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第 6 课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体
三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达
载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步
骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电
泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一 重组 DNA 技术的基本工具
1．基因工程的概念
别名 重组 DNA 技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA 分子 水平
结果 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体
之间转移。
(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)遗传密码的破译。
(5)基因转移载体和 限制酶、 DNA 连接酶和逆转录酶 的发现为DNA的切割、连接以及功能
基因的获得创造了条件。
(6)DNA 体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)PCR 技术的发明。
(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)(2)DNA连接酶
(3)载体
(1)源于选择性必修3 P “旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
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提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P “旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不
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是”)一回事。原因是①DNA连接酶连接的是 两个 DNA 片段 ，而DNA聚合酶是把单个的
脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。② DNA 聚合酶 起作用时需要以一条DNA链为模板，
而 DNA 连接酶 不需要模板。
延伸应用 图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所
以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，
如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列
和切点是 ，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
提示 限制性内切核酸酶Ⅰ：
限制性内切核酸酶Ⅱ：
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示 用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故
使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶
Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。1．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说
法错误的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案 D
解析 HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；
Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识
别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C
正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D错误。
2．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复
制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
答案 D
解析 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布；并不是所有
的质粒上都有限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具；重组质粒进入受体
细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制。
归纳提升 与DNA有关的几种酶的比较考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等
的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR获取和扩增目的基因
a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 DNA 半保留复制 的原理，在体外提供参与DNA复
制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
b．PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的
DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。
c．PCR扩增的过程
d．PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。③通过构建基因文库来获取目的基因。
(1)源于选择性必修3 P “相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠
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道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体。因
此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
(2)源于选择性必修3 P “相关信息”：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
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因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序
列互补配对的短单链核酸。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因
能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
RNA聚合酶识别和
使转录在所需要 翻译的起始信号 翻译的结束信号
功能 结合的部位，驱动
的地方停下来 (编码氨基酸) (不编码氨基酸)
基因转录出mRNA
3.将目的基因导入受体细胞生物种类 植物 动物 微生物
农杆菌转化法、花粉管通
常用方法 显微注射法 Ca 2 ＋ 处理法
道法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
将目的基因插入Ti质粒 将含有目的基因的表
Ca2＋处理细胞→细胞处于
的T－DNA中→农杆菌 达载体提纯→取卵(受
一种能吸收周围环境中
转化过程 →导入植物细胞→整合到 精卵)→显微注射→受
DNA分子的生理状态→
受体细胞的染色体DNA 精卵发育→获得具有
基因表达载体导入
上→表达 新性状的动物
辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此
处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入
目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质
粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条
件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列
有关引物的问题：
(1)什么是引物？
提示 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
(2)PCR技术为什么需要引物？
提示 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。
(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？
提示 目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。
(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是
什么？提示 两种引物之间不能互补配对。
(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获
得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
提示 引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性
结合)。
(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要
消耗多少个引物数？
提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
3．(2023·湖北宜昌高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变
化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮 PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，
第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启
动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变
C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
答案 C
解析 单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B正确；除了第一轮产物作第二轮
PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链
的延伸，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，
通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋
白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
4．下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是( )A．过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B需要用CaCl 处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性
2
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定
答案 D
解析 题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和 DNA连接酶，不需要DNA
聚合酶，A错误；CaCl 处理只是提高农杆菌细胞细胞膜的通透性，B错误；抗植物病毒基
2
因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；转基因抗植物病毒番茄是否培育成
功可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染来进行鉴定，D正确。
归纳提升 (1)PCR技术和DNA复制的比较
(2)PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的
1 3 7 2n－1
DNA分子数
同时含引物A、B
0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
的DNA分子数
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
考点三 DNA 的粗提取与鉴定和 DNA 片段的扩增与电泳鉴
定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
(2)操作流程注意 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA
分子不能形成絮状沉淀。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了 DNA 的热变性 原理。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用
下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓
度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm 的紫外灯下被检
测出来。1．在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？
提示 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等
在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂
后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。(3)在进行操作时，一定要戴好一次性
手套。
2．如何来评价扩增的效果？
提示 观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
5．(2023·江苏苏州高三期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙
述，正确的是( )
A．洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量
B．滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加
C．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化
答案 D
解析 洋葱研磨液要用纱布过滤，A错误；DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒
精中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提纯DNA，但提取量不变，B
错误；向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液有利于去除杂质，加入2 mol/L的NaCl溶液
是溶解粗提取的DNA，C错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用二苯胺
试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热，冷却后再观察颜色变化，D正确。
6．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的
是( )
A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
答案 D
解析 图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为
2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，D错误。
1．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引
物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异
条带的产生，以下措施中有效的是( )
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
答案 D
解析 增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延
长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，
故不能有效减少反应非特异性条带的产生，B、C错误。
