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第 54 讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的
新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的，因此
又叫作重组DNA技术。
（1）操作的环境：生物体外。
（2）操作的水平：_________________。
（3）操作的技术：_________________。
（4）操作的目的：__________________________________________________________。
（5）(变异的)原理：____________________。
（6）基因工程的意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，_______改造生物的遗传性状。
（7）基因工程的理论基础
二、重组DNA 技术的基本工具
1.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
（1）切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。
（2）来源：主要是从______生物中分离纯化出来的，迄今分离的限制酶有数千种。
（3）特点（专一性）：它们能够识别双链DNA分子的____________________（5’→3’），并且使每一条链中
特定部位的______________断开。
大多数限制酶的识别序列由6个核苷
同尾酶 酸组成。也有少数限制酶的识别序列
（4）限制酶作用的结果：产生_______末端或_______末端。 由4个、8个或其他数量的核苷酸组
成
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是_______末端；
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是_____末端。
（5）在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割_____次此DNA分子，产生_____个末端。只有这样
才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
EcoR I EcoR I
5’ 3’
GAATTC GAATTC
CAATTG 目的基因 CAATTG
3’ 5’（6）同尾酶：指识别序列不相同,但切割后能产生相同黏性末端的限制酶。
例1.已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
①能被限制酶Ⅰ切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶Ⅱ切割;
②能被限制酶Ⅱ切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶Ⅰ切割。
③DNA1被限制酶Ⅰ切割，DNA2被限制酶Ⅱ切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组
DNA片段，该重组DNA片段___________（能/不能/不一定能)被限制酶Ⅰ切割, __________（能/不
能/不一定能）被限制酶Ⅱ切割。
（7）同裂酶：能识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但其切割位点可能相同也可能不同。
如：MboI和Sau3AI都是—↓GATC—；
KpnI是—GGTAC↓C—，ACC65I是—G↓GTACC—。
（8）限制酶名字的由来：是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了 3个字母的略语，以此来
表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株
分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表
示成EcoRⅠ。
2.DNA连接酶—“分子缝合针”
（1）在一个混合体系中，用限制酶切下的DNA片段之间会随机碰撞在一起时，黏性末端之间会自发形成_____，
但不同DNA片段骨架上的缺口无法自动连接。
（2）DNA 连接酶的作用是：将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的
_________。
（3）在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能
只能缝合____________ 能缝合_______和________。(连接_______的效率相对较低)
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_______________
（4）与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链3´端
DNA( 水 解 ) 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
酶
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链
3.基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
（1）在基因工程中，通常是利用_______作为载体，将基因送入细胞。除此以外，还有_______、_________等。（2）质粒是指：_______________________________________________________________________________。
（3）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：
①质粒DNA分子上__________________________________________，供外源DNA片段（基因）插入其
中。
② 携 带 外 源 DNA 片 段 的 质 粒 进 入 受 体 细 胞 后 ，
_____________________________________________________。
③质粒上常有特殊的___________，如抗生素抗性基因、发光基因等，便于重组DNA分子的筛选。
（4）在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
（5）在基因工程常用的三种工具中，质粒是DNA不是酶，工具酶只有2种。
三、基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：
第一步：________________________________；
第二步：________________________________；
第三步：________________________________；
第四步：________________________________。
1.第一步：目的基因的筛选与获取
（1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于__________________或____________________等的基因就是
目的基因，它主要是指_____________的基因。
（2）筛选目的基因的方法
①从相关的______________________________的基因中进行筛选；
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
（3）获得目的基因的方法
①通过构建基因文库来获取目的基因；
②人工合成目的基因（适用于核苷酸序列已知且比较短小的基因）；
③利用PCR 获取和扩增目的基因。
（4）PCR（聚合酶链式反应）
Ⅰ.概念：它是一项______________________________________________________________________________
___________________________________________________________的技术。
Ⅱ.原理：_______________________________________________。
Ⅲ.反应条件：
PCR反应需要在一定的_______________中才能进行，需提供________模板，分别与两条模板链结合的
_____种________，_____种_____________和________________________；同时通过控制________使DNA复制在体外反复进行。
①真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要_______激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加_______。
②引物是 一小段能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 。用于PCR的引物长度通常为20-30
个核苷酸。引物作为新子链的合成起点，只能结合在母链的 3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始
连接脱氧核苷酸。
5’ 3’
③在PCR过程中实际加入的原料不是4中脱氧核苷酸而是4种dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既
3’ 5’
可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
Ⅳ.扩增的过程：
①目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA
聚合酶作用下进行延伸，即将4 种脱氧核苷酸加到引物的3' 端，如此重复循环多次。由于延伸后得到
的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩
增（约为2n，其中n 为扩增循环的次数）。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。
