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[高中生物一轮复习教学讲义 选修3]
第 27 讲 基因工程
考点一 基因工程的3种基本工具
1．基因工程的概念：指按照人类的意愿，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物
新的遗传特性，从而创造出更符合人类需要的新的生物类型和生物产品。(外源基因在受体表达的原因三点：
DNA结构相同；中心法则；密码子)
2．限制性核酸内切酶(限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源及化学本质：主要是从原核生物中分离纯化出来的，化学本质是蛋白质。(原核生物中的限制
酶：没有切割为点或者有切割位点但是被保护起来了 甲基化)
(2)功能：催化DNA中特定的磷酸二酯键断裂。
(3)作用特点：特异性，即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列，切割特定的位点。(回文序列)
(4)结果：产生黏性末端或平末端。(如图所示)。(命名：生物属名的头一个字母与种名的头两个字母什
么型菌的第几个限制酶)
3．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)种类：E.coli DNA连接酶和T DNA连接酶。
4
(2)作用：将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。E·coliDNA连
接酶只能连接黏性末端；TDNA连接酶能连接黏性末端和平末端
4
4．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)类型
(2)具备条件：①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有一个至多个限制酶的切割位点，以便于与
外源基因连接；③具有标记基因，用于重组DNA的检测和鉴定；
(3)特点：可以在细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上随染色体DNA进行同步复制。①所有的运载体都具有容易侵入受体细胞的特点，并且能够复制。
②天然质粒必须经过人工改造后才能作为载体。
③基因工程中的载体与细胞膜上参与物质运输的载体不同。基因工程中的载体通常是质粒，还有λ噬
菌体的衍生物、动植物病毒等，其本质是DNA，能将目的基因导入受体细胞内；细胞膜上的载体是蛋白质，
与细胞膜的功能有关。
5．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较
名称 作用部位 作用底物 形成产物
带黏性末端或平末
限制酶 磷酸二酯键 DNA分子
端的DNA片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 重组DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 子代DNA分子
热稳定DNA聚合
磷酸二酯键 脱氧核苷酸 子代DNA分子
酶
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA分子 游离的脱氧核苷酸
碱基对间的
解旋酶 DNA分子 脱氧核苷酸长链
氢键
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 单链RNA分子
考点二 基因工程的操作流程
1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因(与生物抗逆性相关、与优良品质相关、与生物药物和保健品
相关、与毒物降解相关)，也可以是具有调控作用的因子。
(2)获取方法：直接分离，从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因文库中获取目的基因。
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种之间的基因交流 可以 部分基因可以
基因文库的构建过程
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步
说明 骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简
便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
人工合成目的基因：常用的方法有化学合成法、反转录法、PCR扩增法。①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需
要模板。
②反转录法：从供体细胞中分离出mRNA单链DNA合成目的基因。
(3)利用PCR技术扩增
PCR的反应过程及结果
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
基因表达载体的组成 一般构建过程
受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因
导入受体的方法不同，表达载体的构建也会有所差别
3．将目的基因导入受体细胞
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达其遗传特性的过程。
(2)常用的转化方法及其过程
植物细胞 动物细胞 微生物细胞
农杆菌转化法、基因枪法、花 显微注射 感受态细胞法(用Ca2
常用方法
粉管通道法 技术 ＋处理)
受体细胞 受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞①将目的基因导入植物细胞
植物分类 双子叶植物、裸子植物 单子叶植物 转基因抗虫棉花
农杆菌转化法(导入植物 基因枪法
常用方法 花粉管通道法
细胞采用最多的方法)
是我国科学家独创
将目的基因插入到Ti质 基因枪法基因枪法
的一种方法。花粉
粒的T—DNA上→导入 （particle gun）又称微弹
管通道法就是在植
农杆菌→植物伤口分泌酚 表击法，是利用压缩气体
物受粉后，花粉形
类化合物吸引农杆菌侵染 产生的动力，将包裹在金
成的花粉管还未愈
植物细胞→Ti质粒的T- 属颗粒表面的表达载体
合前，剪去柱头；
DNA转移至受体细胞并 DNA打入受体细胞中，使
转化过程 然后，滴加DNA
整合到受体细胞的染色体 目的基因与其整合并表达
（含目的基因）使
DNA上→表达。这种方 的方法。常用的金属颗粒
目的基因借助花粉
法比较经济和有效，迄今 有钨粉粒子和金粉粒子。
管通道进入受体细
为止，约80%的转基因植 这是单子叶植物中常用的
胞。花粉管通道法
物都是通过这种方法获得 一种基因转化方法，但是
是一种十分简便经
的。 成本较高。
济的方法。
4．目的基因的检测与鉴定
5．基因工程的应用
(1)植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱
等），以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
(2)动物基因工程用于提高动物生长速度、改善畜产品的品质、用转基因动物生产药物、用转基因动物
作器官移植的供体。
科学家将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入
哺乳动物的受精卵中，然后，将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期
后，可以通过分泌的乳汁来生产所需要的药品，因而称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学
家已在牛和山羊等动物乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重
