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第 1 课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
目标要求 1.基因工程的诞生。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)。3.实验：DNA的
粗提取与鉴定。
考点一 重组 DNA 技术的基本工具
1．基因工程的概念
(1)手段：按照人们的愿望，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫做 DNA 重组 技术。
拓展延伸 基因工程的理论基础
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(也称“限制酶”)(2)DNA连接酶
(3)载体
(1)源于选修3 P “寻根问底”
4
①原核生物中存在限制酶的作用是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识
别序列已经被修饰。
(2)源于选修3 P “寻根问底”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回
6
事。原因是：①DNA连接酶连接的是 两个 DNA 片段 ，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷
酸连接到已有的DNA片段上。② DNA 聚合酶 起作用时需要以一条 DNA链为模板，而
DNA 连接酶 不需要模板。延伸应用 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所
以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，
如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
考向一 限制酶和DNA连接酶
1．(2022·青岛市高三期中)下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位
点，由此推断以下说法中，错误的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案 D
解析 HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A项正确；
Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B项正确；BamHⅠ限制酶
识别 GGATCC 序列，Sau3AⅠ 限制酶识别 GATC 序列，切割后形成相同的黏性末端
GATC，C项正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D项错误。
2．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒
(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导
机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性核酸内切酶的切点分别是 BglⅡ、EcoRⅠ和
Sau3AⅠ。下列分析错误的是( )A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
答案 C
解析 从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中 EcoRⅠ切口
对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C项错误；基因表达包括转录和翻译，
转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D项正确。
考向二 基因工程载体的应用
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
答案 C
4．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案 D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，
A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B
错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错
误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在
受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二 基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(2)获取目的基因的方法
①从基因文库中获取
③用化学方法直接人工合成
归纳总结 (1)PCR技术和DNA复制的比较
(2)几种获取目的基因方法的比较
项目 从基因文库中获取 人工合成
方法 从基因组文库中获取 从cDNA文库中获取 化学合成法 反转录法
供体细胞中的DNA 目的基因的mRNA
↓限制酶 ↓反转录 蛋白质的氨基酸
许多DNA片段 单链DNA 序列
目的基因的
↓插入 ↓合成 ↓推测
mRNA
载体 双链DNA mRNA的核苷
↓反转录
↓导入 ↓插入 酸序列
过程 单链DNA
受体菌群(基因组文库) 载体 ↓推测
↓合成
↓ ↓导入 基因的核苷酸序
双链DNA(即
外源DNA扩增，产生 受体菌群(cDNA文 列
目的基因)
特定性状 库) ↓化学合成
↓分离 ↓分离 目的基因
目的基因 目的基因适用于片段较
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，
小，核苷酸序列 以RNA为模
导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别
说明 已知的目的基 板，需要逆转
含有这种生物的不同的基因，称为基因文
因；利用DNA 录酶
库，包括基因组文库和cDNA文库
合成仪合成
易错提醒 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作
为合成 DNA 子链 的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为 RNA 单链 。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，
一般为RNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 Mg 2 ＋ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添
加 Mg 2 ＋ 。
④PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2 n
含引物A(或B) 的
1 3 7 2 n － 1
DNA分子数
同时含引物A、B的
0＝21－2 2 ＝ 2 2 － 2 6 ＝ 2 3 － 2 2 n － 2
DNA分子数
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因
能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用(3)构建过程
易错提醒 列表比较启动子、终止子、起始密码子、终止密码子
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
RNA聚合酶识别和
使转录在所需要 翻译的起始信号 翻译的结束信号
功能 结合的部位，驱动
的地方停下来 ( 编码氨基酸 ) ( 不编码氨基酸 )
基因转录出mRNA
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
农杆菌转化法、花粉管通
常用方法 显微注射技术 Ca 2 ＋ 处理法
道法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
将目的基因插入Ti质粒 将含有目的基因的表达 Ca2＋处理细胞→细胞
的T－DNA中→农杆菌 载体提纯→取卵(受精 处于一种能吸收周围
转化过程 →导入植物细胞→整合到 卵)→显微注射→受精 环境中DNA分子的
受体细胞的染色体DNA 卵发育→获得具有新性 生理状态→基因表达
上→表达 状的动物 载体导入
辨析 1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
此处“转化”与肺炎双球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
2农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 T － DNA 上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 染色体 DNA 上；第一次导入是将含目的基
因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入非人工操作是指含目的基因的T－DNA导入受
体细胞。
3农杆菌特点
①能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
②农杆菌细胞内含有 Ti 质粒 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到
被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
4．目的基因的检测与鉴定
考向一 目的基因的获取
5．如图表示基因工程中获取目的基因的示意图，下列相关叙述不正确的是( )
A．③表示PCR技术，用来扩增目的基因
B．若获取的目的基因相同，则图中基因组文库小于cDNA文库
C．要从基因文库中得到所需的目的基因可以根据目的基因的相关信息来获取
D．若基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过化学方法直接人工合成获取
答案 B
6．利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，
错误的是( )
A．PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B．变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶
C．复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D．延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
答案 D
考向二 基因工程的基本操作程序
7．(2022·山东高三联考)戊型肝炎病毒是一种 RNA 病毒，ORF2 基因编码的结构蛋白
(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中
表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是( )
A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒
C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理
状态
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
答案 D
解析 戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的
基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A项错误；启动子是一段有特
殊结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子
具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达 pORF2蛋白的载体时，需要选择
