶与b酶切出的黏性末端相同，用DNA连接酶可以将它们连接起来，B正确。
C、限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键，C正确。
D、质粒是环状DNA分子，与线性DNA相同碱基序列的质粒含有3个a酶的切割位点，则其被a酶切
割后可以得到3种切割产物，D错误。
故选：D。
8. 用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个1 000bp（1bp即1个碱基对）的DNA分子，
降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如下图所示。该 DNA
分子的酶切图谱（单位：bp）正确的是（ ）
A. B.
C. D.
【答案】
C
【解析】解：A、A选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600bp和200bp两种长度的DNA分子，与
题意不符，A错误；
B、B选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600bp和400bp两种长度的DNA分子，与题意不符，B
错误；
C、C选项中的DNA用KpnⅠ酶切后得到的DNA分子是1000bp，用EcoRⅠ单独酶切得到200bp和
800bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200bp和400bp两种长度的DNA分子，
与题意相符，C正确；D、D选项中的DNA用KpnⅠ酶切后得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，与题意不符，D错误。
故选：C。
用限制性核酸内切酶 KpnⅠ酶切后得到的 DNA分子仍是1000bp，由此可推知该 DNA分子为环状
DNA；用EcoRⅠ单独酶切会得到800bp和200bp两种长度的DNA分子；用EcoRI，KpnⅠ同时酶切后
得到200bp和400bp两种长度的DNA分子知答案C符合要求。
本题结合题图，考查基因工程的原理和技术，尤其是限制酶的相关知识，要求考生识记限制酶的作用，
能根据题干信息分析各选项，选出正确的答案，属于考纲识记和理解层次的考查。对于此类试题，考
生也可以采用代入法解决问题。
9. 下表有关“DNA粗提取和鉴定”的相关操作中所选取的试剂，错误的是（ ）
相关操作 选取的试剂
A 破碎鸡血细胞 蒸馏水
B 溶解核内DNA 2mol/LNaCl溶液
C 提取杂质较少的DNA 冷却的95%的酒精
D DNA的鉴定 双缩脲试剂
A. A B. B C. C D. D
【答案】
D
【解析】
【分析】
本题考查DNA的粗提取和鉴定等相关知识，意在考查学生的识记和理解能力，难度不大。
【解答】
A、在鸡血细胞液中加入蒸馏水，使得血细胞吸水胀破，A正确；
B、2mol/LNaCl溶液能溶解核内DNA，去除不溶解的杂质，B正确；
C、DNA不溶解于酒精，而其它杂质能溶解于酒精，则用体积分数为 95%的冷酒精能提取杂质较少的
DNA，C正确；
D、DNA用二苯胺鉴定成蓝色，双缩脲用来检测蛋白质成紫色，D错误。
故选：D。
10. 下列有关“DNA的粗提取与鉴定”的实验叙述，错误的是（ ）
A. 选择鸡血进行该实验是由于材料易得，核内DNA含量丰富且细胞易吸水破裂
B. DNA的释放和溶解是实验成功与否的关键，调节NaCl溶液浓度利于DNA释放C. 加入木瓜蛋白酶可分解杂质蛋白，使DNA与蛋白质分开，从而提取到较纯化的DNA
D. 用二苯胺试剂鉴定提取的DNA时，沸水浴加热冷却后会出现蓝色
【答案】
B
【解析】
【分析】
本题考查DNA的粗提取与鉴定的相关知识，对于DNA粗提取的实验原理和具体操作步骤的理解和掌
握是本题考查的重点。
【解答】
1.DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯
化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将 DNA溶解或析出，从而
达到分离的目的；①DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可
以将蛋白质和DNA进一步分离；③DNA对于酶、高温和洗涤剂的耐受性，蛋白酶能水解蛋白质，但
是不能水解DNA，蛋白质不能耐受较高温度，DNA能耐受较高温度洗涤剂能瓦解细胞膜，但是对
DNA没有影响；④在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