要医药产品。
(3)基因工程药物：构建转基因工程菌，通过发酵获得。（胰岛素、干扰素）
(4)基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥作用。（并非全身细胞，而
只是某些功能细胞中）6．蛋白质工程
(1)概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或
基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。蛋白质工程
是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
(2)蛋白质工程的基本途径：预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找
出相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。1．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和
部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位
点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题。
(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由__________连接。
(2)若用限制酶 Sma Ⅰ 完全切割图 1 中 DNA 片段，产生的末端是________末端，其产物长度为
__________________________________。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离
出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制
酶是____________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加
________________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因 D不能正确
表达，其最可能的原因是______________。
2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点
相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因
片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，
常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。
(3)若BamH Ⅰ酶切的DNA末端与Bcl Ⅰ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，
对于该部位，这两种酶________(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3A Ⅰ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
3．B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基
因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________(单选)。
A．含B基因的染色体缺失
B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变
D．B基因的启动子无法启动转录
(2)从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将
该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白
质各自的功能)，然后构建重组表达载体。
(3)在过程①、②转化筛选时，过程________中 T－DNA 整合到受体细胞染色体 DNA 上，过程
________在培养基中应加入卡那霉素。
(4)获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________(多选)。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵
细 胞 发 育 形 成 的 ， 而 一 般 情 况 下 水 稻 卵 细 胞 在 未 受 精 时 不 进 行 发 育 ， 由 此 表 明
______________________________________________。4．科学家将人的生长激素基因与pBR322质粒进行重组，得到的重组质粒导入牛的受精卵，使其发育为转
基因牛，再通过细胞工程培育为转基因克隆牛。pBR322质粒含有两个抗生素抗性基因和5个限制酶切点
(如图2)。将重组质粒导入大肠杆菌，并成功地在大肠杆菌中得以表达。请据图回答问题：
(1)图1中显示的人的生长激素基因是通过人工合成的，图中①过程需要的酶是________；与②过程比
较，①过程所特有的碱基配对方式是________(用字母和箭头表示)。
(2)图1中的mRNA是从人体的________细胞中获取。
(3)重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的 DNA分子导入大肠杆菌，通过含抗生素
的培养基进行培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况进行判断，如图3所示：
①如果受体菌在培养基A上能生长、繁殖形成菌落，而不能在培养基B上生长、繁殖，则使用限制酶
a的切点是图2中的____________，即目的基因插入了____________中。
②如果受体菌在培养基A上不能生长、繁殖形成菌落，而在培养基B上能生长、繁殖，则使用限制酶
a的切点是图2中的________，即目的基因插入了________中。
③如果受体菌在培养基A和培养基B上都能生长、繁殖形成菌落，则使用限制酶a的切点是图2中的
________。
5．随着现代科技的发展，基因工程获得了广泛应用，请回答下列问题：
(1)从基因文库中提取的目的基因需要通过PCR技术进行扩增，利用PCR技术扩增目的基因的原理是
________________。PCR技术扩增目的基因的过程：变性→________________，该过程中需使用一种特殊
的酶是____________________。
(2)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代；同时，
_________________________________________________。
(3)若将目的基因转入大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是
_____________________________________________________________________。(4)我国科学家已培育出转基因抗虫棉，但由于抗虫基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，有时候
会出现一些意想不到的结果，因此，需检测抗虫棉的抗虫特性，可通过____________________(方法)在分
子水平上进行检测，有时还需要进行个体生物学水平的检测，在个体水平的检测鉴定过程可简述为