大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B项错误；将目的基因
导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的
透过性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C项错误。
8．某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和
抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是
____________________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________________。该方
法中农杆菌的作用是__________________________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和
SalⅠ两种酶的好处是
______________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素
的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。
为什么？____________________________________________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种
到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄
青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状
况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出
来。
答案 (1)Ti质粒 T－DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率 (3)否 含
有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)如图所示科学思维 载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关
抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，
使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保
留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
考点三 DNA 的粗提取与鉴定
1．基本原理
(1)DNA的粗提取
①原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，
去除其他成分。
②DNA与蛋白质在物理和化学性质方面的差异
比较项目 DNA 蛋白质
2 mol·L－1
溶解 析出
NaCl溶液中
溶解性 0.14 mol·L－1
析出 溶解
NaCl溶液中
酒精溶液中 析出 溶解
蛋白酶 无影响 水解
耐受性 不能忍受 60 ～ 80 ℃的高
高温 80 ℃以上变性
温(2)DNA的鉴定：DNA＋二苯胺―――→蓝色。
2．操作流程
易错提醒
(1)DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
实验操作 实验操作的目的
加蒸馏水 ①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的
2次 NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl
用纱布过
溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液
滤4次
中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl
用NaCl
溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④
溶液4次
用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
(2)注意事项
①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核
(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
②加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。
加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不
能形成絮状沉淀。
③二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
④提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐
(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
⑤在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出
DNA。考向 DNA的粗提取与鉴定
9．下图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是(
)
A．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持结构完整
C．若图③操作后接图②操作，则DNA会留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA会留在纱布上
答案 B
10．(2022·贵州遵义联考)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，
下列相关叙述正确的是( )
A．图1中溶液a是物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
答案 B
解析 图1中溶液a是NaCl溶液，其目的是溶解DNA，DNA在物质的量浓度为2 mol/L的
NaCl溶液中的溶解度较高，在物质的量浓度为 0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，A
错误；图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2
中蓝色变化不明显，B正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质
能溶，C错误；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺出现蓝色，D错误。
重温高考 真题演练
1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
解析 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血
不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要
轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精
溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA
遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
2．(2021·全国甲，38)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原
菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用
PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，
其中复性的结果是______________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指_______________________________________________。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
答案 (1)④②③① (2)Taq酶(热稳定DNA聚合酶) 延伸 引物通过碱基互补配对与两条
单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
解析 (1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序
应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段
→①分析PCR扩增结果。
(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA
特异性结合。
3．(2019·全国Ⅰ，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括
____________________和______________。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用
PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解链为单链的条件是
________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在 PCR 反应中使用 Taq 酶而不使用大肠杆菌 DNA 聚合酶的主要原因是
______________________________________________________________________________。
答案 (1)基因组文库 cDNA文库
(2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
4．(2018·全国Ⅰ，38)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细
胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了____________________
_______________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌
体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA
导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防
止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的
过程中应添加________的抑制剂。
答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化
外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
5．(2021·全国乙，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类
需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点
如图所示。
回答下列问题：
(1) 常 用 的 DNA 连 接 酶 有 E·coli DNA 连 接 酶 和 T DNA 连 接 酶 。 上 图 中
4
____________________酶切割后的 DNA 片段可以用 E·coli DNA 连接酶连接。上图中
__________________酶切割后的DNA片段可以用T DNA连接酶连接。
4