2.由于鸡血细胞含有细胞核，细胞核中含有丰富的DNA，且鸡血实验材料容易获得，因此提取DNA
时常选用鸡血作为实验材料，将鸡血细胞放入蒸馏水中，鸡血细胞吸水涨破释放出细胞中的DNA。
A.鸡血细胞含有细胞核，细胞核内含有DNA，且鸡血容易获得，因此提取DNA时常选用鸡血作为实
验材料，A正确；
B.用蒸馏水处理鸡血细胞有利于DNA的释放，调节NaCl溶液的浓度有利于DNA的溶解或析出，B错
误；
C.由于蛋白酶能使蛋白质水解，而对DNA没有影响，因此可以用木瓜蛋白酶可分解杂质蛋白，使
DNA与蛋白质分开，从而提取到较纯化的DNA，C正确；
D.用苯胺试剂鉴定提取的DNA时，沸水浴加热冷却后会出现蓝色，D正确。
故选B。
二、填空题
11. 酿酒酵母不能利用木糖制约了利用植物原料生产乙醇的经济效益。木酮糖激酶是木糖转化、利
用的关键酶，为提高酵母细胞中木酮糖激酶的表达量，科研人员将两种启动子与木酮糖激酶基因结合
并导入酿酒酵母细胞，构建能同时利用葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母。如图表示相关研究过程，如表
是几种限制性内切酶的识别序列及切割位点。请回答：限制酶 识别序列和
切割位点
EcoRⅠ G↓AATTC
BamHⅠ G↓GATCC
HindⅢ A↓AGCTT
XhoⅠ C↓TCGAG
NdeⅠ CA↓TATG
SalⅠ G↓TCGAC
（1）重组质粒中终止子的作用是______。表中切割DNA后形成相同黏性末端的限制性内切酶是
______，黏性末端为______。
（2）过程③使用的限制性内切酶是______。过程⑤需先用LiAc处理酿酒酵母细胞，其目的是______，
使细胞处于能吸收环境中DNA的状态。
（3）结合图示分析，进行工程菌筛选时，在含四环素的培养基上长出的菌落不一定是导入重组质粒
的酿酒酵母，这是因为______。
（4）研究人员对筛选得到的两种重组酵母（甲中导入启动子A，乙中导入启动子B）细胞中木酮糖激
酶活力及发酵乙醇得率进行比较（发酵条件：1L15g•L-1的葡萄糖和50g•L-1的木糖培养基中，120h）结
果如表。
木酮糖激酶酶活力 葡萄糖消耗量 木糖消耗量 乙醇得率
重组酿酒酵母
U•mg-1 g•L-1 g•L-1 g/g
重组酿酒酵母甲 0.24 14.59 48.61 0.34
重组酿酒酵母乙 0.56 14.98 49.39 0.39
从木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的结论是启动子A的功能比启动子B______，但本实验中乙醇得率相差不大，其可能的原因是______。
【答案】
（1）使转录终止（或使RNA聚合酶与模板分离）；XhoⅠ与SalⅠ-AGCT（或TCGA-）
（2）EcoRⅠ、BamHⅠ；增大酵母细胞的通透性
（3）普通质粒上有抗四环素基因，导入普通质粒的酵母也能在含四环素的培养基上生长繁殖
（4）弱；实验中发酵时间过长（或培养基中的葡萄糖和木糖含量过少）
【解析】
【分析】
本题结合表格信息，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操
作步骤中需要注意的细节，能结合表中信息准确答题，属于考纲理解层次的考查。
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细
胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微
注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的 DNA是否插入目的基
因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】
（1）重组质粒中终止子的作用是使转录终止；根据表中6种限制酶的识别序列及切割位点可知，它们
形成的黏性末端依次是-AATT、-GATC、-AGCT、-TCGA、-TA、-TCGA，因此切割DNA后形成相同
黏性末端的限制性内切酶是XhoⅠ与SalⅠ，黏性末端为-AGCT（或TCGA-）。
（2）过程①构建的重组DNA的两端含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列，因此过程③使用的限制
性内切酶也是EcoRⅠ、BamHⅠ。过程⑤需先用LiAc处理酿酒酵母细胞，其目的是增大酵母细胞的通透
性，使细胞处于能吸收环境中DNA的状态。
（3）由于普通质粒上有抗四环素基因，导入普通质粒的酵母也能在含四环素的培养基上生长繁殖，