___________________________________________
__________________________________________________________________。
6．中国女科学家屠呦呦获2015年诺贝尔生理学或医学奖，她研制的抗疟药青蒿素挽救了数百万人的生命。
研究人员已经弄清了青蒿细胞中青蒿素的合成途径(如图中实线方框内所示)，并且发现酵母细胞也能够产
生合成青蒿酸的中间产物FPP(如图中虚线方框内所示)。
(1)根据图示代谢过程，科学家在培育能产生青蒿素的酵母细胞过程中，需要向酵母细胞中导入
________基因。此过程构建的基因表达载体应该含有________识别和结合的部位，以驱动目的基因的转录，
该部位称为启动子。
(2)实验发现，酵母菌细胞导入相关基因后，这些基因能正常表达，但酵母菌合成的青蒿素仍很少，根
据图解分析原因可能是FPP还用于合成________，为提高酵母菌合成的青蒿素的产量，可通过________工
程降低________酶的活性。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是：从预期蛋白质功能出发→设计预期的
________→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的________序列。要对蛋白质的结构进行设计改造，最终
还必须通过改造________来完成。
7．如图为三种质粒和一个含目的基因的DNA片段，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基
因，lacZ为蓝色显色基因，EcoR Ⅰ(0.7 kb)、Pvu Ⅰ(0.8 kb)等为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。
已知1 kb＝1 000个碱基对，请回答下列问题：
(1)片段D为目的基因中的某一片段，则DNA聚合酶和DNA连接酶的作用部位依次是________(填数
字)。(2)图中能作为目的基因运载体最理想的质粒是________(填“A”“B”或“C”)，请据图分析，其他两种
质粒一般不能作为运载体的理由分别是____________、____________。
(3)用EcoR Ⅰ完全酶切目的基因和质粒B形成的重组质粒，并进行电泳观察，可出现长度分别为1.1 kb
和________kb的两个片段，或者长度分别为________kb的两个片段。(重组质粒上目的基因的插入位点与
EcoR Ⅰ的识别位点之间的碱基对忽略不计)
(4)将分别用限制酶Pvu Ⅰ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，进行大肠
杆菌受体细胞导入操作，之后，受体细胞的类型(对抗生素表现出抗性R或敏感性S，蓝白代表菌落颜色)
包含________(多选)。
A．ApR、蓝色 B．ApR、白色 C．ApS、蓝色 D．ApS、白色
(5)动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是________。
A．受精卵能使目的基因高效表达
B．受精卵可发育成动物个体
C．受精卵基因组更易接受DNA的插入
D．受精卵体积较大，便于DNA导入操作
8．胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利
用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β半乳糖苷酶与胰岛素A、B链
融合的蛋白)。请回答下列问题：
图1
图2
(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是__________。
(2)图1中启动子是________酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性
基因的作用是________。
(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有________。
(4)β半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其
意义在于________。
(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的 A链或B
链，且β半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为________________。(6)根据图 2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是
________，理由是____________________________________________________。
9．嗜热土壤芽孢杆菌产生的β－葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶。为使其在工业生产中更好地应用，
开展了以下试验。如图为质粒限制酶酶切图谱，下表为几种限制酶的识别序列及酶切位点。请回答下列问
题：
限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ Nde Ⅰ
识别序列及
G↓GATCC A↓AGCTT G↓AATTC C↓ATATG
切割位点
(1)通常情况下，获得的目的基因需要进行扩增，最简便的方法是________技术。
(2)分析上图，可选择________和________两种不同的限制酶切割质粒，以防止质粒自身环化。质粒被
切割后，可用________将其与目的基因连接。在动物基因工程中将目的基因导入受体细胞时通常的方法是
________。
(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为
____________________________________________________________________________________________
________________。
(4) 蛋 白 质 工 程 是 第 二 代 基 因 工 程 ， 它 的 基 本 途 径 是 ： 从 预 期 的 蛋 白 质 功 能 出 发
→________→________→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
10．七岁的哈桑因LAMB3基因突变而患有交界型大疱性表皮松解症，他的皮肤变得像纸一样脆弱，轻微
磕碰就会受伤且伤口难以愈合，该病同时还伴有多种炎症，时刻威胁着他的生命。科学家通过基因治疗对
其皮肤进行改造拯救了哈桑，治疗过程如图所示。请回答下列问题：(1)该基因治疗中的目的基因是____________________，可以根据该基因的____________________设计
引 物 ， 利 用 PCR 技 术 扩 增 目 的 基 因 片 段 ， PCR 技 术 中 使 用 的 酶 为
______________________________________________________________________。
(2)逆转录病毒在宿主细胞中能够合成“整合酶”，它能切开 DNA双链的特定区域，便于目的基因与
宿主DNA整合。整合酶的作用类似于基因工程工具中的____________。逆转录病毒一般只感染处于
________状态的细胞，以便其将相应的遗传信息整合到宿主DNA上。
(3) 过 程 ③ 中 ， 培 养 箱 中 通 常 要 维 持 一 定 的 CO 浓 度 ， CO 的 作 用 是
2 2
________________________________________________________________。基因治疗过程中，最大的风险
是可能导致癌症，原因是______________________________。