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是______________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒 DNA分子上有复制原点，可以
保 证 质 粒 在 受 体 细 胞 中 能 ______________ ； 质 粒 DNA 分 子 上 有
_________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗
生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________。答案 (1)EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ
(2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该种抗生素的培养基培
养宿主细胞，能存活的细胞含有质粒载体 (4)一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首
端，是RNA聚合酶识别和结合的部位
一、易错辨析
1．限制酶也可以识别和切割RNA( × )
2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( × )
3．E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
4．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( √ )
5．提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替( × )
二、填空默写
1．(选修3 P )基因工程： 按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基
1
因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2．(选修3 P )限制酶的作用是 能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一
4
条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．(选修3 P )DNA连接酶的作用是 将双链 DNA 片段 “ 缝合 ” 起来，恢复被限制酶切开的两
5
个核苷酸之间的磷酸二酯键。
4．(选修3 P )质粒： 一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA 之外，并具有自我复制
6
能力的很小的双链环状 DNA 分子 。
5．(选修3 P )载体上有特殊的标记基因，作用是 供重组 DNA 的鉴定和选择 。
6
6．(选修3 P )目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
9
7．(选修3 P )基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有 启动子 、
11
终止子等。
8．(选修3 P )启动子是 一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端，它是 RNA 聚合酶
11
识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA ，最终获得所需要的蛋白质。
9．(选修3 P )终止子位于基因的尾端，是 一段有特殊结构的 DNA 短片段 ，终止子相当于一
11
盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。
10．(选修3 P )将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，将目的基因插入
12
到 Ti 质粒的 T － DNA 上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将
其插入到 植物细胞中染色体的 DNA 上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
11．(选修3 P )将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射技术。
13
12．(选修3 P )将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是 Ca 2 ＋ 处理法 ，首先用 Ca 2 ＋ 处理
13细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子 的生理状态，这种细胞称为感受态细胞，
第二步是将 重组表达载体 DNA 分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进
感受态细胞吸收 DNA 分子 ，完成转化过程。
课时精练
一、选择题
1．若要利用某目的基因(见图甲)和P 噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核
1
酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下
列分析合理的是( )
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P 噬菌体载体
1
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P 噬菌体载体
1
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P 噬菌体载体
1
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P 噬菌体载体
1
答案 D
解析 解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用 EcoRⅠ和Sau3AⅠ切
割目的基因和P 噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动
1
方向才一定与图丙相同。
2．农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的载体，下列相关叙述正确的是( )
A．Ti质粒是能够自主复制的单链DNA
B．Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接
C．重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞
D．Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上
答案 B
3．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物
为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( )A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
答案 D
解析 用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一
序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过
碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA
单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第
四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA
分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产
物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。
4．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验原理的叙述，正确的是( )
A．利用DNA能溶于酒精溶液，而蛋白质不溶于酒精溶液的特点，可将DNA与蛋白质分离
B．利用85 ℃的高温能使蛋白质变性却对DNA没有影响的特性，将DNA与蛋白质分离
C．利用DNA在2 mol·L－1NaCl溶液中溶解度最大的特点，可将DNA与杂质分离
D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离
答案 D
5．科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。下图
表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表
示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确
的是( )
A．目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中
B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcoRⅠ和PstⅠC．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素
D．可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达
答案 D
解析 农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的
DNA上，根据这一特点，将目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色
体中，A正确；应选用EcoRⅠ和PstⅠ切割质粒，氨苄青霉素抗性基因被破坏，故成功导
入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素，C正确；检测目的基因是否表达应
检测是否成功产生蛋白质，可用抗原—抗体杂交技术，D错误。
6．科学家将苏云金芽孢杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞，鉴
定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株
并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析错误的是
( )
A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，
则可能是抗虫基因表达效率低
B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的RNA，
若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译
C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中
的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中
D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞
答案 D
解析 抗原、抗体能特异性结合，可提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行
检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因能表达。但棉花植株并无抗虫性状，则可能
是抗虫基因表达效率低，合成的Bt抗虫蛋白太少，A正确；核酸分子杂交技术的原理是碱
基互补配对，检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，说明抗虫基因能转录，细
胞中无Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因不能正常翻译，导致棉花植株并无抗虫性状，B正确；
核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，而抗虫基因又不能表达，则