因此进行工程菌筛选时，在含四环素的培养基上长出的菌落不一定是导入重组质粒的酿酒酵母。（4）甲中导入启动子A，乙中导入启动子B，甲中木糖消耗量小于乙，说明启动子A的功能比启动子
B弱，但本实验中乙醇得率相差不大，其可能的原因是实验中发酵时间过长（或培养基中的葡萄糖和
木糖含量过少）。
12. 结核病是由结核分枝杆菌（简称结核菌）引起的致死性疾病，接种卡介苗是预防结核病的有效
手段。近年来，耐药结核病不断出现。我国科研工作者研制出了一种重组耐药卡介苗（ RdrBCG），
即在原有卡介苗的基础上引入Ag85B和Rv2628处两个新的基因，用于辅助治疗耐药结核病。
（1）在重组质粒建构过程中，使用到了限制酶Pstn结合图示所给酶切位点（灰色底色）等信息，设
计重组质粒的制备过程：先将 ______与质粒混合，加入限制酶 ______，再加入DNA连接酶形成重
组质粒Ⅰ，再将重组质粒Ⅰ与 ______混合，加入限制酶 ______，再加入DNA连接酶形成重组质粒。
（2）将野生结核菌接种在含有多种治疗结核病药物的培养基中，最终筛选出了一种耐药菌株作为实
验材料。下列对于该耐药菌获得的过程说明正确的是 ______。（多选）
A.培养基中的药物使结核菌产生耐药性变异
B.培养过程中结核菌的变异结果多样
C.耐药结核菌在培养基环境的选择作用下存活
D.培养基中的药物加剧了结核菌的突变速率
（3）对免疫缺陷小鼠接种RdrBCG，下列实验结果能说明RdrBCG安全性的是 ______。
A.肺部检测到Ag85B、Rv2628稳定表达
B.肺部提取物经培养可见结核菌菌落
C.小鼠未患结核病且存活
D.脾部提取物经培养可见结核菌菌落
（4）为检测RdrBCG是否具有辅助治疗耐药结核病的效果，用耐药结核菌感染的小鼠作为实验对象，
应选择下列 ______。（填写编号）
①接种RdrBCG的小鼠②接种普通卡介苗的小鼠
③药物治疗+接种RdrBCG
④药物治疗+接种普通卡介苗
⑤不作处理的被感染小鼠
⑥药物治疗被感染的小鼠
【答案】
Rv2628 PstⅠ和NdeⅠ Ag85B BamHⅠ和HlindⅢ BC C ③⑤⑥
【解析】解：（1）从图上看，目的基因Ag85B和Rv2628上都有BamH I酶切位点，为了保证两个基
因连接的方向性和顺序，制备重组质粒时先将 Rv2628与质粒混合，加入限制酶PstⅠ和NdeⅠ后，再加
入DNA连接酶形成重组质粒1，再将重组质粒1与Ag85B混合，加入限制酶BamHⅠ和HindⅢ，再加
入DNA连接酶形成图所示的重组质粒。
（2）A、培养基中的药物对结核菌产生的耐药性变异进行了定向选择，进而结核杆菌的变异是自然条
件下产生的，不是药物诱导的，A错误；
B、变异是不定向的，因此，培养过程中结核菌的变异结果多样，B正确；
C、耐药结核菌在添加药物的培养基环境中占据优势，被选择存活，C正确；
D、由于药物的定向选择作用，加剧了结核菌的抗药性基因频率改变的速率，并未加剧突变的速率，
D错误。
故选：BC。
（3）A、肺部检测到Ag85B、Rv2628稳定表达只能说明已经接种成功，不能说明安全性，A错误；
B、肺部提取物和脾部提取物见到结核杆菌菌落，说明已经患病，B错误；
C、小鼠未患结核病且存活说明具有安全性，C正确；
D、脾部提取物经培养可见结核菌菌落，说明疫苗没有起到相应的作用，安全性差，D错误。
故选：C。
（4）为检测RdrBCG是否具有辅助治疗耐药结核病的效果，自变量是是否接种成功RdrBCG，因变量
是是否具有辅助治疗耐药结核病的效果，所以选择的小鼠都应患结核病，三个实验组是：药物治疗
+接种RdrBCG；不作处理的被感染小鼠；药物治疗被感染的小鼠。
故选：③⑤⑥。
故答案为：
（1）Rv2628 PstⅠ和NdeⅠAg85B BamHⅠ和HlindⅢ（2）BC
（3）C
（4）③⑤⑥
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细
胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微
注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基
因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基
因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定
等。
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，
能将教材中的知识结合题中信息进行知识迁移，准确答题。