2．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
解析 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血
不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要
轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精
溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA
遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
3．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金
属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转
基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR
扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④答案 B
解析 引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物
②扩增的片段既含有启动子，又含有 HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白
(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中
是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基
因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。
4.(2022·江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究
纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体
由 中 心 体 转 变 而 来 ， 中 心 体 在 有 丝 分 裂 中 的 功 能 是
______________________________________
_______________________________________________________________________________
。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X
进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋
白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是_______________________。
PCR扩增时，需在______________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得
扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具
有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒
Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合 ①选择图Ⅱ引物__________；
片段M中有白色的箭头，代表方向) ②PCR目的产物约为__________bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接
处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填
列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别 序列编号)
序列
④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y
－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有
绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说
检测融合蛋白定位
明
_________________________________________
_______________________________
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因
Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经____________形成cDNA作为模板，PCR扩增
结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是
产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产
物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。
答案 (1)磷脂、蛋白质 发出星射线，形成纺锤体 (2)溶解DNA 耐高温DNA聚合酶
(TaqDNA聚合酶) 3′ (3)a、b 1 100 Q3 X蛋白参与中心体的形成 (4)逆转录 32
解析 (2)从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离
出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度
均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在
TaqDNA聚合酶的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图
Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有 EcoR V＋BamH
Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)，Y－M的连接
处测序后部分序列应含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择
序列Q3。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个
细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。(4)
研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的
转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，
在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强
度达到设定阈值时的PCR循环数)，说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数
为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215＝y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个
循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32(倍)。
1．判断关于基因工程的基本工具的叙述
(1)限制酶只能用于切割目的基因( × )
(2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( × )
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( × )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( × )
2．判断关于基因工程的基本操作程序的叙述
(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因( × )
(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( × )
(3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点( × )
(4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应( × )
3．判断关于DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述
(1)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件
下储存( × )
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( × )
(3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( × )
(4)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，遇甲紫会呈现红色( × )
4．填空默写
(1)(选择性必修3 P )基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特
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性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选择性必修3 P )限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中
71
特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)(选择性必修3 P )载体上有特殊的标记基因，便于 重组 DNA 分子的筛选 。
72(4)(选择性必修3 P )PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供 DNA 模板 、 2 种
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引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的 DNA 聚合酶 。
(5)(选择性必修3 P )基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启
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动子、终止子等。
(6)(选择性必修3 P )转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的
81
过程。
课时精练
一、选择题
1．(2023·江苏宿迁高三质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作
用位点。下列叙述错误的是( )
A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在图乙中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
答案 C
解析 甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、
丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA
片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，即图乙中a处，C错误；切割甲的限
制酶的识别序列为 GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组 DNA 分子序列为
GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组 DNA分子，
D正确。
2．T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需
消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片
段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是( )
A．T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B．T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C．ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D．T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
答案 C
解析 T4 DNA连接酶有专一性，A错误；酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，
结合题干信息“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相
连”可推测，ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；T4 DNA连接酶需
在低温和最适pH条件下保存，D错误。
3．(2023·安徽亳州高三检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P 噬菌体载体(图乙)构建重组
1
DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析
错误的是( )
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P 噬菌体载体
1
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P 噬菌体载体
1
C．图乙中的P 噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
1
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P 噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生
1
一种重组DNA
答案 D
解析 P 噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切
1
割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切
割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和
P 噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。
1
4．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
答案 A
解析 目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工
程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，
C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因
的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正
确。
5．(2023·河北石家庄高三模拟)如图是快速RT－PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的
逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述错误的是( )A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力
B．③PCR过程只需要引物b
C．RT－PCR可检测基因表达水平
D．RT－PCR可检测新冠病毒等RNA病毒
答案 B
解析 ③PCR过程需要引物a、b，因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的，也有与
cDNA一致的，B错误。
6．(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B
解析 离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂
呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋
白质，D正确。
7．(2023·江苏泰州高三调研)引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，
下列相关叙述正确的是( )
A．引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高
B．根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等
C．两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合