温度 目的
变性
复性
延伸
目的基因
②图解
目的基因
第一轮：
5’ 3’
引物1
引物2
3’ 5’
第二轮：
目的基因
5’ 3’
3’ 5’
第三轮：
目的基因
5’ 3’3’ 5’
第n轮：
DNA总数 含短-短链的 DNA 数(目的基
因)
含长-中链的 DNA 含引物1的DNA数
数
含中-短链的 DNA 含引物2的DNA数
数
Ⅴ.PCR产物的鉴定：
PCR 的产物一般通过 ________________________来鉴定。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与
________________、________________________等有关。凝胶中的DNA分子通过__________，可以在波
长为300nm的___________下被检测出来。
Ⅵ.PCR技术和DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
场所 体外（PCR扩增仪中） 细胞内（主要是细胞核）
解旋方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） 解旋酶、DNA聚合酶
温度条件 在较高的温度下进行，需控制温度 细胞内温和条件
合成对象 DNA片段 DNA分子
相同点 均需要模板（DNA双链）、原料（4种脱氧核苷酸）、能量、酶
Ⅶ.PCR技术包括多种类型，如大引物PCR、重叠延伸PCR等，在基因工程和蛋白质工程中有着重要用途。
2.第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
（1）基因表达载体的作用：①_____________________________________________________________；
②_____________________________________________________________。
（2）基因表达载体的构成：基因表达载体是载体的一种，除目的基因外，它还必须有__________、_________、
_________、复制原点等。（3）名词解释
启动子：位于______分子上，作用是__________________________________________________________。
终止子：位于______分子上，作用是__________________________________________________________。
起始密码子：位于______分子上，作用是 翻译的起始信号 ( 要编码氨基酸 )。
终止密码子：位于______分子上，作用是 翻译的结束信号 ( 正常情况下，不编码氨基酸 )。
复制原点：是载体DNA复制的起始点，若复制原点被破坏，则载体将不能复制。
标记基因：一般是抗生素抗性基因、发光基因等，作用是__________________________________________
____________________________________________________。
（4）基因表达载体的构建过程
首先用一定的________切割载体，使它出现一个切口；
然后用__________________________________切割含
有目的基因的DNA片段；再利用___________将目的
基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重
组DNA分子
Ⅰ.目的基因应插入启动子和终止子之间（要注意方向，不可倒插）。
Ⅱ.将目的基因插入运载体的方法——单酶切和双酶切
例2.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示
抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株,回答下列问题。
①在基因工程的操作中，不宜选用SmaⅠ，原因是SmaⅠ会破坏_______________和_________________。
②在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后_____________________
_________________________________。
③由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片
段和质粒片段，再加入 DNA 连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成
______________连接的环状产物以及____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连
接既可以是正向连接，也可以_____________。后者可能会导致目的基因无法正常表达。
【解析】若用同种限制酶切割目的基因和运载体，加入DNA连接酶后，可能出现多种连接情况。④为避免目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，
例如可选择用___________和__________这两种限制酶。
【解析】若用两种限制酶切割目的基因和运载体，加入DNA连接酶后，③中哪些情况将被排除？
例3.（2016·全国课标卷1，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基
因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，
与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应。用得到的混合物直接转化大肠杆
菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含
有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
①质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________________________（答
出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
②基因工程中，某 些噬 菌体 经改造 后可以作为载体，其 DNA 复制所 需的原料来自于
_____________________。
③如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基
因 的 细 胞 是 不 能 区 分 的 ， 其 原 因 是 _________________________________ ， 并 且 _________ 和
_____________的细胞也是不能区分的，其原因___________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含
有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_________的固体培养基。
3.第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）不同受体细胞的导入方法
生物种类 受体细胞 导入方法
植物细胞 体细胞或受精卵
动物细胞 受精卵微生物细胞 原核细胞
（2）花粉管通道法：①用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间
内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
（3）农杆菌转化法
①转化是指：_______________________________________________________________________________。
② 原 理 ： 农 杆 菌 细 胞 内 含 有 _________ ， 当 它 侵 染 植 物 细 胞 后 ， 能 将
____________________________________转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体
DNA上。将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进
入植物细胞。
③注意：重组Ti质粒是先导入到农杆菌中，再让农杆菌侵染受体细胞，不是直接导入到受体细胞中。
（P ）
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（4）显微注射法：显微注射将目的基因注入动物的_________中，然后发育成为具有新性状的动物。
（5）Ca2+处理法：常用_______生物作为受体细胞。Ca2+的作用是________________________________________，
然后再将重组的基因表达载体导入其中。
4.第四步：目的基因的检测与鉴定
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
PCR、电泳等技术
分子水平 检测目的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质 “抗原—抗体”杂交技术
个体生物学水平 抗虫或抗病接种实验
四、实验：DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理：①DNA不溶于_______，但某些蛋白质溶于_______，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白
质。
②DNA在不同浓度的_______溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的_______溶液。
③在沸水浴下，DNA遇_________试剂会呈现_____色，因此该试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
2.实验步骤3.注意事项：
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器
(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