可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中，C正确；由题干信息“鉴定后，将含抗虫基因
的受体细胞组织培养获得棉花植株”可知，导入受体细胞的是重组DNA分子，D错误。
二、非选择题
7．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色
素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、
BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：表1
pIJ702 pZHZ8
BglⅡ 5.7 kb 6.7 kb
表2
固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL) 0 1 2 5 10
不含质粒的链霉菌生长状况 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ － －
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间
的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行
置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由
此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的
理由是__________________________________________________________________________。
(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子
的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下
可以促进链霉菌完成________________________________________________________过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入
pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入
pZHZ8的链霉菌的具体方法是___________________________________________________。
若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的
____________(填“DNA”或“RNA”)。
答案 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)1.4 pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的
基因置换得到的环状 pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段 (3)转化 (4)5 根据导入
pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜
色进行挑选 RNA
解析 (2)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基
因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为
6.7－5.7＋0.4＝1.4 kb。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表
格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最
小浓度应为5 μg/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成
mRNA。
8．(2022·济南联考)下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的
pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末
端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相
关问题：(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用
到的组织细胞是________________，③过程的目的是________________________，⑤过程常
用________处理大肠杆菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有
________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素
抗性基因的DNA片段分别有______种和___________________________________________
种。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含
AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲
培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生
长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选____________________的大肠杆菌；
接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是
__________________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是
____________________________。
答案 (1)调控作用 人垂体组织细胞 将平末端处理为黏性末端 Ca2＋ (2)9 3 3 (3)含
四环素抗性基因 完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒) 在丙中能存活，在乙中
不能存活
解析 (2)(后面的→均按照顺时针方向)假设PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用
1、2、3表示。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶
分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶
切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、
1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完
整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。
9．我国科学家将甲型肝炎病毒V区抗原基因和丙型肝炎病毒C区抗原基因以融合基因的方
式导入光致死突变体(pet基因缺失导致光照致死)衣藻的叶绿体基因组中，融合蛋白得到了
高效表达，且具有双价抗原活性。回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，应当在甲型肝炎病毒V区和丙型肝炎病毒C区融合基因的首段插入启动子序列，便于其被________识别并发生特异性结合，应当选择____________作为标记
基因。培养pet基因缺失突变体的受体衣藻时，应给予____________以筛选成功导入重组质
粒的衣藻细胞。
(2)科学家将基因表达载体包裹在金属颗粒表面后再打入受体衣藻细胞，这种基因导入方法
称为________。将目的基因导入叶绿体，一般不采用农杆菌转化法，原因是
______________________________________________________________________________。
(3)衣藻细胞含有丰富的叶绿体，而每个叶绿体中含有大量的DNA分子，从这个角度分析，
叶绿体基因工程的优势在于____________________，另外叶绿体基因工程还可以避免如花粉
等的基因污染，其原因是________________________________________________________。
答案 (1)RNA聚合酶 pet 基因 光照
(2)基因枪法 农杆菌转化法会将目的基因整合到受体细胞染色体的 DNA上，而不进入叶绿
体 (3)可以实现基因工程产物的大量生产 叶绿体的基因不会进入花粉，从而避免了重组
基因的扩散
10．农杆菌是—种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而
对大多数单子叶植物没有感染能力。植物基因工程中常用含有重组 Ti 质粒的农杆菌和受体
植物细胞的愈伤组织共培养，进行转基因操作。现有一段抗除草剂基因编码蛋白质的区域在
克隆载体上，要将其转入烟草细胞，得到抗除草剂的转基因烟草。
(1)在构建表达载体的过程中，要先用限制酶对目的基因和 Ti质粒进行切割，之后用DNA
连接酶连接形成重组质粒。科学家使用了两种不同的限制酶分别切割目的基因和 Ti 质粒，
原因是防止质粒自身环化，并保证________________________________。
(2)在以上重组质粒中，目的基因和抗卡那霉素抗性基因，都应该位于________片段内，因
为________。
(3)将重组的 Ti 质粒转入农杆菌可用________处理。得到的农杆菌菌液和烟草细胞愈伤组
织共培养一段时间后，将愈伤组织置于含有________和除草剂的选择培养基上进行组织培养，
通过调整____________________________，使其脱分化、再分化形成转基因植株群体 P。
(4)转入的除草剂抗性基因的遗传符合孟德尔遗传规律，且不考虑突变的情况下，让转基因
植株 P 自交，F 株系分隔种植，得到的 F 株系植株用除草剂处理，其中大多数株系抗性和
1 1
非抗性的比例为 3∶1。有极少数株系不发生性状分离，全是除草剂抗性植株，原因可能是
_____________________________________________________________________________。
答案 (1)目的基因以正确的方向与 Ti质粒进行连接 (2)T－DNA Ti质粒上只有 T－DNA
片段能够整合到受体细胞的染色体 DNA 上 (3)Ca2＋ 卡那霉素 生长素和细胞分裂素(植
物激素)的比例 (4)有两个基因分别转入一对同源染色体上
解析 (4)根据后代中大多数株系抗性和非抗性的比例为3∶1可知，转入的除草剂抗性基因
位于一条染色体上。如果两个基因分别转入到一对同源染色体上，则该植株产生的所有配子
都具有除草剂抗性基因，自交后代不发生性状分离，全是除草剂抗性植株。因此有极少数株
系不发生性状分离，全是除草剂抗性植株，原因可能是有两个基因分别转入一对同源染色体上。
11．下面为“DNA的粗提取与鉴定”实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实
验的问题：
(1)正确的操作顺序是_______________________________________(用图中字母和箭头表示)。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是________________和
______________。
(3)图A步骤中所用酒精必须经过__________才能使用，该步骤的目的是________________。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可滴加________试剂，沸水浴加热5
min，如果出现____________，则该丝状物的主要成分为DNA。
答案 (1)C→B→E→D→A (2)使鸡血细胞吸水涨破 降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出
(3)充分冷却 提取含杂质少(或较纯净)的DNA (4)二苯胺 蓝色