D．引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
答案 B
解析 退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，变性
时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标 DNA获得
率越低，A错误；根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更
加准确地获得目的基因，B正确；两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至
一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；引物的GC含
量越高，结合特异性越强，但GC含量过高，氢键越多，不利于退火，从而阻碍目标DNA
的扩增，D错误。8．DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原
理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是(
)
A．DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢
B．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测
C．拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽提DNA
片段，从而提高回收率
D．新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染
答案 C
解析 拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再体积分数为用95%的冷酒精
沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率，C错误。
9．(2023·江苏扬州高三质检)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在
PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出
的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而
发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法不正确的是( )
A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体
杂交
答案 C
解析 PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中
的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检
测者极有可能感染了病毒，C错误。
10．(2023·江西南昌高三模拟)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，
将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是( )
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因；TetR：四环素抗性基因。A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
答案 C
解析 为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限
制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含
有目的基因的受体菌进行选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒
的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据题图分析可知，同时用三种限制酶处理图中质
粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，
D正确。
11．(2023·江苏南京师大附中高三调研)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进
入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是
利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是( )
A．重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体
B．载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间
D．培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异
答案 C
解析 培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要
插入重组载体A的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培
养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D
正确。
二、非选择题12．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色
素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、
BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：
项目 pIJ702 pZHZ8
BglⅡ 5.7 kb 6.7 kb
表1
固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL) 0 1 2 5 10
不含质粒的链霉菌生长状况 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ － －
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
表2
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间
的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行
置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由
此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的
理 由 是
____________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子
的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下
可以促进链霉菌完成________________过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入
pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入
pZHZ8的链霉菌的具体方法是_____________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的
__________(填“DNA”或“RNA”)。
答案 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)1.4 pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的
基因置换得到的环状 pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段 (3)转化 (4)5 根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜
色进行挑选 RNA
解析 (2)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基
因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为
6.7－5.7＋0.4＝1.4(kb)。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表
格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最
小浓度应为5 μg/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成
mRNA。
13．(2021·江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签
的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞__________________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序
列，否则将导致__________________。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，
加热到 80 ℃以上再混入酶，然后直接从 94 ℃开始 PCR 扩增。下列叙述正确的有
__________。
A．TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为50～60 ℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然
后降温以促进____________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，
利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒 A－m 仍能被 SmaⅠ 切开，则 SmaⅠ 的酶切位点可能在
_________________________________________________________________________________________
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒 A－m，
然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
。
②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明_____________________
后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
答案 (1)①RNA ②蛋白M上不含tag标签
③BC (2)①黏性末端碱基互补配对 DNA连接 ②基因 m的连接处、基因 m的内部
(3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有 URA3基因，可
以长成菌落 ②融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)
解析 (1)① 以逆转录获得 cDNA 的方式，要先从真菌细胞中提取基因 m 转录出来的
mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的转录产物
mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录
产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。③从题干信息可知，“80 ℃以上再混入酶
然后直接从94 ℃开始PCR扩增”，故TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为94 ℃左右，A
错误；PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低的温度下引物可能
与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物
错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提
高反应的特异性，B正确；DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；
TaqDNA聚合酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高温，D错
误。故选BC。(2)①从图上看，载体A只有一个SmaⅠ的酶切位点，故被SmaⅠ切开后，
载体由环状变为链状DNA，将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的 m混合，用特定
DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互
补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，
完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被SmaⅠ切开的位置已经与基因m相连，原来的
酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒 A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位
点可能在基因m的连接处或基因m内部。(3)①筛选目的菌株的机理：导入了质粒A－m的
目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则
不能存活。②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含 tag标签，位于tag标签上游
的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)。
14．如图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而
AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用
到的组织细胞是________________________________________________________，③过程的
目的是________________________，⑤过程常用____________________________________处
理大肠杆菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的 DNA片段种类有
________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的 DNA片段和四环素
抗性基因的DNA片段分别有______种和________种。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含
AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲
培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生
长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选______________________的大肠杆
菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是
_______________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是
______________________________
_______________________________________________________________________________
。
答案 (1)调控作用 人垂体组织细胞 将平末端处理为黏性末端 Ca2＋ (2)9 3 3 (3)含
四环素抗性基因 完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒) 在丙中能存活，在乙中
不能存活
解析 (2)假设PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示(后面的→均按照
顺时针方向)。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶
分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶
切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、
1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完
整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。
